一个小麦csAtPR5-类似基因的克隆、鉴定和表达分析

 小麦(Triticum aestivumL.)品系‘兰考90(6)’在2AL染色体臂上携带1个隐性抗白粉病基因,暂命名为PmLK906。以‘中国春’/‘兰考90(6)21-12’杂交F₃代纯合株系构建的抗、感cDNA池为探针进行小麦基因芯片杂交,结果表明与粗山羊草(Aegilops tauschii)csAtPR5类似的基因在抗病池中的表达量比感病池中约高2^4.2倍。随后,从‘兰考90(6)21-12’中成功克隆了一个2 125 bp的全长csAtPR5-类似基因cDNA序列,暂命名为TaAetPR5(GenBank登录号:EU082094)。TaAet-PR5与csAtPR5的cDNA序列有93%的相同。TaAetPR5编码1个由657个氨基酸组成的多肽,与csAtPR5有88%的相同。蛋白推导分析表明TaAetPR5的分子量为74.5 kDa,pI 6.82,可能是一个可溶性的球蛋白,存在于细胞核中的可能性是95%。接种小麦白粉病菌(Blumeria graminisf.sp.tritici)后12至72 h,‘兰考90(6)21-12’幼苗叶片中的TaAetPR5基因转录水平不断提高。感白粉病的‘中国春’中没有检测到TaAetPR5基因。     

荔枝霜疫霉自噬相关基因的鉴定与表达分析

 细胞自噬(Autophagy)是一种真核生物中高度保守的胞内物质降解和循环再利用的生理过程,其调控细胞动态平衡、压力适应和细胞程序性死亡,与植物病原真菌生长发育、孢子形成、侵染等一系列过程密切相关。荔枝霜疫霉(Peronophythora litchii)侵染引起的荔枝霜疫病严重危害荔枝生产及采后贮藏。本研究利用模式物种中已知的自噬相关蛋白,采用同源比对的方法在荔枝霜疫霉基因组数据库中鉴定到19个同源蛋白,分属16种蛋白类型。分析基因结构和蛋白保守功能域,发现荔枝霜疫霉自噬相关基因均具有内含子,且数目差异明显;所鉴定候选蛋白都具有相应分组的保守功能域,而PlATG1a在C端具有2个额外的ATG11功能域,PlATG11则在其N端包含1个APG17功能域。进一步对具有核心功能且多成员的自噬相关蛋白ATG1、ATG6、ATG8和ATG18进行系统进化和序列模块分析发现,这些蛋白在不同物种之间十分保守,但是其同源蛋白间存在分化。通过转录组数据分析和qRT-PCR验证结果显示,荔枝霜疫霉中自噬相关基因在生长发育和侵染阶段均有表达,与菌丝阶段相比,PlATG1a、 PlATG2、PlATG3、PlATG6a、PlATG8、PlATG18a基因在游动孢子阶段特异上调表达,其中PlATG8最为显著;PlVPS34在孢子囊阶段特异诱导表达,PlATG1b、PlATG12、PlATG17在孢子囊与游动孢子阶段上调表达但是在侵染阶段下调表达;PlATG6b、PlATG9、PlATG10、PlATG13、PlATG14及PlVPS15基因在生长发育和侵染阶段均表现出不同程度的上调表达,PlATG7、PlATG11、PlATG18b 则在侵染阶段显著下调表达。结果表明,细胞自噬可能参与调控荔枝霜疫霉的生长发育及致病过程。     

茉莉酸对PR-1、PR-2、PR-5和Ta-JA2基因 表达以及小麦白粉病抗性的诱导

 为了探索小麦抗白粉病分子机理,明确茉莉酸对小麦白粉病抗性的诱导作用、对植物抗病性标志基因PR-1、PR-2、PR-5和本实验室克隆的1个新基因Ta-JA2的激活作用,以及抗病性变化与基因表达变化之间的相关性,本研究以感白粉病的小麦品种“中国春”、“濮麦9号” 和“周麦18”为材料,用茉莉酸甲酯（methyl jasmonate,MeJA）喷洒小麦幼苗叶片进行诱导,通过离体叶段培养法接种白粉菌（Blumeria graminis f. sp. tritici,Bgt）进行抗性鉴定;用实时定量PCR技术检测小麦叶片中PR-1、PR-2、PR-5和Ta-JA2基因的表达变化。结果表明MeJA处理可以显著提高“中国春”、“濮麦9号”和“周麦18”对白粉菌的抗病水平。茉莉酸处理显著激活了PR-1、PR-2、PR-5和Ta-JA2的转录。茉莉酸诱导的抗病性提高与抗病标志基因PR-1、PR-2、PR-5及Ta-JA2的表达增强呈正相关。植物激素茉莉酸是小麦抗白粉病反应的信号分子。     

普通小麦“兰考90(6)”品系对白粉病抗性的遗传研究

 普通小麦(Triticum aestivum L.)"兰考90(6)"系列品系是以六倍体小黑麦(X Triticosecale Wittmack;AABBRR)为白粉病抗源培育的新的小麦-黑麦1BL/1RS异易位系。这些品系高抗白粉病。小麦白粉病抗性基因推导试验证明,"豫麦66"携带的抗病基因与大多数已经报道的小麦抗白粉病基因不同。用白粉菌[Blumeria graminis (DC.) E. O. Speer f. sp. tritici]单孢堆分离物进行的遗传分析表明,"兰考90(6)"品系携带一个小种专化的隐性抗白粉病基因。对"中国春"和"兰考90(6)21-12"杂交F₂分离群体进行1RS染色体检测,结果证明该抗白粉病基因不在1RS染色体臂上。本研究为有效利用"兰考90(6)"系列品系中的抗白粉病基因提供了科学依据。     

一个编码推定的钙依赖磷酸酶催化亚基的番茄全长cDNA序列的克隆及其表达分析

 钙依赖磷酸酶(Calcineurin)作为Ca²⁺信号传感器中继因子对受Ca²⁺调节的生物学过程起重要调控作用。本研究克隆了一个番茄全长cDNA序列,该序列与钙依赖磷酸酶催化亚基(Calcineurin A,CNA)序列同源。推定的蛋白产物由315个氨基酸组成,明显短于非植物来源的该类蛋白。该蛋白含有钙依赖磷酸酶类金属磷酸酶中保守的催化作用活性位点基序,以及两个潜在的钙调蛋白结合位点,故暂时命名为LeCAL1(Lycopersicon esculentum calcineurin A like 1)。对CNA序列的分析结果表明,植物与非植物CNA差异明显,在系统进化树中形成距离很远的两大分支。植物CNA中,LeCAL1与拟南芥CNA同源性较高,而与水稻CNA较低。对LeCAL1在番茄中的表达分析结果显示,Cf/Avr介导的过敏性反应的产生诱导LeCAL1基因的表达,表明钙依赖磷酸酶可能在番茄抗叶霉病中起调节作用。     

鞭毛素蛋白FliCxcv对水稻免疫反应的诱导功能鉴定

 为揭示来源于番茄细菌性斑点病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv)菌株XV18鞭毛素(FliCxcv)作为一种病原相关分子模式(PAMP)诱导水稻免疫反应的功能,本研究对FliCxcv编码基因flicxcv进行了基因克隆、序列分析、原核表达、蛋白纯化和诱导活性测定。结果表明,通过PCR特异性扩增,从Xcv菌株XV18中克隆了1 200 bp的fliCxcv基因片段,其序列与GenBank中己测序菌株的完全一致。在大肠杆菌中对该基因全长、N端和C端截短序列进行了原核表达,并获得了纯化的FliCxcv全长及其截短蛋白。将纯化蛋白浸润接种到水稻品种日本晴叶片组织,发现FliCxcv全长及其截短蛋白均能诱导水稻叶片细胞死亡、H₂O₂产生以及防卫基因(OsPAL和OsPR1b)表达等免疫反应,但诱导活性存在差异。因此,本研究验证了FliCxcv具有激发水稻细胞免疫反应的PAMP功能,为水稻免疫诱导制剂的研发提供了材料。     

青枯菌GMI1000效应蛋白RipQ对致病力的作用研究

 青枯菌通过Ⅲ型分泌系统向寄主植物细胞分泌100多种效应蛋白,对寄主植物的抗感病性产生影响。青枯菌效应蛋白RipQ启动子区存在典型的HrpB识别序列PIP box (5′-TTCGG-N15-TTCGC-3′),但其功能尚未明确。本研究分析了RipQ在青枯菌4种演化型菌株中的分布情况。以青枯菌GMI1000为出发菌,构建ripQ缺失突变体和过表达菌株,研究效应蛋白RipQ在青枯菌-番茄植物互作中的功能。结果显示,ripQ广泛分布于除演化型IV的不同青枯菌类群中。与野生型菌株相比,ripQ突变体在番茄上的致病力有一定程度的增强,而ripQ过表达菌株的致病力显著降低。突变体和过表达菌株在培养基中的生长与野生型没有区别,但过表达菌株在番茄体内的繁殖能力下降。RipQ过表达菌株侵染番茄后hrpB、hrpG和epsA基因表达量显著下调,且能够诱导番茄叶片H₂O₂的大量累积,过敏性坏死反应标志基因hin1和水杨酸信号通路标志基因PR1a的诱导表达。另外,在番茄上瞬时表达ripQ也可以观察到H₂O₂积累及叶片细胞坏死,伴随着hin1和PR1a的上调表达。这些结果表明效应蛋白RipQ具有诱导番茄抗性的作用,从而影响青枯菌在番茄植物上的致病力。     

小麦丙氨酸氨基转移酶基因TaAlaAT1的克隆及表达特征分析

 在已构建的受条锈菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)诱导的小麦非亲和抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)文库中,筛选到1个与水稻丙氨酸氨基转移酶基因高度相似的表达序列标签(expressed sequence tag,EST),利用电子克隆与RT-PCR相结合的方法,从小麦中获得1个1563bp的cDNA序列,命名为TaAlaAT1。序列分析表明,TaAlaAT1包含1个完整的开放阅读框,长1440bp,推测编码479个氨基酸。该氨基酸序列具有氨基转移酶的保守特征,与水稻、葡萄、大豆、拟南芥、苜蓿等多种植物的丙氨酸氨基转移酶高度相似,其中与水稻的亲缘关系最近。半定量RT-PCR与实时定量PCR结果显示,TaAlaAT1在小麦与条锈菌互作的非亲和组合中总体呈上调表达,在亲和组合中呈下调表达,且在2个组合中的表达差异显著。推测TaAlaAT1参与了小麦对条锈菌的防御反应。     

细胞骨架解聚药物对小麦与叶锈菌互作诱发的细胞过敏性反应的影响

 小麦(Triticum aestivum)品种洛夫林10和叶锈菌小种366组成不亲和组合,小麦叶片发生过敏性坏死反应(HR)是小麦抵抗叶锈菌侵染的重要因素。在接种前给小麦叶片分别预注射微管解聚药物磺草硝(oryzalin)和微丝解聚药物细胞松弛素D (cytochalasin D,CD),结果表明2种药物注射使得寄主因叶锈菌侵染诱导的细胞过敏性坏死数目明显减少,并且注射药物的浓度越大,寄主细胞发生HR的数量越少。说明肌动蛋白和微管蛋白的聚合状态是诱发小麦叶片发生HR防卫反应所必需的,细胞骨架在小麦抵抗叶锈菌侵染过程中可能起着重要作用。     

小麦条锈菌效应蛋白HASP2抑制寄主免疫反应

 由小麦条锈菌(Puccinia striiformis f.sp. tritici,Pst)引起的小麦条锈病是小麦上的重要病害。研究小麦条锈菌在致病过程中分泌的毒性效应蛋白分子的功能,对揭示小麦条锈菌致病机理,进而研发病害防治新方法具有重要意义。前期在小麦条锈菌吸器转录组中筛选到一个高丰度表达的分泌蛋白基因HASP2。HASP2基因全长240 bp,其编码的蛋白质N端包含22_aa的信号肽,无跨膜区,无结构域。qRT-PCR显示HASP2在条锈菌CYR32侵染早期上调表达;农杆菌介导的烟草瞬时表达实验表明HASP2能够抑制由小鼠凋亡蛋白BAX诱导的烟草细胞坏死;利用细菌三型分泌系统(T3SS)将 HASP2在小麦中过表达,发现其可以抑制寄主PTI(PAMP-triggered immunity)相关胼胝质积累;同时对HASP2过表达的小麦接种无毒性菌系CYR23后,发现HASP2可以抑制寄主ETI(Effector-triggered immunity)相关活性氧积累和减少细胞坏死面积,但HASP2过表达对条锈菌的生长发育没有显著影响。     

一个二粒小麦LRR类受体蛋白激酶基因的克隆和鉴定

 Near the HMW-glutenin gene of wheat (Triticum aestivum), there is a locus (temporarily named TaXa) encoding LRR-receptor-like protein kinase, which is homologous to disease resistance protein Xa21 of rice (Oryza sativa). Through RT-PCR approach, a cDNA clone of ZS2002 was isolated from the orthologous locus of TaXa in Triticum turgidum. ZS2002 was 3 081 bp long and encoding a peptide composed of 1 026 amino acid. The protein included N-terminal conserved sequence, LRR domains, a transmembrane region and a serine/threonine protein kinase domain. ZS2002 was expressed in root, stem, leaf and spike. The transcribing in seedling leaves was significantly enhanced by Blumeria graminis f.sp. tritici. TaXa gene might play a role in powdery mildew resistance reaction in Triticum.     

抗赤霉病普通小麦-大赖草易位系T5AS/5LrL的分子细胞遗传学鉴定

 大赖草作为小麦野生近缘植物,对赤霉病表现较好的抗性, 将其赤霉病抗性基因转入普通小麦, 对创新小麦赤霉病抗性种质有重要意义。本研究在获得抗赤霉病普通小麦-大赖草异附加系基础上, 采用1200R ⁶⁰Co-γ射线处理小麦-大赖草二体附加系 DA5Lr花粉, 授予已去雄的普通小麦中国春,对其后代(M1)种子根尖细胞有丝分裂中期染色体进行GISH分析,获得了1株具有1条普通小麦-大赖草易位染色体的植株,让其自交,对自交后代中具有2条易位染色体植株的花粉母细胞减数分裂中期I进行观察,发现2条易位染色体形成了稳定的环状二价体,表明该植株为纯合体。利用顺序GISH-双色FISH分析,结合小麦D组专化探针Oligo-pAs1-2和B组专化探针Oligo-pSc119.2-2,进一步鉴定出该普通小麦-大赖草易位系为T5AS/5LrL,且筛选出了可追踪该易位系的3个EST-STS分子标记BE591127 、BQ168298和BE591737。赤霉病抗性鉴定结果表明,易位系T5AS/5LrL连续3年的病小穗率分别为7.69%、10.29%和8.66%,显著低于感病品种中国春和绵阳85-45。该易位系的育成为小麦赤霉病抗病性遗改良提供了新种质。     

蔓枯病菌侵染影响抗感甜瓜品种及杂种的光合特性分析

 以抗病的甜瓜“PI157082”、“PI482398”和杂种1代“PI157082×PI482398”以及感病品种“白皮脆”为材料,研究了蔓枯病菌接种对甜瓜幼苗叶片叶绿素含量、气体交换参数和叶绿素荧光参数的影响。结果表明:蔓枯病菌接种后,不同抗性甜瓜的叶绿素含量、净光合速率、气孔导度、Fv/Fm、Fv′/Fm′和ΦPSII均有不同程度的降低,CO₂浓度均有不同程度的上升。感病品种“白皮脆”的净光合速率、Fv′/Fm′、ΦPSII早于抗病材料达到显著水平;叶绿素含量、Fv/Fm显著低于接种前的时间跨度比抗病材料长;CO₂浓度变化幅度比抗病材料大。在抗病材料中,杂种1代PI157082×PI482398的净光合速率、Fv′/Fm′显著降低的时间晚于亲本PI157082和PI482398;叶绿素含量、气孔导度、Fv/Fm一直与接种前差异不显著;CO₂浓度变化幅度比亲本PI157082和PI482398小,说明杂种1代PI157082×PI482398可能比双亲有更严密的防御机制,使幼苗叶片保持较高的光合速率,体现出一定的杂种优势。     

蔓枯病菌侵染影响抗感甜瓜品种及杂种的光合特性分析

 以抗病的甜瓜“PI157082”、“PI482398”和杂种1代“PI157082×PI482398”以及感病品种“白皮脆”为材料,研究了蔓枯病菌接种对甜瓜幼苗叶片叶绿素含量、气体交换参数和叶绿素荧光参数的影响。结果表明:蔓枯病菌接种后,不同抗性甜瓜的叶绿素含量、净光合速率、气孔导度、Fv/Fm、Fv′/Fm′和ΦPSII均有不同程度的降低,CO₂浓度均有不同程度的上升。感病品种“白皮脆”的净光合速率、Fv′/Fm′、ΦPSII早于抗病材料达到显著水平;叶绿素含量、Fv/Fm显著低于接种前的时间跨度比抗病材料长;CO₂浓度变化幅度比抗病材料大。在抗病材料中,杂种1代PI157082×PI482398的净光合速率、Fv′/Fm′显著降低的时间晚于亲本PI157082和PI482398;叶绿素含量、气孔导度、Fv/Fm一直与接种前差异不显著;CO₂浓度变化幅度比亲本PI157082和PI482398小,说明杂种1代PI157082×PI482398可能比双亲有更严密的防御机制,使幼苗叶片保持较高的光合速率,体现出一定的杂种优势。     

苹果类甜味蛋白编码基因Mdtl2克隆及功能的初步验证

植物类甜味蛋白(Thaumatin like proteins, TLPs)是一类具有抗菌活性和抗非生物胁迫作用的病程相关蛋白。本研究克隆获得富士苹果(Malus domestica cv. Fuji)TLPs家族蛋白Mdtl2编码基因，该基因开放阅读框全长为912 bp,编码303个氨基酸。生物信息学分析显示Mdtl2含有多个保守的半胱氨酸及TLPs家族保守序列片段，且具有TLPs典型的三维结构，属于TLPs家族的糖苷水解酶64家族(GH64-TLP-SF Superfamily)。在烟草中过表达Mdtl2能够显著抑制疫霉(Phytophthora infestans)的侵染。在苹果中过表达Mdtl2显著抑制苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的侵染，并且能够诱导胼胝质的积累。上述结果表明，Mdtl2作为糖苷水解酶家族蛋白，能够通过诱导胼胝质的积累，提高植物对病原菌的抗性。     

小簇麦易位系V9128-3抗条锈病基因的遗传分析和SSR分子标记

 用7个我国当前流行的条锈菌生理小种对V9128-3的抗条锈性进行了评价,表明本易位系对我国优势流行小种具有良好的抗病性。以Su-4对V9128-3与铭贤169配置的F₁、BC₁F₁、F₂及F₃代群体进行了遗传分析,并对其中1个F₂群体进行了SSR标记,再用BC₁F₁群体的部分单株和F₃家系进行连锁标记的初步验证。遗传分析表明了V9128-3对Su-4的抗病性由1对显性核基因独立控制,从219对SSR引物中筛选到2个位于2AL上的该基因YrHV(暂命名)两侧的标记Xgwm356和Xwmc658,遗传距离分别为8.5和5.6cM,所用部分BC₁F₁单株和F₃家系验证了该2个标记与YrHV连锁性。将此标记可用于小麦抗条锈病分子标记辅助育种。     

烯酰吗啉对葡萄叶际微生物区系影响研究

 为探究施用烯酰吗啉后不同葡萄叶际微生物群落变化,以田间‘红地球’品种葡萄为研究对象,连续施用农药烯酰吗啉,采集不同组别样品,利用 Illumina Hiseq 高通量测序技术分析葡萄叶际真菌、细菌群落结构变化。基于可操作分类单元(operational taxonomic units, OTUs)的物种分类分析,共得到葡萄叶际微生物真菌群落共计6个门,23个纲,60个目,131个科,212个属,296个种;细菌群落共计42个门,91个纲,222个目,398个科,846个属,1 469个种。在云南农业大学砂壤土质、篱架式栽培的‘红地球’葡萄基地中发现:(1)葡萄叶际优势真菌有枝孢菌属(Cladosporium)、白粉菌属(Erysiphe)、unclassified -k_-Fungi属和Symmetrospora属;优势细菌有乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、拟杆菌属(Bacteroides)、肠球菌属(Enterococcus)、毛螺菌属(unclassified-f-Lachnospiraceae)、norank-f-Muribaculaceae属、芽孢杆属(Bacillus)、Blautia属和肠杆菌属(Kosakonia)。(2)经烯酰吗啉处理后,在健康葡萄叶片中其叶际真菌群落丰富度略降低,多样性显著增加,叶际细菌群落丰富度增加,多样性增加,但零星发病叶片中,叶际真菌、细菌群落丰富度和多样性则显著降低。(3)在零星发病葡萄叶片中,相对健康叶片,葡萄叶际真菌群落之间的差异被增大,而葡萄叶际细菌群落的差异被减小。(4)在健康及发病叶片中,相对丰度均上调的真菌为白粉菌属(Erysiphe)、球腔菌属(Mycosphaerella)、线黑粉酵母属(Filobasidium)、黑孢霉属(Nigrospora)、赤霉属(Gibberella)、被孢霉菌(Mortierella)和镰刀菌属(Fusarium),细菌为巨单胞菌属(Megamonas)、链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和弯曲杆菌属(Campylobacter);相对丰度均下调的真菌为枝孢属(Cladosporium)、壳针孢属(Septoria)、链格孢属(Alternaria)和担孢酵母属(Erythrobasidium);细菌为短小杆菌属(Kosakonia)鞘脂单胞菌属(Sphingomonas);推断这些菌对烯酰吗啉较为敏感。(5)施用烯酰吗啉农药对葡萄叶际微生物的影响在健康叶片与零星发病叶片中有差异,且有新的优势菌属出现。     

引起江苏茅山地区宣木瓜叶斑病的病原鉴定

<正>原产于安徽省宣城市的地道中药材宣木瓜(Chaenomeles sinensis)隶属蔷薇科(Rosaceae),为常用中药木瓜的上品,是与藏红花、甘枸杞、川杜仲齐名的四大名贵中药材之一。除药用之外,近年也被用于化妆品和保健品领域[1]。此外,由于树冠优美、花团锦簇,宣木瓜还被栽培用于观赏;同时,因其耐旱耐瘠,对土壤要求不高,又常被作为退耕还林的引种树种。因此,宣木瓜是一种集经济、生态、社会等多种效益于一身的优良树种,被广泛种植于安徽、云     

菊花‘C029’转录因子基因CmWRKY15-1的抗病功能分析

 菊花白色锈病(chrysanthemum white rust,CWR)是影响菊花生产效益的重要病害,明确菊花高抗品种‘C029’的抗病基因CmWRKY15-1响应菊花白色锈病的分子机制,对于培育菊花抗病新品种具有重要的理论和现实意义。本研究以菊花高抗品种‘C029’为试验材料,构建沉默载体pTRV2-CmWRKY15-1与过表达载体pBI121-CmWRKY15-1,利用农杆菌介导法转化菊花‘C029’,分别获得8株沉默株系,表达效率约为正常水平的30%～60%,和3株过表达株系,其中一株的表达水平为野生型(WT)的3.4倍,命名为OE-1。在病原菌侵染条件下,qRT-PCR测定WT与转基因株系中病程相关基因的表达量,探究CmWRKY15-1在菊花抵抗白色锈病过程中的功能。病原菌侵染后,在WT与OE-1中,NPR1和PR5的表达水平呈先上升后下降趋势,其表达量在OE-1中早于WT(分别在24和38 h)达到最高峰,PR1的表达量在OE-1于38 h达到峰值。在沉默株系中,NPR1和PR5的表达则受到抑制,且一直低于WT与OE-1株系。结果表明:CmWRKY15-1通过调控病程相关基因参与菊花抵抗白色锈病的反应。综上,CmWRKY15-1对菊花‘C029’抗白色锈病起到调控作用。