稻草秸秆纤维素分解菌的分离筛选

本研究基于获得高效木质纤维素分解菌的目的,以刚果红纤维素琼脂和滤纸条培养基为初筛培养基,从分离获得的124株真菌中筛选出透明圈与菌落直径比值较大、滤纸条分解能力较强的11个菌株。经液体发酵,测定其酶活力,复筛得到羧甲基纤维素酶活和滤纸酶活均较高的4个菌株;并进行了不同碳源和不同pH对筛选菌株产酶能力的影响试验,发现不同菌株对不同纤维素物质的分解能力不一样,同一菌株对不同纤维素碳源的利用能力也不相同。     

纤维素酶高产菌株桧状青霉9-3的诱变选育及产酶条件研究

本文以桧状青霉9-3为出发菌株,采用硫酸二乙酯（DES）诱变,通过筛选得到一株酶活力高且遗传稳定性良好的菌株H16,其滤纸酶活力、β-葡萄糖苷酶酶活力与蛋白产量均较出发菌株相比均提高了4倍左右。并通过对发酵培养基以及发酵条件的优化,确定了最佳的产酶条件为：微晶纤维素浓度为2%,玉米浆干粉浓度为1.5%,发酵温度为30℃,初始pH为5.5,装液量为30 mL/250 mL,发酵周期为5 d。在优化的条件下,该菌株的纤维素酶和蛋白产量均进一步提高25%左右。     

基于纤维素酶和果胶酶活力的康氏木霉固体发酵培养基配方研究

为找到廉价的优化培养基配方生产高活力的复合纤维素酶,该实验采用配方试验和双温度培养法对康氏木霉F244菌株进行固体发酵,测定滤纸酶、棉花酶、羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶、果胶酶活力并通过SPSS软件建立回归方程,其全相关系数分别达到0.852,0.941,0.964,0.703,0.899,而后利用无约束规划求解找到复合酶生产配方.结果表明在固体培养基中Tween80对纤维素酶和果胶酶的生产均存在抑制作用,理想固体产酶培养基是稻草粉、麸皮、(NH4)2SO4及水分的混合物;复合纤维素酶生产的适宜配方为稻草粉16%,麸皮24%、(NH4)2SO4 3%、含水率57%,该配方对应的滤纸酶、棉花酶、羧甲基纤维素酶、β-葡萄糖苷酶及果胶酶的期望酶活分别达到72,129,342,112和108g.     

玉米秸秆低温降解菌的分离筛选及鉴定

利用从渭源县山地采集的30份样品,采用刚果红染色法和液体摇瓶发酵法筛选出了1株能够在15℃条件下降解羧甲基纤维素、玉米秸秆纤维素和高产纤维素酶的真菌菌株D5,同时测定了该菌株纤维素酶活力和对玉米秸秆的降解能力,并通过ITS r DNA序列分析对该真菌进行了初步鉴定。结果表明,菌株D5液体培养7 d的木聚糖酶活为52.7 U·m L~(-1),CMCase酶活为31.5 U·m L~(-1),滤纸酶活为29.6 U·m L~(-1);菌株D5在玉米秸秆为唯一碳源的培养基里发酵10 d,玉米秸秆的失重率为29.8%。菌株D5经ITS r DNA序列分析初步鉴定为Penicillium sp.,在玉米秸秆降解方面具有较大的应用潜力。     

一株高活性纤维素降解细菌的筛选鉴定及酶学特性

利用小麦/玉米秸秆还田土壤样品,通过富集培养和刚果红平板染色法筛选分离出纤维素降解细菌XWS-12;对分离的菌株进行16S rRNA基因序列系统发育分析,初步鉴定为伯克氏菌属(Burkholderia),定名为Burkholderia sp.XWS-12。以玉米秸秆和麸皮为碳源,研究了氮源、发酵时间、初始发酵温度、培养基初始pH等条件对该伯克氏菌产纤维素酶的影响。结果显示,该菌株产纤维素酶最适氮源为硝酸钠,培养时间为60 h,培养温度为37℃,培养基初始pH为4,该菌株的CMC酶活力最高,可达25 U/ml。其粗酶液的最适反应温度为50℃,最适反应pH为5,在pH 4~8的范围内酶活力较稳定。粗酶液的热稳定较差,当温度超过50℃时,该酶活力显著下降;当温度为50℃时,保温1 h,该酶活力损失53%。     

玉米秸秆降解真菌的筛选鉴定

为筛选适宜的玉米秸秆纤维素降解菌株作为玉米秸秆腐熟菌剂菌株资源储备，通过采用腐殖玉米秸秆土壤微生物培养筛选、刚果红水解圈测试及酶活测定等多种方法的应用，筛选得到2株具有纤维降解能力的真菌1#菌株和2#菌株。经形态学和分子生物学鉴定，初步确定1#菌株为长枝木霉，2#菌株为聚多曲霉。真菌1#菌株和2#菌株在刚果红培养基上均呈现比生长圈大2倍的水解圈。2个菌株在液体、固体2种酶液发酵情况下均表现内切酶活较强(65.202～217.614 U/mL)，均高于外切酶活(55.398～85.322 U/mL)和滤纸酶活(46.074～141.366 U/mL)，认为这2个菌株可作为玉米秸秆专用腐熟菌剂研发的储备菌株。     

高效纤维素优势分解菌的筛选和鉴定

本试验基于获得高效纤维素优势分解菌的目的,通过分离纯化初步得到30株菌株,利用刚果红染色法初筛共得到14株纤维素分解菌,并通过滤纸条崩解实验进一步进行筛选得到5株效果较好的纤维素分解菌,通过发酵产酶利用DNS显色法测定CMC酶活力和FPA酶活力最终确定了4株优势纤维素分解菌,通过测定4株菌株的羧甲基纤维素酶(CMCase)、滤纸酶(FPA)以及β-葡萄糖苷酶(β-Gase)活,验证4株纤维素优势分解菌的产酶能力,并分别命名为X-1、X-6、X-7和X-11,并将该4株优势纤维素分解菌应用于秸秆的液态发酵,其对秸秆的降解率较自然降解相比,降解率分别提高了31.92%、40.15%、35.29%和39.98%。对4株优势菌株进行了分子鉴定,根据16S r DNA序列比对结果表明,菌株X-1、X-7和X-11均为粪产碱杆菌;菌株X-6属于解糖假苍白杆菌。     

纤维素降解菌CMC-4的分离鉴定、诱变和酶学特性研究

从秸秆还田土壤中初筛获得一株高效纤维素降解菌CMC-4,根据菌株形态、理化性质及16S rDNA序列分析,初步鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)。以此为出发菌株,经亚硝酸钠诱变获得一株稳定高产纤维素酶突变株CMC-4-3。对CMC-4和CMC-4-3的产酶条件和酶学性质进行比较分析,结果表明:CMC-4-3纤维素酶活力较CMC-4提高67.5%;其最适产酶条件是:37℃、pH 6.0、葡萄糖为碳源、蛋白胨为氮源、接种量2.0%、装液量60 ml/250 ml。该菌株所产纤维素酶的最适反应pH为6.0,且在4.0~7.0酶活力较稳定;最适反应温度为50℃,在20~80℃范围内均保持稳定;金属离子Fe~(2+)、Mg~(2+)、Co~(2+)、K~+对酶有激活作用,其余离子均有不同程度抑制作用,而Cu~(2+)和Ca~(2+)抑制作用最强,酶活力减弱近50%,是该酶的强效抑制因子。诱变前后菌株产酶条件和酶学性质等部分表型发生了变化,而突变菌株显示出了更宽泛的环境适应范围。据此,获得一株高效产纤维素酶、耐受范围广的具纤维素降解能力的地衣芽孢杆菌,而CMC-4-3和CMC-4的表型可作为深入探讨基因型变化的线索。     

黑胸散白蚁体内产纤维素酶细菌的筛选及其纤维素酶基因的鉴定与原核表达

白蚁(Isoptera)常以富含纤维素的木材为食,体内存在纤维素酶产生菌。从源于陕西佛坪的白蚁(经鉴定为黑胸散白蚁(Reticulitermes chinensis))体内筛选出了4株产纤维素酶菌株,采用单因素实验设计对酶活最高的菌株进行了产酶条件优化,并对其所产纤维素酶进行了酶学性质研究;同时,依据NCBI数据库设计的引物扩增出了该菌株的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因Cbs和β-葡萄糖苷酶基因Ba G,之后在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行了表达实验。结果表明:从黑胸散白蚁体内筛选出4株菌分别是阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其中枯草芽胞杆菌所产纤维素酶的活力最高,该菌发酵产酶的最适温度和pH分别是42℃、6.5,酶促反应的最适温度和pH分别是70℃、4.5,在此条件下该菌株酶活力为2.36 U/mL。该菌株所产的纤维素酶在50℃、pH 6.5的条件下热稳定性和pH稳定性最佳,使用该菌株所产的粗酶液发酵粗饲料,结果发现其对玉米(Zea mays)秸秆、小麦(Triticum aestivum)秸秆、苜蓿(Medicago polymorpha)干草和青贮饲料的粗纤维降解率分别为12.21%、1.3%、3.24%和17.42%。基因克隆结果表明该菌株具有Ba G、Cbs 2个纤维素酶基因,且大肠杆菌表达结果显示Ba G基因的粗酶液pro Ba G无纤维素酶活性,而Cbs基因的粗酶液pro Cbs在60℃、pH 5.0时酶活可达4.14 U/mL,将Ba G和Cbs基因进行原核融合表达,产生的蛋白约35 k D,其在最适条件70℃、pH 4.5时的酶活为4.57 U/mL,说明无纤维素酶活性的Ba G基因与Cbs基因融合后可能表达出了一个活性更高的纤维素酶蛋白。本研究对后期构建可降解木质纤维素的人工重组菌具有重要的理论价值。     

产黄纤维单胞菌CR-14菌株诱变选育及发酵条件优化

为提高产黄纤维单胞菌CR-14纤维素酶活力,对菌株进行亚硝酸、紫外线及复合诱变处理,筛选产纤维素酶活较高的突变株,并对其发酵条件进行优化。结果表明,经亚硝酸和紫外线复合诱变得到一株产纤维素酶活较高的菌株Y-UA-18,其酶活力为10.57 U,为原菌株产酶活力的1.67倍。通过正交试验得到菌株Y-UA-18产酶最佳培养基为:秸秆粉1.0%、复合氮源0.6%、KH2PO40.1%、Mg SO40.1%、Na Cl 0.08%;最佳培养条件为:初始p H值7.0、培养温度30℃、发酵时间3 d。通气量对菌株Y-UA-18产酶影响不明显,但在厌氧条件下发酵液酶活显著降低,0.1%TW-80对菌株Y-UA-18的产酶没有影响。     

降解玉米秸秆真菌复合菌系的构建及其降解效果评价

  【目的】  秸秆的木质纤维素含量丰富、结构复杂，在自然界中降解较慢，增加秸秆降解菌剂中菌株的多样性有利于提升还田秸秆的降解效果。探究菌株多样性水平和组成影响复合菌系秸秆降解的效果及原因，为复合菌系在秸秆降解中的应用提供理论支撑。  【方法】  通过富集驯化培养，从玉米秸秆还田土壤中筛选具有秸秆降解能力的真菌，从中挑选5株高效秸秆降解真菌进行基因间隔区序列 (ITS) 测定和物种鉴定，明确其分类地位。通过全组合构建菌株多样性为1～5的复合菌系，分别检测复合菌系的秸秆相对降解率及其滤纸酶、纤维素内切酶和木聚糖酶活性，利用方差分析和相关性分析等方法研究菌株多样性和组成对复合菌系玉米秸秆降解效果及其纤维素酶活性的影响。  【结果】  共筛选获得了15株具有秸秆降解能力的真菌，其中5株真菌的秸秆降解效果好、纤维素水解能力强。经ITS序列鉴定和系统发育分析，发现5株降解真菌的遗传差异较大，Z7-6、F7-5、F4-3、L1-1和J2-5分别与草酸青霉 (Z7-6: Penicillium oxalicum)、烟曲霉 (F7-5: Aspergillus fumigatus)、哈茨木霉 (F4-3: Trichoderma harzianum)、白囊耙齿菌 (L1-1: Irpex lacteus) 和木贼镰刀菌 (J2-5: Fusarium equiseti) 的ITS序列相似度均超过99.95%。全组合复配结果表明，复合菌系的秸秆降解能力和纤维素酶活力均高于各单一菌株，且随着菌株多样性水平的增加而提高。滤纸酶、纤维素内切酶和木聚糖酶的活力越强，复合菌系对玉米秸秆的降解效果越好，而其秸秆相对降解率主要取决于滤纸酶和纤维素内切酶的活性。抽样效应分析发现，不同菌株对复合菌系的秸秆降解效果、滤纸酶和纤维素内切酶活性的影响不同。不含菌株F7-5的复合菌系降解效果显著优于含有该菌株的组合，以Z7-6 (P. oxalicum)、F4-3 (T. harzianum)、L1-1 (I. lacteus) 和J2-5 (F. equiseti) 组合F1的玉米秸秆降解效果最佳、酶活性最高。  【结论】  秸秆降解复合菌系的构建过程需要同时考虑多样性效应和抽样效应，增加降解菌的多样性有助于增强秸秆的降解效果。本研究筛选获得的复合菌系F1在玉米秸秆降解中具有潜在的应用前景。     

γ射线对斜卧青霉的诱变筛选及产酶条件优化

以斜卧青霉(Penicillium decumbens)A10为出发菌株,经450 Gy60Coγ射线诱变处理,选育出1株纤维素酶高产菌株A50,对其产纤维素酶的液态发酵条件进行研究优化,确定了所试因素的最佳组合,即主碳源浓度为5%,其中麸皮与玉米秸秆比例为1∶1,辅加碳源为0.1%的葡萄糖,辅加氮源为0.2%的磷酸氢二铵,Tween-80添加量为0.1%,培养基初始pH为5.0,300ml三角瓶的装液量为30ml、接种量10%、培养温度为32℃、摇床转速200r/min。发酵至60h时,纤维素酶活和滤纸酶活均达到最高,分别为27.28和1.98IU/ml,较出发菌株A10分别提高了33.2%和45.59%。     

一株曲霉的一种中温糖化酶的纯化及其部分酶学特性

本研究从广西花坪自然保护区采集的土壤中筛选获得了一株产糖化酶丝状真菌菌株57-45,通过形态学观察和真菌内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列比对分析,将其初步鉴定为曲霉属（Aspergillus sp.）的一个种。纯化真菌57-45所产的一种胞外糖化酶经过硫酸铵分级沉淀、疏水层析和阴离子交换层析三步蛋白质纯化步骤,得到在SDS-PAGE上约60kD的单一蛋白质条带,薄层层析分析表明该纯化的蛋白质水解可溶性淀粉的产物只有葡萄糖,证明该纯化的蛋白质为糖化酶。纯化的糖化酶Km值为1.9mg/mL,Vmax为4148μmol/（min·mg）,最适作用pH5.5,最适作用温度50℃,在同步糖化发酵中有应用的潜力。金属离子Fe3＋、Zn2＋、Cu2＋对酶活有较强的抑制作用,EDTA对酶活有较强的促进作用。本文结果将为进一步研究曲霉糖化酶的酶学特性提供新的材料。     

A preliminary study of the growth of fungi and bacteria from temperate and antarctic soils in relation to temperature

The growth of fungi isolated from a lowland temperate site (Roudsea Wood National Nature Reserve), an upland temperate moorland (Moor House National Nature Reserve) and an oceanic Antarctic island (Signy, S. Orkneys) was compared at 1, 14 and 25°C. This showed that low temperatures caused greatest retardation of growth in fungi from the warmest site (Roudsea) and least from the coldest site (Signy Island). At Moor House, fungi which were isolated most frequently in winter were able to grow better at 1°C than summer forms. The fungal flora of Signy Island was restricted and consists of cold tolerant cosmopolitan species which have been selected by or become adapted to the prevailing low temperatures. Of fungi isolated from any two of the sites, Mortierella alpina and Mucor hiemalis showed temperature adaptation correlated with prevailing site temperature, while Trichoderma viride, Penicillium thomii, and P. frequentans showed no adaptation.     

用于生物质酶解过程的纤维素酶研究进展

纤维素酶解效率是木质纤维素经济、高效生化转化的限制瓶颈。该文讨论了影响纤维素酶酶解经济性与高效性的多个要素,如:高滤纸酶活菌株的选育、发酵、酶解机理、酶解影响因素及酶解混合体系的优化等。该文研究表明,纤维二糖水解酶可能是决定发酵体系中滤纸酶活高低的关键单酶组分,同时,该酶可能也是预处理后生物质酶解体系中决定滤纸酶活效率的关键单酶组分。酶解过程中关键限速反应的认识及关键限制因素形成机制的揭示将成为纤维素酶生化转化研究的重点,这些机理机制的建立可为构建高比活力纤维素酶提供理论依据。     

长白山国家级自然保护区垂直带土壤-植物系统中Pb的变异特征及其影响因素

本文研究了长白山国家级自然保护区垂直带土壤-植物系统中Pb元素含量的水平变异和垂直变异特征。结果表明,垂直带土壤Pb含量均在25mg/kg以上,且各土壤带Pb的平均含量与其变异程度相反,棕色针叶林土Pb平均含量最低但变异最大,而山地生草森林土Pb平均含量最高但变异最小;垂直带植物Pb含量均低于克拉克值,与垂直带土壤Pb含量高低基本相吻合,但其变异以高山苔原带变异最大,岳桦林带变异最小;植物Pb含量垂直分异显著高于土壤Pb含量,变异系数达89.76%;植物对Pb的富集能力依植物种类及器官不同而异;成土母质和母岩、土壤pH值、有机质及土壤质地是影响Pb在土壤-植物系统中分异的主要因素。     

砂姜黑土中兼具促生功能的纤维素降解菌的筛选及其应用

为实现砂姜黑土地区秸秆资源化利用以及作物增产，本研究从该区小麦-玉米轮作土壤中筛选具有促生功能的纤维素降解菌株。通过羧甲基纤维素酶活(CMC)与吲哚乙酸(IAA)分泌量测定，筛选出1株具有高效降解纤维素的促生菌株。经形态学和分子生物学鉴定，该菌株为普沙根瘤菌(Rhizobium pusense)，命名为X2。小麦秸秆降解和玉米盆栽初步试验结果显示，X2菌株经液态发酵15d后小麦秸秆降解率为16.1%，较对照显著提升65.4%；接种该菌株后盆栽土壤中碱解氮含量较对照显著提高了72.7%，植株根系的平均直径、表面积以及地上部干物质量显著增加了22.0%、28.6%和33.3%。为进一步提高该菌株的活性，采用单因素试验对菌株的培养条件进行优化，结果表明，X2菌株在装液量为25 mL/250 mL、氮源为酵母粉、pH为6.0时生长和产IAA能力最优，产酶的最适pH为5.0。综上，所筛菌株X2具有秸秆降解和玉米促生能力，可在砂姜黑土地区为秸秆资源化利用提供新的微生物资源。     

百山祖国家自然保护区旅游资源评价

百山祖国家级自然保护区旅游资源十分丰富，开展生态旅游条件得天独厚。在调查百山祖自然保护区的资源现状的基础上，对其旅游资源进行了定性和定量评价，并探讨了百山祖自然保护区可持续发展的对策。     

昆嵛山国家级自然保护区生态系统服务价值演变

昆嵛山国家级自然保护区位于山东省东部沿海,是胶东半岛重要的生态屏障区,研究该区土地利用类型和生态系统服务价值的动态变化,为进一步明确该区域主体服务功能,完善昆嵛山自然保护地体系构建提供科学依据。通过解译2008—2018年的遥感影像数据,分析不同土地利用类型动态变化,运用当量因子法估算昆嵛山国家级自然保护区生态系统服务价值。结果表明2008—2018年昆嵛山国家级自然保护区土地利用类型变化主要是裸地及其他、耕地和林地之间的转移,面积增加最多的土地利用类型是林地,面积减少较大的土地利用类型是耕地、裸地及其他。2008—2018年,昆嵛山国家级自然保护区生态系统服务价值由3.36亿元增长至3.68亿元,食物生产功能价值呈减少趋势,原料生产、水资源供给、气体调节、气候调节、净化环境、水文调节、土壤保持、维持养分循环、生物多样性、美学景观功能价值均呈不同程度的增长趋势,其中气候调节和水文调节功能价值增长显著。生态功能是昆嵛山的主要服务功能,其中调节服务是昆嵛山的主要生态功能。不同土地利用类型中,林地的生态服务能力较高,也是维持昆嵛山生态系统服务的主体,昆嵛山自然保护区土地利用结构向着增强其生态功能的方向发展。