IBDV细胞适应株的驯化及其VP2基因的分子特征分析

【目的】对从河南某地区发病鸡群中分离出的1株IBDV进行驯化使适应永生细胞DF-1,并对其VP2基因进行克隆和生物信息学分析,对IBDV分离株及其细胞适应株的VP2高变区及七肽区进行比较。【方法】测定IBDV分离株X1对10日龄SPF鸡胚的半数致死量(ELD50);通过SPF鸡胚-CEF-DF-1途径对X1进行驯化,使其适应永生细胞DF-1;根据IBDVVP2基因序列设计1对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV分离株和细胞适应株的VP2基因并测序,将其与参考毒株进行同源性和进化树分析,同时对二者在VP2高变区及七肽区的推导氨基酸序列进行对比分析。【结果】IBDV分离株X1对10日龄SPF鸡胚的ELD_(50)为10-8 mL~(-1),经驯化获得了细胞适应株C1。对2株病毒的VP2基因进行克隆并鉴定,测序分析得IBDV X1株在第222,256,294和299位上具有A、I、I、S4个特征性氨基酸,与IBDV超强毒株(vvIBDV)HK46 VP2基因氨基酸序列的同源性高达99.3%,确定X1株为IBDV超强毒株。同源性及进化树分析结果显示,C1株与IBDV减毒株CEF94亲缘关系较近,同源性较高,为99.6%,确定C1株为IBDV减毒株。在VP2高变区及七肽区推导氨基酸比对中显示,C1株第330位精氨酸R取代了X1株在330位的丝氨酸S;第222位氨基酸由A变成P;决定病毒毒力的位点第256和284位分别由I、A变为V和T。【结论】成功驯化了1株vvIBDV使其适应细胞,初步揭示vvIBDV在适应细胞、从超强毒力向弱毒力转化的过程中,VP2高变区及七肽区氨基酸序列有明显变化。     

IBDV超强毒株NJ09株在DF-1细胞上的增殖工艺

为完善现有鸡传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus,简称IBDV)灭活疫苗生产工艺,形成适用于批量生产的抗原制备技术流程,对IBDV NJ09株病毒在DF-1细胞上的增殖工艺进行研究。通过培养基筛选、血清最适浓度比较、接毒量测定等相关试验,明确了规模化生产工艺,即将DF-1细胞以1∶3、1∶4比例分瓶(0.85×105~1.2×105个/m L)传代培养,细胞生长36~48 h后按体积分数0.1%~0.2%接种IBDV NJ09株毒种,接毒后36~48 h收毒;同时筛选出适宜IBDV NJ09株病毒增殖的MD611培养基及小牛血清,既可以满足高滴度抗原增殖的生长需要,又降低了疫苗生产成本,形成了适用于规模化生产的抗原接种、收获、处理工艺技术指标,按上述工艺所增殖的IBDV NJ09株抗原病毒含量稳定在108.0TCID50/m L以上,可满足含IBDV组分的系列灭活疫苗生产需要,为该病毒灭活疫苗大规模生产提供了技术支持。     

传染性法氏囊病病毒结构的冷冻电镜初步分析

为研究传染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus, IBDV)的结构和基因组在其衣壳内部的包装信息,通过IBDV感染DF-1细胞并分离纯化得到完整的IBDV颗粒,利用单颗粒冷冻电镜技术获得了近生理条件下的IBDV在≈6.6?分辨率下的三维结构。结果显示:IBDV病毒衣壳是由260个VP2三聚体蛋白组成的单层衣壳,三角剖分函数T=13;在IBDV衣壳内部观察不到dsRNA基因组和RNA聚合酶的电子密度,这与其他dsRNA病毒如胞质型多角体病毒(cytoplasmic polyhedrosis virus, CPV)、蓝舌病毒(bluetongue virus, BTV)、轮状病毒(rotavirus, RV)明显不同。该结果暗示,IBDV可能采用了与其他dsRNA病毒不同的方式进行基因组组装、转录和复制,这为进一步揭示IBDV基因组的转录、复制和组装的分子机制及IBDV的起源和进化提供了结构学依据。     

稳定表达传染性法氏囊病病毒VP2蛋白突变体细胞系的建立

根据传染性法氏囊病病毒(IBDV)HZ2株VP2基因序列设计1对引物,将该基因成功克隆到真核表达载体pDsRed2-N1中,构建重组质粒pDsRed2-N1-VP2(简称PVP2);以PVP2作为过渡载体,运用PCR定点突变技术,对第279位点和第284位点的氨基酸残基分别或同时进行突变,共构建P279、P284和PDA 3株突变体;在此基础上构建能稳定表达HZ2株IBDV及其突变体VP2蛋白的Vero细胞系,间接免疫荧光试验检测表明,Vero细胞系中IBDV VP2蛋白已成功表达.这为进一步深入研究IBDV毒力及抗原变异致病机制奠定了基础;此外,利用定点突变技术改造VP2蛋白,建立不同毒力的突变体,在探求高效、廉价的IBDV DNA疫苗上也有广阔的应用前景和重要意义.     

鸡传染性法氏囊病毒VP2蛋白在大肠杆菌细胞周质中的表达

[目的]利用大肠杆菌可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)VP2蛋白。[方法]根据IBDV vp2全长序列(Gen Bank登入号AY704912),设计一对缺失VP2蛋白N-端80个氨基酸残基的特异性引物,克隆IBDV HQ株的vp2基因,插入质粒p ET-22b中构建大肠杆菌周质表达质粒p ET-22b-vp2,经IPTG诱导后表达重组蛋白。[结果]在SDS-PAGE中可见大小约为39 k Da重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western Blot检测表明其具有良好的反应原性。[结论]在大肠杆菌细胞周质中可以高效地可溶性地表达鸡传染性法氏囊病毒IBDV VP2蛋白,并且该重组蛋白有较好的免疫原性,可以为后续亚单位疫苗及检测试剂盒开发提供所需的蛋白。     

无血清微载体培养Vero细胞增殖传染性法氏囊病毒

为了获得用生物反应器无血清培养基微载体悬浮培养Vero细胞增殖传染性法氏囊病毒(infectious bursal disease virus,IBDV)的工艺参数,通过驯化Vero细胞适应无血清微载体悬浮培养后,再优化传染性法氏囊病毒在此细胞上的增殖工艺参数,包括初始细胞密度、微载体浓度、IBDV的感染复数(MOI)、接种时间和病毒收获时间。结果表明:获得适应无血清培养的细胞株——V0株,建立细胞库。获得3 L反应器中培养V0细胞增殖IBDV工艺参数,其初始接种密度为3×105cell/m L、微载体浓度为3 g/L、细胞培养1 d后按MOI为0.2接种IBDV,接毒后120 h收获病毒,可达最高病毒效价109.307TCID50/m L。本研究获得的Vero细胞、IBDV以及各项工艺参数为后续大规模悬浮培养制备法氏囊疫苗提供了生物材料和技术支持。     

可阻断IBDV感染的抗CEF膜蛋白单克隆抗体的筛选

 【目的】利用细胞融合技术及细胞免疫组化方法,筛选可特异性阻断鸡传染性法氏囊病病毒（IBDV）感染的抗鸡胚成纤维细胞（CEF）膜蛋白单克隆抗体,为进一步研究IBDV的CEF受体奠定基础。【方法】用CEF细胞免疫Balb/c小鼠,经细胞融合获得杂交瘤细胞上清。单层CEF用杂交瘤细胞上清孵育2 h后接种IBDV,病毒感染后固定细胞,先后与F22-EA6-Biotin及Streptavidin-HRP进行反应,最后用AEC染色,显微镜下计数,统计感染细胞减少的百分率以判定单抗上清阻断IBDV感染的效果。【结果】利用细胞组化的方法,共计检测了768株杂交瘤细胞上清,6株（1A5、1H11、2B12、3G1、4D10和4B8）显示有阻断IBDV感染的效果,其中4B8可完全阻断IBDV对CEF的感染,该单抗针对的CEF膜蛋白很有可能是IBDV的细胞受体。【结论】筛选到的抗CEF膜蛋白的单抗可以阻断IBDV感染CEF,表明所建立的方法具有较高的敏感性和特异性。这些单抗可以用于进一步研究IBDV的CEF细胞受体。     

鸡传染性法氏囊病病毒的分离培养和鉴定

从南京、宜兴鸡传染性法氏囊病(IBD)鸡群中,采集病变典型的法氏囊组织。采用特殊培养条件分离培养IBDV:延长病毒吸附时间(120分钟);提高犊牛血清(CBS)灭活温度(65℃);降低CBS用量(1％)和在维持液中添加100mM氯化钠。经在鸡胚成纤维单层细胞(CEF)盲传3代,本病毒可使CEF产生明显的致细胞病变效应(CPE)。连续传至第9代,CPE出现规律性变化:细胞浆成长丝状或条索状,变圆脱落的细胞呈颗粒状粘附在条索上。接毒后48小时,CPE达90～100％。经病毒血清中和试验、病毒核酸聚丙烯酞胺凝胶电脉等试验证实,JS-2株病毒属于IBDV。     

鸡新城疫病毒感染不同细胞的病变特性研究

为了探讨鸡新城疫病毒(Newscastle disease virus,NDV)感染不同细胞的病变特性,选用NDV强、弱毒株感染鸡胚成纤维细胞(DF-1)、仓鼠肾细胞(BHK-21)和人宫颈癌细胞(HeLa).结果表明:NDV强毒株在DF-1、BHK-21、HeLa上均能增殖,在DF-1、BHK-21、HeLa上产生的细胞病变(cytopathic effect,CPE)以发生细胞融合和形成合胞体为主要特征,在DF-1上增殖速度较快,HA效价也高;NDV弱毒株含10μg/mL胰蛋白酶的DMEM培养基上,DF-1、BHK-21、HeLa可引起细胞变圆、脱落,没有典型的CPE,盲传15代CPE特征未发生改变,血球凝集(HA)效价较低.可见,NDV在其种属来源相同的DF-1中更适宜增殖,DF-1可用作NDV感染的最佳细胞模型.     

利用生物反应器和Vero细胞培养鸡传染性法氏囊病病毒的研究

 通过对血清、pH、接毒量和收毒时间等培养条件的优化 ,确定鸡传染性法氏囊病病毒 (IBDV)在Vero细胞上增殖的最佳培养条件为 :血清 2 %,pH 7.0 ,接毒量 5∶10 0 0 0 ,收毒时间为接毒后培养 10 8h。 2 5 0ml自制搅拌瓶和 5L搅拌式生物反应器研究结果表明 ,在 2g/L微载体的Vero细胞悬浮培养系统中 ,待细胞刚长满微载体时 ,按照确定的IBDV最佳增殖条件换液培养 ,病毒可在较长一段时间维持高的病毒滴度 ,最高滴度分别可达 8.875和8.5 8(-lgTCID50 ) ,比传统转瓶生产方法至少提高 1个毒价 ,可用于IBDV规模化生产。     

纳米银对烟草病毒的体外抑制作用

为弄清纳米银对烟草病毒病是否具有抑制作用,采用半叶接种法,研究了纳米银对烟草病毒的体外防抑作用.结果表明:微波纳米银对TMV、CMV和PVY 3种单一病毒的体外抑制效果显著,电解纳米银对CMV和PVY的单一病毒的体外抑制效果显著.在3种病毒的复合侵染试验中,微波纳米银对TMV-CMV体外复合侵染的抑制效果显著,电解纳米...     

山东省辣椒主要病毒种类的分子检测与鉴定

【目的】鉴定山东省辣椒上的主要病毒种类,明确该地区辣椒上的主要病毒病原。【方法】2014—2015年,在山东省临沂、日照、青岛、烟台、潍坊、淄博、济宁、菏泽、聊城、德州共10个市(区)采集253份疑似感病的辣椒植株叶片,提取叶片总RNA和总DNA,利用双生病毒的通用引物(PA/PB)、马铃薯卷叶病毒属通用引物(POL-F/POL-R)及已报道侵染辣椒的主要病毒的检测引物对样品进行PCR、RT-PCR分子检测与鉴定,将扩增得到的目的条带经凝胶回收试剂盒回收纯化后连接到pMD18-T载体上,再送至公司进行克隆测序。分别将所得的PMMoV、PeVYV和BWYV序列在NCBI上利用BLAST进行检索,利用DNAStar软件中的Megalign将所得序列与Gen Bank中已登录的世界各地有代表性的序列进行同源性比对,利用软件MEGA 5.05的Clustal W法进行多序列比对分析以及邻接法(neighbor-joining,NJ)构建系统进化树,系统进化树中各分支置信度(Bootstrap)进行1 000次重复分析。【结果】PMMoV、CMV总检出率分别为61.66%、60.08%;TMGMV、BBWV-2、BWYV、TMV发生也比较普遍,检出率为41.90%、34.78%、33.20%和24.90%;PCV-2、ToMV、TYLCV、PVY、MABYV、PeVYV、PCV-1、ChiVMV、AMV发生侵染现象较少,检出率分别为11.86%、9.88%、9.09%、6.72%、5.53%、3.56%、3.16%、0.79%和0.40%;未检测到Ca CV、PSV、Chi RSV、TSWV和To MMV。通过对病毒复合侵染现象进行分析发现,病毒复合侵染率高达89.92%,其中3种病毒复合侵染现象最多,所占比例达28.63%,4种病毒复合侵染率为25.00%,2种病毒复合侵染率为21.77%,5种病毒复合侵染率为13.31%,一个辣椒样品最多可同时感染6种病毒,侵染率为1.21%;对山东省10个地区的辣椒病毒检测,结果表明在辣椒上检出病毒种类最多的为临沂、济宁,检测到12种病毒,其次是烟台、聊城,检测到11种病毒,潍坊、菏泽检测到9种病毒,青岛、德州检测到8种病毒,日照检测到7种病毒,淄博检测到6种病毒,日照地区辣椒病毒复合侵染率最高,为100%,菏泽地区复合侵染率最低,为69.23%。分别根据PMMoV的部分CP基因序列、PeVYV部分Rd Rp、CP、MP基因序列以及BWYV部分CP、MP基因序列构建系统发育树,结果表明本研究PMMoV山东分离物SD60与中国贵州分离物的亲缘关系最近,PeVYV山东分离物SDRZ31-1与意大利IT83分离物的亲缘关系最近,BWYV山东分离物SD与韩国分离物LS的亲缘关系最近。【结论】在山东省采集的253份辣椒样品可被15种病毒侵染,PMMoV、CMV为主要病毒种类;在山东新检测到的病毒有MABYV、PeVYV、BWYV、PCV-1和PCV-2;明确了山东省主要辣椒产区病毒病发生情况以及病毒种类的主次关系。     

Detection of GLV, OYDV and LYSV in potato onion （Allium cepa L., Aggregatum group） by RT-PCR

Three pairs of primers were designed and synthesized from nucleotide sequences of garlic latent virus (GLV), onion yellow dwarf virus (OYDV), and leek yellow stripe virus (LYSV) by using PCR primer design software. The expected fragments about 170 bp, 287 bp, and 191 bp were amplified by RT-PCR for GLV, OYDV, and LYSV, respectively in disease-infected plants of potato onion (Allium cepa L., Aggregatum group), but such fragments were not obtained from healthy-looking plants and virus-free seedlings of shoot-tips. The amplified products of GLV, OYDV and LYSV were cloned into pGEM-T vectors, and transformed into Escherichia coli. JM109. The recombinant plasmids were obtained and sequenced. The nucleotide sequences were compared with corresponding viral nucleotide sequences reported in GenBank by performing a NCBI BLAST. The analysis showed that their homology attained 75% to 90%,89.5% to 96.1%,and 91.6% to 96.3% in GLV, OYDV, and LYSV, respectively. The total RNA of 6.34 μg·μL~(-1) from infected plants was diluted to a series of 10~(-1) to 10~(-5) and the detection sensitivity of RT-PCR was 10~(-4) (about 4 ng). Thus, a method of identification and detection by RT-PCR of GLV, OYDV, and SLYV was established.     

双抗TMV和CMV转基因番茄后代的遗传分析

通过对转ＴＭＶ和ＣＭＶ双价外壳蛋白基因番茄Ｔ１代群体和Ｔ２代株系进行ＰＣＲ及ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ鉴定，并分别进行温室及田间抗病毒试验，结果表明，Ｔ１代工程番茄植株中确有ＣＭＶ—ＴＭＶ双价外壳蛋白基因的遗传和分离，其遗传行为符合显性单基因的孟德尔遗传。Ｔ２代部分株系ＣＭＶ—ＴＭＶ双价ＣＰ基因已获得稳定遗传，共获得了３个遗传稳定的番茄株系。     

一种植物提取物对CMV、PVYN及其昆虫介体的作用

以植物Pt为材料,对其抗两种植物病毒———CMV(Cucumbermosaicvirus,CMV)和PVYN(PotatovirusYN,PVYN)及其昆虫介体[蚜虫Myzuspesicae(Suzer)]的作用进行研究。结果表明:(1)VT1具有较高的抗病毒活性,1mg/ml浓度下对CMV和PVYN的抑制率分别为91.6%和96.2%;(2)VT1对蚜虫有较强的触杀作用,24h和48h的LC50值分别为1.953mg/ml和0.8125mg/ml。生物活性跟踪发现,氯仿组分为植物Pt对蚜虫起触杀作用的有效部位;(3)VT1对蚜虫具有一定的忌避和内吸作用,但无明显熏蒸作用。     

山东省花生病毒的RT—PCR检测

应用RT—PCR方法检测了2008-2009年在山东各地采集的153个花生病叶样品,检测到花生条纹病毒（Peanut stripe virus,PStV）、黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus,CMV）和花生斑驳病毒（Peanut mottle virus,PeMoV）。PStV的检出率最高,为48．4％,在山东各花生产区均有发生;CMV的检出率为19．0％,在泰安、青岛、潍坊、聊城和临沂等地有发生;CMV与PStV的复合侵染率为9．2％。PeMoV目前仅在青岛地区发现。     

猪传染性胃肠炎病毒诱导ST细胞凋亡的初步研究

【目的】探讨猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)感染猪睾丸细胞(ST细胞)后是否可诱导细胞发生凋亡,并对凋亡的信号通路进行初步探究,为进一步揭示TGEV的致病机制提供理论基础。【方法】用TGEV感染对数生长期的ST细胞,同时设立对照组,在感染后不同时间取细胞样品,通过细胞形态观察、细胞活性检测、细胞凋亡率检测和细胞内Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9活性检测及Western blot分析等方法,研究TGEV感染对ST细胞的影响。【结果】TGEV感染可抑制ST细胞生长,并且呈现病毒感染剂量和感染时间的依赖性。倒置显微镜和荧光显微镜观察结果显示,10MOI(感染复数)的TGEV感染24h后,ST细胞出现典型的凋亡特征,细胞皱缩变圆、聚堆,细胞核内染色质固缩。流式细胞仪检测及Caspases活性检测表明,感染TGEV的ST细胞凋亡比例随感染时间的延长而逐渐增加,细胞内Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9活性逐渐升高。Western blot分析表明,Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9无活性的酶原形式随着TGEV感染时间的延长逐渐降解,同时Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9的活化片段逐渐增加。TGEV感染能够促进FasL和Bax的表达而下调Bcl-2的表达。【结论】TGEV感染能够诱导ST细胞凋亡,Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9及FasL介导的死亡受体通路和Bcl-2家族调控的线粒体凋亡通路,在调控TGEV感染诱导的细胞凋亡过程中可能起着非常重要的作用。     

核型多角体病毒对棉铃虫酯酶和酚氧化酶活性的影响

对感染核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，NPV)的棉铃虫Helicover pa armigera (Huebner)幼虫血淋巴进行了酯酶和酚氧化酶电泳分析。结果表明：2种酶带在感染12h后其活力发生了明显变化；酯酶酶带2d后发生位移，酚氧化酶酶带5d发生位移，且各自建立新的酶系统。酚氧化酶比活力分析结果表明：感染NPV后，1d达到最高点，2～3d处于最低点，4d后回升。     

Elimination of grapevine fleck virus and grapevine rupestris stem pitting-associated virus from Vitis vinifera 87-1 by ribavirin combined with thermotherapy

Vitis vinifera 87-1 plants infected by grapevine fleck virus(GFkV) and grapevine rupestris stem pitting-associated virus(GRSPaV) were used as the plant materials for virus elimination treatment. This study evaluated the effects of ribavirin at different concentrations(15 and 25 μg mL~(–1); R15 and R25, respectively), thermotherapy(37°C; T), and the combination of ribavirin and thermotherapy(R15+T and R25+T) on eliminating viruses from grapevine plants in vitro. Both R15 and R25 had phytotoxic effects and weakened plant growth. Thermotherapy positively affected the growth of grapevine plants. Plant height was significantly greater in T, R15+T, and R25+T than in CK, R15 and R25. The proportion of dead plants after T, R15+T, and R25+T was 51.4, 11.4, and 8.6%, respectively. The survival rates of regenerated plants after all treatments were 68.0%. Ribavirin concentration and treatment time were related to the regeneration of shoot tips and elimination efficiencies of the two viruses. The survival rates of plants after R15+T for 30, 40, and 50 days were 97.3, 90.7, and 74.4%, respectively. The elimination rates of GRSPaV from plants in the three time quantum were 55.6, 84.6, and 93.8%, respectively. The elimination rate of GFkV was 23.9% higher in R25(35/44) than in R15(25/45), and that of GRSPaV was 7.0% higher in R25 than in R15. The combination of thermotherapy and chemotherapy was found to have a positive effect on the eradication of GFkV and GRSPaV, and R25+T for 50 days was able to completely eliminate the two viruses from in vitro grapevines.