象耳豆根结线虫Hsp70基因的克隆与原核表达

采用RT-PCR、c DNA末端快速扩增法(RACE),克隆了象耳豆根结线虫Hsp70基因的全长c DNA(Me Hsp70)序列。Me Hsp70 c DNA全长2 203 bp,含有1 959 bp的开放阅读框,编码653个氨基酸,相对分子量为71.09 k Da,具有3段Hsp70家族的签名序列,Gen Bank登录号KF739434。同源性分析表明,氨基酸序列与其他真核生物的Hsp70序列具有很高的相似性。该Hsp70与其他物种中的Hsp70进行系统进化分析,结果显示,Hsp70的系统发育树不能体现物种间的亲缘关系,推测其反映的是不同物种间Hsp70生物学功能的相似性程度。构建了一个原核表达载体p EASY-E1-Me Hsp70,当IPTG终浓度为0.4~1.0 mmol/L时,能诱导表达融合蛋白。Me Hsp70基因的克隆和表达,将为象耳豆根结线虫的生态适应性机理研究提供依据。     

松材线虫fem-1基因的克隆与表达特性研究

 松材线虫病是世界性的检疫病害,严重威胁松林等森林资源和生态安全。有研究表明,Feminization(fem)基因家族在秀丽隐杆线虫中参与性别决定和分化。本研究克隆了松材线虫fem-1基因,并对其表达特征和调控功能进行研究。结果表明,该基因cDNA全长为856 bp,包含681 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸,进化分析显示与秀丽隐杆线虫位于同一进化分支。荧光定量PCR以及原位杂交结果显示, fem-1基因在松材线虫各个发育阶段均有表达,其中在2龄虫期表达水平最高;在卵期至3龄虫期阶段于虫体中后部表达,而发育后期,多位于皮下细胞中表达,肠道、性腺等部位极少出现杂交反应。利用RNA干扰技术沉默fem-1基因后,线虫种群雌雄比例出现下降,说明fem-1基因可能参与松材线虫性别分化和决定过程。研究结果有助于了解松材线虫性别决定相关基因表达特性与功能,为深入研究松材线虫发育生物学提供一定的理论依据。     

低剂量杀线虫剂对马铃薯腐烂茎线虫三个热激蛋白70 mRNA表达的影响

为了解马铃薯腐烂茎线虫Ditylenchus destructor对低剂量杀线虫剂胁迫的适应机制,采用RTPCR和RACE技术克隆了3个热激蛋白70基因Dd-hsp70-A(KF792307)、Dd-hsp70-C(JQ422276)和Dd-hsp70-F(JQ422277),并利用实时荧光定量PCR分别检测了33℃热激及低剂量(10、1、0.1、0.01和0.001μg/m L)杀线虫剂阿维菌素、丙溴磷和涕灭威处理对3个Dd-hsp70基因mRNA表达量的影响。结果表明,3个Dd-hsp70基因在翻译区均含有内含子,编码的氨基酸序列均包含了完整的保守结构域和3段保守的HSP70家族签名序列,且在氨基酸C末端具有保守的亚细胞定位基序。33℃热激3、6 h及0.1μg/m L涕灭威浸渍处理24 h,马铃薯腐烂茎线虫Dd-hsp70-A基因mRNA表达量分别比对照显著上调1.865、4.127和1.634倍;其它处理的mRNA表达量与对照差异均不显著。证实了Dd-hsp70-A、Dd-hsp70-C和Dd-hsp70-F基因均为组成型,其中Dd-hsp70-A基因的响应在植物线虫应对低剂量杀线虫剂胁迫过程中具有重要作用。     

烟蚜热激蛋白Hsp90基因的克隆及在UV-B胁迫下的表达分析

为探讨UV-B胁迫对烟蚜Myzus persicae热激蛋白Hsp90基因表达量的影响,采用RT-PCR与RACE技术克隆了烟蚜热激蛋白Hsp90基因的全长,并对其进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR技术研究了烟蚜Hsp90基因在不同时长UV-B胁迫下的表达量变化。结果表明,烟蚜Hsp90基因的cDNA全长为2 670 bp,编码728个氨基酸,编码蛋白质的相对分子量为82.6 kD,等电点为4.95,获得的氨基酸序列具有Hsp90蛋白家族的1个签名序列及C末端MEEVD基序,推测其属于胞质型热激蛋白。系统进化树结果显示,烟蚜Hsp90与其它昆虫Hsp90具有很高的相似性。实时荧光定量PCR结果表明,不同时长UV-B胁迫下烟蚜Hsp90均有表达,随着照射时间延长,Hsp90表达量表现为先上升后下降的趋势;与对照相比,照射时间为15、30、60、90和120 min时,Hsp90表达量均显著升高,且在60 min时Hsp90表达量达最大,是对照组的2.05倍。表明Hsp90基因在不同时长UV-B胁迫下差异表达,在烟蚜适应紫外胁迫的分子机制中具有重要作用。     

禾谷缢管蚜热激蛋白Hsp90基因的克隆和表达分析

为探讨高温驯化对禾谷缢管蚜Rhopalosiphum padi Hsp90基因表达量的影响,以及其在不同发育阶段的表达,通过RT-PCR与RACE技术克隆了热激蛋白Hsp90基因的全长,命名为Rp Hsp90,采用生物信息方法分析了其序列特征,利用实时荧光定量PCR技术研究了Rp Hsp90在禾谷缢管蚜不同发育阶段和驯化后热激处理的表达量变化。结果显示:禾谷缢管蚜Rp Hsp90的c DNA全长为2 644 bp,编码727个氨基酸,分子量为83.2 k D。推导的氨基酸序列具有Hsp90蛋白家族的5个签名序列及C末端细胞质特征序列EEVD。系统进化树结果显示,Rp Hsp90与其它昆虫Hsp90具有很高的相似性。实时荧光定量PCR结果表明,不同发育阶段Rp Hsp90均有表达,并且4龄若蚜期表达量最高,显著高于其它龄期;27℃热驯化后禾谷缢管蚜Rp Hsp90表达量和常温24℃处理试虫无显著差异;热激处理显著诱导Rp Hsp90的表达,39℃热激处理Rp Hsp90表达量显著高于40℃热激处理;热驯化种群经热激处理后表达量显著高于常温热激处理。表明Rp Hsp90在禾谷缢管蚜不同龄期差异表达,且在该虫对热胁迫的响应中具有重要作用。     

温度胁迫下沙葱萤叶甲小热激蛋白基因GdHsp20.6的克隆及表达分析（英文）

为明确小热激蛋白在沙葱萤叶甲Galeruca daurica应对温度胁迫中的作用,采用PCR方法克隆沙葱萤叶甲小热激蛋白基因Hsp20(GdHsp20.6)完整的开放阅读框(open reading frame,ORF)序列,应用在线软件对GdHsp20.6基因进行生物信息学分析,通过原核表达技术诱导表达及纯化其编码蛋白,并通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)技术分析不同温度胁迫下GdHsp20.6基因的表达量。结果显示,GdHsp20.6基因ORF序列长度为543 bp,编码180个氨基酸,预测分子量为20.6 kD,无跨膜区和信号肽。GdHsp20.6氨基酸序列有高度保守的α-结构域。GdHsp20.6氨基酸序列与其它鞘翅目昆虫的Hsp20氨基酸序列有较高的一致性,其中与花绒寄甲Dastarcus helophoroides的Hsp20.99氨基酸序列的一致性最高,为63%。GdHsp20.6基因在大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)细胞系中成功表达,经异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导后GdHsp20.6蛋白成功表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)和Western-blot分析表明融合蛋白大小与预测大小一致,并纯化获得了纯度较高的目的蛋白GdHsp20.6。低温(-10～5℃)和高温(35～40℃)处理1 h以及处理后25℃恢复30 min均能诱导GdHsp20.6基因表达上调,并且0℃处理30～120 min也能诱导GdHsp20.6基因表达上调。表明GdHsp20.6基因在沙葱萤叶甲应对低温和高温胁迫中可能起着重要作用。     

松材线虫热激蛋白家族成员结构与功能分析

热激蛋白（Heat Shock Proteins,HSPs）是一类广泛存在于细菌、真菌和动植物中的热应激蛋白质。本研究从松材线虫基因组中获取了23个与秀丽线虫HSPs基因家族同源的Bx-HSPs家族基因。随后对这些基因所编码的蛋白质二级结构、疏水性、蛋白质序列基序和三级结构等生物学特性进行了预测。结果表明了Bx-HSPs家族成员的分子伴侣特性。本研究为松材线虫应激生理学及研究松材线虫适生范围和风险分析提供了分子生物学理论基础。     

甘薯褪绿斑病毒外壳蛋白的分子变异及其特异抗血清制备

 甘薯褪绿斑病毒(Sweet potato chlorotic fleck virus,SPCFV)是侵染甘薯的主要病毒之一。本研究利用RT-PCR方法克隆了SPCFV中国4个分离物的外壳蛋白(CP)基因。序列分析表明,cp基因全长900 bp,编码299个氨基酸残基。4个分离物cp基因的核苷酸序列一致性为78.3%～89.9%,推导的氨基酸序列一致性为91.3%～95.7%,存在较大的分子变异。不同分离物CP氨基酸序列N末端的第3-32位氨基酸为多变区。将四川分离物的cp基因克隆到原核表达载体pET-28a(+)上,SDS-PAGE分析表明,经IPTG诱导,cp基因在大肠杆菌BL21(DE3)中得到了高效表达。以表达的蛋白为抗原免疫家兔,制备了SPCFV CP的特异性抗血清。ACP-ELISA检测结果表明,制备的抗血清效价达1∶128 000,可用于田间甘薯样品的检测。     

小麦条锈菌hsp70基因的克隆及热胁迫下的表达特征分析

为明确热激蛋白70在小麦条锈菌对高温适应性中的作用,采用RACE和PCR技术扩增得到小麦条锈菌hsp70的基因全长,并利用实时荧光定量PCR技术对热胁迫下不同温度敏感类型小麦条锈菌中hsp70的表达特征进行分析。克隆得到的小麦条锈菌hsp70基因组序列全长为2 817bp,包含7个内含子,cDNA序列全长为2 267bp,其中开放阅读框为1 917bp,编码639个氨基酸,分子量为66.7ku,等电点为5.15。编码蛋白含3个保守的HSP70氨基酸序列。qRT-PCR试验结果表明,28℃热激后,hsp70的转录水平随热激时间的延长而略有增加,2h达到最高值。不同温度敏感类型菌株在热激2h后hsp70的相对表达量具有显著差异。低敏感类型菌株hsp70平均表达量为未经处理对照的7.12倍,而高敏感类型菌株hsp70平均表达量仅为对照的1.63倍。     

一个小麦茉莉酮酸酯诱导蛋白基因的克隆和鉴定

 用基因芯片技术结合分池法(bulked segregating analysis,BSA)对参与小麦(Triticum aestivum L.)"兰考90(6)"抗白粉病反应或与抗病基因连锁的EST进行了分析。从"中国春"中克隆了一个与Ta-JA1高度相似的新的小麦茉莉酮酸酯诱导蛋白基因(GenBank登录号:EU035635),命名为Ta-JA2。Ta-JA2和Ta-JA1的cDNA序列有99%相同,编码304个氨基酸组成的多肽。Ta-JA2具有植物病原应答诱导蛋白-dirigent-类蛋白的典型保守功能域和jacalin-类植物血球凝集素的典型保守功能域。Ta-JA2主要在叶片和茎中表达,在根和幼穗中几乎不表达;在幼叶、壮叶和旗叶中的表达水平依次增强;在"中国春"和一个二粒小麦(Triticum dicoccoides)品系幼叶中的表达受白粉菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)的诱导而增强;在"兰考90(6)21-12"叶片中的表达保持稳定而较高的水平。根据氨基酸序列的相似性建立了Ta-JA2类似蛋白的树形图,提供了植物中此类基因的进化信息。     

小麦白粉菌HSP70基因的克隆及高温胁迫对其表达的影响

小麦白粉病是由专性寄生菌Blumeria graminisf.sp.tritici引起的一种重要的气传真菌病害,该病曾于1990-1991年两年在我国发生大流行,近年来其发生面积也一直维持在500万公顷以上,给我国小麦生产造成了严重的损失.已有的研究结果表明,温度不但影响小麦白粉病的发生和流行,而且温度胁迫作用还会对白粉病菌群体产生影响,从而使病菌群体对温度的敏感性降低.目前已发现在我国白粉病菌群体中存在抗高温或耐高温的菌株,而且这些菌株在较高的温度下其寄生适合度要高于对温度高敏感性的菌株[1].由于病菌群体对温度敏感性的变化有可能影响病害越夏和越冬的范围,进而影响病害的发生和流行程度,因此,有必要对其耐高温的分子机制进行研究,这对于了解小麦白粉菌对温度的适应性以及气候变暖对此病害发生和流行的长期影响具有重要的意义.     

黏虫热休克蛋白Hsp90基因的克隆及不同温度对其诱导反应

热休克蛋白是昆虫体内一种很重要的抗逆蛋白,Hsp90是热休克蛋白家族中的重要成员。本试验利用高通量测序法获得Hsp90的c DNA的全长序列,通过Real-time PCR探讨黏虫各龄期、组织和黏虫3龄幼虫受到不同高、低温胁迫不同时间的Hsp90基因的相对表达量。在黏虫体内得到Hsp90的c DNA全长序列(Gen Bank登录号MF773751)2422 bp,命名为Ms Hsp90,编码717个氨基酸,分子量约为82.576 ku,等电点是4.98,序列包含有Hsp90的保守序列,与鳞翅目夜蛾科的甜菜夜蛾、苜蓿夜蛾、斜纹夜蛾亲缘关系较近,且氨基酸序列相似性都在98%以上。Real-time PCR结果显示黏虫的不同发育阶段和组织中均有Ms Hsp90表达,其中2龄幼虫和后肠的相对表达量最高。40℃处理6 h的相对表达量最高,处理12、24、48 h时,20℃的相对表达量最高。上述分析可知,Ms Hsp90相对表达量的高低表明在黏虫不同组织,不同发育阶段和不同时间、温度处理中发挥的作用存在差异。     

松材线虫rDNA的测序和PCR-SSCP分析

 本文为克服形态鉴定的不足,用分子生物学的方法鉴别松材线虫。线虫核糖体DNA(r DNA)的内部转录间隔区(ITS1)区(约308bp)的测序结果显示:松材线虫种内区别很小,不超过1bp;拟松材线虫种内区别较大,最大达7bp;这2种线虫的种间区别为32~39bp。根据以上测序结果,本文结合单条线虫DNA的提取技术,对14个松材线虫和拟松材线虫样本进行了单链构象多态性(PCR-SSCP)分析,结果表明PCR-SSCP分析技术可明确区分这2种线虫,该技术可为单条松材线虫的鉴定提供一套灵敏而可靠的方法。     

陕西杨凌番茄褪绿病毒的分子检测

近年来在陕西番茄生产区出现了一种新病害,病株表现为叶片褪绿,叶脉颜色变深及叶片增厚,果实变小发白,严重影响番茄产量及经济效益,2016年发病极为严重,部分产区甚至绝收。该病疑似由番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)引起。利用ToCV特异引物对感病番茄样品进行RT-PCR检测,结果从所采集的4份病样中均检测到ToCV预期大小的特异片段。对ToCV外壳蛋白CP基因和类热激蛋白HSP70h基因进行克隆与序列分析,ToCV-YL1 CP基因774个核苷酸序列与已报道的ToCVCP基因有较高的一致性,与山东青岛和山西晋中分离物同源性为100%。ToCV-YL1 HSP70h基因1 665个核苷酸序列与已报道的ToCV HSP70h基因有较高的同源性,与中国、韩国、日本、美国、希腊分离物同源性达到99%以上。研究表明ToCV已传播至陕西地区。     

北方四省区番茄褪绿病毒的分子鉴定

2015-2016年间,在山西省、内蒙古自治区、辽宁省、吉林省采集到疑似感染番茄褪绿病毒Tomato chlorosis virus(ToCV)的番茄植株。利用扩增ToCV外壳蛋白(coat protein,CP)和类热激蛋白(heat shock protein 70homolog,HSP70h)基因片段的两对特异性引物,通过RT-PCR对疑似样品进行分子检测,得到970bp和1 864bp的特异条带,经测序、比对确定为ToCV。序列分析表明,山西晋中分离物SXJZ(KX853540)的CP核苷酸序列与河南安阳分离物HNAYHX(KP264983)相似性为99.7%,内蒙古呼和浩特分离物NMHHHT(KU204709)和辽宁大连分离物LNDL(KU204707)的CP核苷酸序列与国内已报道的山东寿光分离物SDSG(KC709510)相似性分别为99.5%和99.7%,吉林长春分离物JLCC(KU306111)的CP核苷酸序列与山东聊城分离物SDLC(KC812622)的相似性为99.8%。而HSP70h核苷酸序列的相似性分析表明,山西晋中分离物SXJZ(KX853539)与日本分离物Tochigi(AB513442)相似性为99.4%,内蒙古呼和浩特分离物NMHHHT(KU204710)、辽宁大连分离物LNDL(KU204708)和吉林长春分离物JLCC(KX880384)与山东寿光分离物SDSG(KC709510)相似性分别为99.7%、99.8%和99.7%。试验结果明确了番茄褪绿病毒已蔓延传播到我国山西、内蒙古及东北地区。     

番茄褪绿病毒SYBR Green I实时荧光定量PCR方法

 根据番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus, ToCV)热激蛋白70(Hsp70)的基因序列,设计ToCV实时荧光定量PCR特异引物。利用重组质粒ToCV-1为标准品建立SYBR Green I实时荧光定量方法。针对引物浓度、退火温度、特异性、灵敏度、重复性和稳定性进行系列优化。结果表明,最适退火温度为63℃,最适引物浓度为0.3 μmol·L^-1。熔解曲线为特异性单峰,表明其特异性良好。建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR较常规PCR灵敏100倍,且具有良好的重复性和稳定性。基于SYBR Green I实时荧光定量PCR技术建立的ToCV检测方法,速度快、特异性强、灵敏度高、重复性好,可以用于ToCV的定量检测。     

Detection of the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus, Using a Real-Time Polymerase Chain Reaction Assay

ABSTRACT The pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, has caused significant damage to pine plantations both in East Asia and North America and is an important quarantine organism. A real-time polymerase chain reaction (PCR) assay was developed to detect B. xylophilus. A set of primers and probe specific for B. xylophilus was designed to target the ribosomal DNA internal transcribed spacer region. Optimal primer concentration, Mg(2+) concentration, and extension temperature were 400 nM, 3.0 mM, and 60 degrees C, respectively. The assay was highly specific and sensitive, detecting as little as 0.01 ng of B. xylophilus DNA. The real-time PCR assay also successfully detected B. xylophilus in field samples, and it should be very useful for quarantine purposes.     

Partial Genome Organization, Identification of the Coat Protein Gene, and Detection of Grapevine leafroll-associated virus-5

ABSTRACT The genome of Grapevine leafroll-associated virus-5 (GLRaV-5) was cloned, and the sequence of 4766 nt was determined. Degenerate oligonucleotide primers designed from the conserved closterovirus heat shock 70 protein (HSP 70) homologue were used to obtain viral-specific sequences to anchor the cloning of the viral RNA with a genomic walking approach. The partial nucleotide (nt) sequence of GLRaV-5 showed the presence of four open reading frames (ORF A through D), potentially coding for the HSP 70 homologue (ORF A); a 51-kDa protein of unknown function with similarity to GLRaV-3 p55 (ORF B); the viral capsid protein (ORF C); and a diverged viral duplicate capsid protein (ORF D). The ORF C was identified as GLRaV-5 viral capsid protein based on sequence analyses and the reactivity of the recombinant protein to GLRaV-5 specific antibodies by western blot analyses. The antiserum produced with the in vitro-expressed GLRaV-5 ORF C protein product specifically reacted with a 36-kDa polypeptide from GLRaV-5 infected vines but did not react with protein extracts from vines infected with other GLRaVs or uninfected vines. Furthermore, specific primers were designed for the sensitive detection of GLRaV-1 and GLRaV-5 by polymerase chain reaction.