产低温淀粉酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质初步研究

对低温淀粉酶资源的开发是功能酶研究的新热点,本研究从东帕米尔高原江布拉克冰川冻土中分离获得多株高产低温淀粉酶菌株,最高产酶菌株D5-2经16S rDNA鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)细菌.对D5-2所产淀粉酶性质进行初步分析,结果表明,其最适作用温度和pH值分别为25 ℃和6.5,酶的热稳定性较差,40 ℃处理1h后酶活急剧下降,至70℃酶活力仅存23％;在pH 5.5～8.0条件下,酶活力相对稳定;Mn2+和Mg2+对淀粉酶有激活作用,而乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、Fe2+和Na+则抑制酶活.结果提示,菌株D5-2分泌的淀粉酶符合低温酶特性,应用空间较大,值得深入探究开发.     

玉溪醇化烟叶表面细菌酶制剂对烟叶中淀粉和纤维素的降解作用

合理降解烤后烟叶中的淀粉和纤维素含量已成为提高烟叶质量的关键工艺之一。本研究对分离自烤烟叶面的产淀粉酶细菌菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens A1)和产纤维素酶细菌菌株短小芽孢杆菌(B.pumilus C1)进行发酵培养,提取粗酶液,检测酶活性并应用于初烤烟叶上。通过设计不同酶量、作用时间、相对湿度和温度的方法考察这两种酶制剂对烟叶(Nicotiana tabacum K326)中淀粉和纤维素的降解效果。结果表明,菌株A1主要产α-淀粉酶,酶活力为7×105U/mL,菌株C1以产内切酶为主,酶活力为6×103U/mL;在温度40℃、湿度70%条件下作用96h,用菌株A1所产淀粉酶制剂4×107U/kg处理后的烟叶总糖增加率为12.78%,还原糖增加率为12.03%,菌株C1所产纤维素酶制剂4×105U/kg处理后的烟叶总糖增加率为13.87%,还原糖增加率为18.07%。研究结果提示,利用从烟叶表面分离的产酶菌株进行发酵生产的酶制剂可降解初烤烟叶中淀粉和纤维素,提高还原糖含量,可望在烟叶加工过程中得到应用。     

热稳定性β-葡聚糖酶菌种选育及产酶特性

从土壤中筛选到一株热稳定性β－1，3－1，4－葡聚糖产生菌ZJF－1，发酵60h酶活性为64U／mL，经鉴定该菌株为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)。紫外线和硫酸二己酯复合诱变，获得的突变株ZJF－1A5发酵60h酶活性达154．7U／mL，是出发菌株酶活性的2．42倍，对B.subtilis ZJF-1A5产酶特性的研究发现：大麦粉，糊精，可溶性淀粉等糖有利于β－1，3－1，4－葡聚糖酶的产生，葡萄糖，麦芽糖等单糖和双糖不利于菌体生长和产酶。B.subtilis ZJF-1A5 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的产生与菌体生长部分相关，在细胞进入对数生长后期至稳定期，酶活性显著增加，且β－葡聚糖酶活性与菌体生物量密切相关，B.subtilis ZJF-1A5 α－淀粉酶的产生也与生长部分相关，细胞进入对数生长期，α－淀粉酶开始大量产生，而中性蛋白酶的产生与菌体生长同步。     

土壤中淀粉酶高产菌株的分离及产酶条件的优化

从土壤中分离到淀粉酶产生菌,获得产酶量相对较高的菌株,并从pH和培养温度两方面对产酶条件进行优化。实验结果显示,土壤中分离的菌株有较高的淀粉酶活力,产酶条件适用于工农业生产。     

土壤中淀粉酶高产菌株的分离及产酶条件的优化

从土壤中分离到淀粉酶产生菌，获得产酶量相对较高的菌株，并从pH和培养温度两方面对产酶条件进行优化。实验结果显示，土壤中分离的菌株有较高的淀粉酶活力，产酶条件适用于工农业生产。     

两株蜡样芽孢杆菌α-淀粉酶差异性分析及基因的克隆表达

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）是产生具有重要工业生产价值的耐高温α-淀粉酶（α-amylase）的优良菌株。通过对两株蜡样芽孢杆菌（B905和B904）分泌的α-淀粉酶酶学性质研究,淀粉酶的活性稳定温度都在90℃-100℃,耐热性和酶活都不依赖Ca2＋,其它理化性质较为一致,但淀粉酶的分子量大小有明显的不同。PCR方法克隆得到了这两种耐高温淀粉酶的基因全长（amy905和amy904）,并在大肠杆菌诱导表达,结果显示：amy904基因长度为1362bp,其蛋白分子量约为55 KD;amy905基因长度为1761bp,其蛋白分子量约为68 KD。     

纤维素降解真菌A25-2的分离、鉴定及其产纤维素酶的酶学特性

本研究以Avicel-刚果红选择培养基为初筛培养基,从云南哀牢山国家级自然保护区和广西猫儿山国家级自然保护区的土壤样品中分离筛选得到4200株真菌,从中筛选出透明圈与菌落直径比较大、透明程度较为清晰的12个菌株。通过液体培养发酵,测定其上清液中的羧甲基纤维素酶活力、滤纸酶活力和Avicel酶活力,最终筛选出一株产该三种酶且其活力均最高的真菌菌株A25-2。通过对菌株A25-2形态学观察和其内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列同源性比对分析,将菌株A25-2鉴定为哈茨木霉（Hypocrea lixii）。酶活测定结果表明菌株A25-2产纤维素酶的酶活力较高,在最适作用pH4.5和最适作用温度55℃下,其羧甲基纤维素酶活力为2.26IU/mL,滤纸酶活力为0.58IU/mL,Avicel酶活力为0.39IU/mL。薄层层析实验表明A25-2具有完整的纤维素酶系统。因此,真菌A25-2可作为饲料加工等生产和纤维素酶相关研究的备选菌株。     

产黄纤维单胞菌CR-14菌株诱变选育及发酵条件优化

为提高产黄纤维单胞菌CR-14纤维素酶活力,对菌株进行亚硝酸、紫外线及复合诱变处理,筛选产纤维素酶活较高的突变株,并对其发酵条件进行优化。结果表明,经亚硝酸和紫外线复合诱变得到一株产纤维素酶活较高的菌株Y-UA-18,其酶活力为10.57 U,为原菌株产酶活力的1.67倍。通过正交试验得到菌株Y-UA-18产酶最佳培养基为:秸秆粉1.0%、复合氮源0.6%、KH2PO40.1%、Mg SO40.1%、Na Cl 0.08%;最佳培养条件为:初始p H值7.0、培养温度30℃、发酵时间3 d。通气量对菌株Y-UA-18产酶影响不明显,但在厌氧条件下发酵液酶活显著降低,0.1%TW-80对菌株Y-UA-18的产酶没有影响。     

纤维素酶高产菌株的诱变选育及产酶条件研究

本研究通过γ射线照射和亚硝基胍交替处理 ,诱变出一株纤维素酶高产菌株T80 1 ,与出发菌株相比 ,其产酶能力提高 1 77倍。通过对诱变菌株产纤维素酶条件研究发现 ,以稻草粉为碳源、蛋白胨为氮源时 ,菌株产酶最高。该菌株产酶最适培养温度为 2 8℃～ 30℃ ,最适培养 pH为 4 8～ 5 0 ,在此条件下发酵五天达到产酶高峰。该诱变株产酶能力高于国内外一些已知的纤维素酶高产菌株如QM941 4等 ,具有重大的实用价值。     

鳗鲡肠道高产α-淀粉酶菌株的筛选、鉴定及其代谢特征分析

肠道细菌对宿主肠道营养物质的代谢吸收发挥着重要作用.oα-淀粉是鳗鲡(Anguilla anguilla)配合饲料中的主要组分,为研究鳗鲡肠道细菌对α-淀粉的代谢作用,本研究从健康鳗鲡肠道内分离筛选出高产α-淀粉酶的细菌菌株MJ18,通过形态学观察和16S rRNA序列分析鉴定为迟钝爱德华氏菌9 Edwardsiella tarda).动力学分析结果显示,菌株MJ18所产α-淀粉酶的米氏常数Km=4.64 mg/mL,最大反应速度Vmax=45.45 mg/(min· mL).Biolog碳代谢特征研究结果显示,菌株MJ18对碳源的利用具有选择性,其中对糊精、麦芽三糖和丙酮酸等3种碳源的利用率最高,代谢活性强的碳源类型为核苷类,代谢活性弱的碳源类型为氨基酸类.本研究为揭示鳗鲡肠道细菌在α-淀粉代谢过程中的作用提供科学依据.     

两株蜡样芽胞杆菌α-淀粉酶差异性分析及基因的克隆和表达

蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)是产生具有重要工业生产价值的耐高温α-淀粉酶的优良菌株.对2株蜡样芽胞杆菌(B905和B904)分泌的α-淀粉酶酶学性质的研究显示,淀粉酶的活性稳定温度在90～100℃,耐热性和酶活不依赖Ca2 ,但淀粉酶的分子量大小有明显的不同.PCR方法克隆得到了两种耐高温淀粉酶的基因全长(amy905和amy904),并在大肠杆菌诱导表达.结果显示,amy904基因长度为1 362 bp,其蛋白分子量约为55 kD;amy905基因长度为1 761 bp,其蛋白分子量约为68 kD.     

两种淀粉酶的酶学性质及应用研究

研究了两种耐高温α-淀粉酶和两种真菌α-淀粉酶的酶学性质,确定了最佳酶反应条件.将其应用于淀粉糖生产中,以30%的玉米淀粉为原料,用进口耐高温α-淀粉酶水解至还原糖含量为16.5%,再用日本真菌α-淀粉酶在最佳条件下反应21 h,可得到含纯麦芽糖31.1%、葡萄糖1.7%、糊精2.7%的高麦芽糖浆.     

两种淀粉酶的酶学性质及应用研究

研究了两种耐高温α-淀粉酶和两种真菌α-淀粉酶的酶学性质，确定了最佳酶反应条件。将其应用于淀粉糖生产中，以30%的玉米淀粉为原料，用进口耐高温α-淀粉酶水解至还原糖含量为16.5%，再用日本真菌α-淀粉酶在最佳条件下反应21 h，可得到含纯麦芽糖31.1%、葡萄糖1.7%、糊精2.7%的高麦芽糖浆。     

木霉的空间诱变效应

本文对产纤维素酶的木霉菌孢子和斜面培养菌体搭载中国第18颗返回式卫星后,菌落形态和产酶能力的变化进行了研究。实验结果表明,搭载菌株的菌落形态发生变异,菌株的生长周期出现了缩短或延长的现象。对搭载的木霉菌株进行筛选,获得3株产酶能力大幅度提高的优良突变菌株,产酶能力提高了50%以上,且性状遗传稳定。     

纤维素酶高产菌株桧状青霉9-3的诱变选育及产酶条件研究

本文以桧状青霉9-3为出发菌株,采用硫酸二乙酯（DES）诱变,通过筛选得到一株酶活力高且遗传稳定性良好的菌株H16,其滤纸酶活力、β-葡萄糖苷酶酶活力与蛋白产量均较出发菌株相比均提高了4倍左右。并通过对发酵培养基以及发酵条件的优化,确定了最佳的产酶条件为：微晶纤维素浓度为2%,玉米浆干粉浓度为1.5%,发酵温度为30℃,初始pH为5.5,装液量为30 mL/250 mL,发酵周期为5 d。在优化的条件下,该菌株的纤维素酶和蛋白产量均进一步提高25%左右。     

秸秆纤维素降解真菌QSH3-3的筛选及其特性研究

为了获得高效降解秸秆纤维素的微生物菌株,采用滤纸降解法和刚果红染色法从含纤维素类物质的土壤中筛选到一株产纤维素酶菌株QSH3-3,通过形态观察和ITS序列分析,鉴定为草酸青霉Penicillium oxalicum QSH3-3。摇瓶产酶试验结果表明,该菌株的最佳产酶条件为:碳源为0.5%的碱处理过的玉米秸秆粉,氮源为0.2% 硫酸铵,起始pH为7,接种量为5%,产酶温度为30℃,培养时间为4 d。最佳产酶条件下,滤纸酶（FPase）、内切酶（CMCase）和木聚糖酶（Xylanase）分别为12 U、33 U、605 U（U为酶活性单位）;在15℃,其残余酶活力可达70%～80%;在pH 4～9 范围内,其残余酶活力可达70%以上。酶学稳定性研究表明,FPase、CMCase和Xylanase在pH 4～9范围残余酶活力达85%以上,具有较强的酸碱适应能力;FPase、CMCase和Xylanase在45℃以上酶活力迅速下降,耐热性较差。该菌株具有较高的木聚糖酶活力以及较强的低温、pH的耐受力,因而该菌株在田间温差大、土壤偏碱性等复杂条件下对秸秆纤维素类物质的降解具有较高的应用潜力。     

酸性β-甘露聚糖酶高产菌株的诱变育种

摘要：以一株实验室保藏的酸性β-甘露聚糖酶产生菌黑曲霉（Aspergillus niger）LW-1作为原始出发菌株,首先经自然分离筛选出一株产酶较稳定的N-9作为诱变出发菌株,再经真空微波和甲基磺酸乙酯（EMS）逐级诱变处理,采用基础发酵培养基固态发酵筛选以及斜面传代培养,获得了一株高产、稳产酸性β-甘露聚糖酶的E-30菌株。其产β-甘露聚糖酶活性达36 675 U/g,是原始出发菌株（17 048 U/g）的2.15倍。E-30菌株三角瓶麸曲种子保藏两个月,产酶活性稳定。     

三株产ACC脱氨酶的植物根际促生菌产酶条件优化及促生作用研究

为提高植物根际促生菌（PGPR）菌株产1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC）脱氨酶的能力,对3株PGPR菌株进行了最佳产酶条件优化及玉米促生试验。在单因素试验的基础上,研究了p H、温度、ACC底物浓度、Na Cl浓度、摇床转速对ACC脱氨酶酶比活力的影响,以p H、温度、ACC底物浓度为主要因素,进行响应面最佳产酶工艺优化。最终得到W5菌株的产酶条件为p H 8、温度32℃、ACC脱氨酶底物浓度6.0 mmol/L;BS2-2菌株的产酶条件为p H 10、温度30℃、ACC脱氨酶底物浓度6.0 mmol/L;5#菌株产酶条件为pH 9、温度30℃、ACC脱氨酶底物浓度6.0 mmol/L;较未优化前酶比活力分别提高了6.6、2、4倍。在盆栽试验中,W5菌株促生效果最为显著。利用高产ACC脱氨酶的PGPR能够促进玉米生长,可为制作为微生物复合菌剂奠定基础。     

响应面法优化桔青霉F-5-5核酸酶P1发酵培养基碳氮源

桔青霉(Penicillium citrinum)CICC 4011菌株经60Co γ射线诱变后,由其高产突变株经基因组重排育种筛选获得核酸酶P1高产菌株F-5-5,在马铃薯葡萄糖培养基中产酶达978.6U/ml.经Placket-Burman试验筛选得出影响菌株产酶的3个显著因素,为葡萄糖、可溶性淀粉和玉米浆干粉.在...     

黑胸散白蚁体内产纤维素酶细菌的筛选及其纤维素酶基因的鉴定与原核表达

白蚁(Isoptera)常以富含纤维素的木材为食,体内存在纤维素酶产生菌。从源于陕西佛坪的白蚁(经鉴定为黑胸散白蚁(Reticulitermes chinensis))体内筛选出了4株产纤维素酶菌株,采用单因素实验设计对酶活最高的菌株进行了产酶条件优化,并对其所产纤维素酶进行了酶学性质研究;同时,依据NCBI数据库设计的引物扩增出了该菌株的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因Cbs和β-葡萄糖苷酶基因Ba G,之后在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行了表达实验。结果表明:从黑胸散白蚁体内筛选出4株菌分别是阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其中枯草芽胞杆菌所产纤维素酶的活力最高,该菌发酵产酶的最适温度和pH分别是42℃、6.5,酶促反应的最适温度和pH分别是70℃、4.5,在此条件下该菌株酶活力为2.36 U/mL。该菌株所产的纤维素酶在50℃、pH 6.5的条件下热稳定性和pH稳定性最佳,使用该菌株所产的粗酶液发酵粗饲料,结果发现其对玉米(Zea mays)秸秆、小麦(Triticum aestivum)秸秆、苜蓿(Medicago polymorpha)干草和青贮饲料的粗纤维降解率分别为12.21%、1.3%、3.24%和17.42%。基因克隆结果表明该菌株具有Ba G、Cbs 2个纤维素酶基因,且大肠杆菌表达结果显示Ba G基因的粗酶液pro Ba G无纤维素酶活性,而Cbs基因的粗酶液pro Cbs在60℃、pH 5.0时酶活可达4.14 U/mL,将Ba G和Cbs基因进行原核融合表达,产生的蛋白约35 k D,其在最适条件70℃、pH 4.5时的酶活为4.57 U/mL,说明无纤维素酶活性的Ba G基因与Cbs基因融合后可能表达出了一个活性更高的纤维素酶蛋白。本研究对后期构建可降解木质纤维素的人工重组菌具有重要的理论价值。