啤酒用β-葡聚糖酶高产菌株的选育及发酵条件优化

对产β-葡聚糖酶的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)A302菌株进行紫外线和硫酸二乙酯(DES)复合诱变和选育，获得产β-葡聚糖酶达27．3U／mL的突变株H302。采用均匀实验设计对H302菌株产β-葡聚糖酶的液体培养基组成及发酵条件进行优化实验，所获优化配方(W／V)为麦麸1．41％，鱼粉0．80％，硝酸钾0．34％，硫酸镁0．11％，起始pH6．0；用含孢量10^8个／mL的种子菌液按体积比3．3％接种上述液体培养基，在36℃下发酵52h，菌株H302的产酶活力达到115．1U／mL，是原出发菌株及培养条件下产酶活力的9．4倍。对突变株H302所产β-葡聚糖酶性质的研究表明，该酶最适作用温度为60℃，最适作用pH为5．5，适用于啤酒生产中的麦芽糖化。     

枯草芽孢杆菌ZJF-1AS ββ-葡聚糖酶基因的克隆、序列分析和表达

β-1，3．1，4-葡聚糖酶是重要的工业用酶，可有效减少大麦β-葡聚糖在啤酒酿造中所造成的麦汁过滤困难和啤酒的非生物性浑浊等负面影响。但内源β-葡聚糖酶在麦芽干燥和糖化过程中丧失了大部分活性。而微生物来源β-葡聚糖酶与麦芽内源酶有相同的底物专一性，且热稳定性优于麦芽内源酶。本研究对Bacillus subtilis mutant ZJF-1A5葡聚糖酶基因进行克隆、序列分析和表达，并对酶在细胞中的分布和酶的热学性质进行了研究。     

基因工程菌EGs2产β-葡聚糖酶条件优化及产酶特性

摘要：用乳清粉作为主要培养基组成，采用正交试验对重组菌EGs2的发酵条件进行了优化，并对粗酶液的酶学性质进行了研究。重组菌EGs2的最佳发酵条件为：摇床转速170 r•min-1，接种量1 ％，发酵培养基初始pH值6.0，种龄12 h。重组菌EGs2β－葡聚糖酶的表达与菌体生长呈正相关，发酵14h后，菌体生物量最高可达1.71 g•L -1，β－葡聚糖酶活力最高可达321.56 U•ml-1。所得粗酶液的最适反应温度和pH值分别为60 ℃和6.0，在70 ℃以下保温20 min后，残余酶活力均在80 %以上。在pH 5.0-9.0 放置48 h后仍能保持均90 %以上的残余酶活力。     

一株从金钱树上分离的产纤维素降解酶的菌株的分离及特性鉴定

本研究从金钱树（Zamioculcas zamiifolia）白绢病（Southern blight）病株上分离到一株产纤维素酶菌株SM,经形态观察和rDNA—ITS序列分析鉴定为齐整小核菌（Sclerotium rolfsii Sacc）,经以羧甲基纤维素钠为唯一碳源的培养基培养和刚果红染色测定,证明SM菌株可产生高活性纤维素降解酶。本文对SM菌株产纤维素降解酶的液态发酵条件进行了研究,结果表明：在起始pH6．0,无机氮：有机氮：纤维素碳源之比为0．07g：1．4g：1．6g,温度为30℃,摇床转速为160r／min,发酵培养时间为5d的条件下,该菌株发酵液的CMC酶活性达到11．7U／mL,滤纸酶活性达到2．156U／mL,β-葡萄糖苷酶活性达到3．911U／mL。     

枯草芽孢杆菌ZJF-1A5 β-葡聚糖酶基因的克隆、序列分析和表达

β-1,3-1,4-葡聚糖酶是重要的工业用酶,可有效减少大麦β-葡聚糖在啤酒酿造中所造成的麦汁过滤困难和啤酒的非生物性浑浊等负面影响.但内源β-葡聚糖酶在麦芽干燥和糖化过程中丧失了大部分活性.而微生物来源β-葡聚糖酶与麦芽内源酶有相同的底物专一性,且热稳定性优于麦芽内源酶.本研究对Bacillus subtilis mutant ZJF-1A5葡聚糖酶基因进行克隆、序列分析和表达,并对酶在细胞中的分布和酶的热学性质进行了研究.     

基于易错PCR技术的中性内切葡聚糖酶基因的定向进化

纤维素酶的工业应用一直受酶活性低,成本高的限制,为了提高中性内切葡聚糖酶的活性,本研究利用易错PCR技术对来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis )C-36的内切葡聚糖酶基因进行定向进化研究,在酶分子水平上改造内切葡聚糖酶分子.实验获得了最佳突变株b-15和b-28,其内切葡聚糖酶活力比亲本酶分别提高了2.1和3.6倍.序列分析表明:突变体b-15有6个碱基发生了突变,分别是A360G、T402A、A419T、T648A、A1208G和A1397T,导致4个氨基酸突变,分别是N134K、Q140L、N403S和Q466L;b-28只有1个碱基发生了突变,导致了398位Lys突变为Arg.通过SWISS-MODEL服务器模拟酶的三维结构,分析表明,b-15改变的4个氨基酸分别位于催化结构域的第4和第5个α螺旋之间的转角和结合结构域的第5个β折叠及第9和第10个β折叠之间的转角;b-28的突变位于结合结构域的第4个β折叠.同时,对获得的两株突变株b-15和b-28用正交试验优化产酶条件,优化后的酶活分别达到4.542和5.136 U/mL,是优化前的2.2和1.5倍.实验获得了酶活性提高的内切葡聚糖酶菌株,为进一步在分子水平研究内切葡聚糖酶的功能和其应用打下了基础,也为高酶活酶分子在其他高表达系统的表达提供了基础材料.     

枯草芽胞杆菌ZJF-1A5的β-葡聚糖酶热稳定性改造及酶学性质分析

利用定向进化技术对来自枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)ZJF-1A5的β-葡聚糖酶基因进行改造,并对野生酶和突变酶的酶学性质进行研究。获得了2株可以产较高热稳定性酶的突变体,分别被命名为EGs1和EGs2。酶学性质分析结果显示,与野生酶相比,EGs1和EGs2突变酶的半失活温度分别提高了3和5℃,达到了65.5和67.5℃;突变酶的最适反应温度也提高了5℃,达到了60℃;2个突变酶对地衣多糖的水解能力分别提高28%和降低21.6%;对地衣多糖的亲和力未见改变;野生酶和EGs1突变酶最适pH6.5,而EGs2突变酶最适pH7.0;野生型和突变型β-葡聚糖酶都有较宽的pH稳定范围,在pH6.0～8.5的范围内放置48h,仍保持80%以上的酶活力。遗传稳定性检验结果表明,突变株的遗传稳定性良好。     

酸性β-甘露聚糖酶高产菌株的诱变育种

摘要：以一株实验室保藏的酸性β-甘露聚糖酶产生菌黑曲霉（Aspergillus niger）LW-1作为原始出发菌株,首先经自然分离筛选出一株产酶较稳定的N-9作为诱变出发菌株,再经真空微波和甲基磺酸乙酯（EMS）逐级诱变处理,采用基础发酵培养基固态发酵筛选以及斜面传代培养,获得了一株高产、稳产酸性β-甘露聚糖酶的E-30菌株。其产β-甘露聚糖酶活性达36 675 U/g,是原始出发菌株（17 048 U/g）的2.15倍。E-30菌株三角瓶麸曲种子保藏两个月,产酶活性稳定。     

玉溪醇化烟叶表面细菌酶制剂对烟叶中淀粉和纤维素的降解作用

合理降解烤后烟叶中的淀粉和纤维素含量已成为提高烟叶质量的关键工艺之一。本研究对分离自烤烟叶面的产淀粉酶细菌菌株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens A1)和产纤维素酶细菌菌株短小芽孢杆菌(B.pumilus C1)进行发酵培养,提取粗酶液,检测酶活性并应用于初烤烟叶上。通过设计不同酶量、作用时间、相对湿度和温度的方法考察这两种酶制剂对烟叶(Nicotiana tabacum K326)中淀粉和纤维素的降解效果。结果表明,菌株A1主要产α-淀粉酶,酶活力为7×105U/mL,菌株C1以产内切酶为主,酶活力为6×103U/mL;在温度40℃、湿度70%条件下作用96h,用菌株A1所产淀粉酶制剂4×107U/kg处理后的烟叶总糖增加率为12.78%,还原糖增加率为12.03%,菌株C1所产纤维素酶制剂4×105U/kg处理后的烟叶总糖增加率为13.87%,还原糖增加率为18.07%。研究结果提示,利用从烟叶表面分离的产酶菌株进行发酵生产的酶制剂可降解初烤烟叶中淀粉和纤维素,提高还原糖含量,可望在烟叶加工过程中得到应用。     

Bacillus subtilis γ-DES36纤溶酶发酵条件的优化研究

以高活性纤溶酶突变株Bacillus subtilis γ-DES36为发酵菌株,研究其纤溶酶液体发酵的最佳工艺条件。通过对不同接种量、碳源、氮源、碳氮比、表面活性剂、金属离子等单因素研究,使用麦芽糖和胰胨时纤溶酶活性达2900IU／mL左右。为了降低成本,使用廉价的碳氮源麸皮和豆粕粉。正交试验得到该菌株产纤溶酶的优化液体发酵条件为：麸皮1％,麦芽糖1％,胰胨0．25％,豆粕粉1．5％,吐温400．15％,酵母膏0．1％,K2HPO4 0．25％,KH2PO4 0．1％,复合无机盐0．2mL／（100mL）,接种量1％,发酵液纤溶酶酶活达到2300IU／mL。     

枯草芽胞杆菌FJ-3-16产角蛋白酶条件优化及在生猪脱毛中的应用

枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)FJ-3-16是一株角蛋白酶高产菌株,在畜禽废弃物降解和生物脱毛方面有潜在应用价值。为提高菌株B.subtilis FJ-3-16胞外角蛋白酶产量,本研究综合利用单因子实验、Plackett-Burman(PB)设计和中心组合设计(Central composite design,CCD)优化了B.subtilis FJ-3-16的摇瓶产酶发酵条件,优化后的培养基配方为玉米粉1.41%、豆粉3.62%、酪素2%、CaC_l20.16%、K_2HPO_4 0.3%、KH_2PO_4 0.1%、pH 8.0,温度37℃,转速250 r/min,培养时间48 h,胞外角蛋白酶酶活由原有培养基的73.82U/mL提高至166.08 U/mL。且建立了利用50 L发酵罐生产角蛋白酶的发酵工艺,酶活在摇瓶发酵的基础上进一步提高,达207.6 U/mL,同时产酶时间缩短至18 h。同时利用菌株发酵液对巴马香猪(Sus scrofa)的猪蹄、猪头皮张及猪蹄整蹄进行脱毛,效果显著,表明B.subtilis FJ-3-16在巴马香猪为代表的难脱毛生猪的脱毛应用中具有极好的应用前景。本研究为实现角蛋白酶的工业化应用提供了基础资料。     

黑胸散白蚁体内产纤维素酶细菌的筛选及其纤维素酶基因的鉴定与原核表达

白蚁(Isoptera)常以富含纤维素的木材为食,体内存在纤维素酶产生菌。从源于陕西佛坪的白蚁(经鉴定为黑胸散白蚁(Reticulitermes chinensis))体内筛选出了4株产纤维素酶菌株,采用单因素实验设计对酶活最高的菌株进行了产酶条件优化,并对其所产纤维素酶进行了酶学性质研究;同时,依据NCBI数据库设计的引物扩增出了该菌株的内切-β-1,4-葡聚糖酶基因Cbs和β-葡萄糖苷酶基因Ba G,之后在大肠杆菌(Escherichia coli)中进行了表达实验。结果表明:从黑胸散白蚁体内筛选出4株菌分别是阿氏肠杆菌(Enterobacter asburiae)、炭疽芽胞杆菌(Bacillus cereus)、枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),其中枯草芽胞杆菌所产纤维素酶的活力最高,该菌发酵产酶的最适温度和pH分别是42℃、6.5,酶促反应的最适温度和pH分别是70℃、4.5,在此条件下该菌株酶活力为2.36 U/mL。该菌株所产的纤维素酶在50℃、pH 6.5的条件下热稳定性和pH稳定性最佳,使用该菌株所产的粗酶液发酵粗饲料,结果发现其对玉米(Zea mays)秸秆、小麦(Triticum aestivum)秸秆、苜蓿(Medicago polymorpha)干草和青贮饲料的粗纤维降解率分别为12.21%、1.3%、3.24%和17.42%。基因克隆结果表明该菌株具有Ba G、Cbs 2个纤维素酶基因,且大肠杆菌表达结果显示Ba G基因的粗酶液pro Ba G无纤维素酶活性,而Cbs基因的粗酶液pro Cbs在60℃、pH 5.0时酶活可达4.14 U/mL,将Ba G和Cbs基因进行原核融合表达,产生的蛋白约35 k D,其在最适条件70℃、pH 4.5时的酶活为4.57 U/mL,说明无纤维素酶活性的Ba G基因与Cbs基因融合后可能表达出了一个活性更高的纤维素酶蛋白。本研究对后期构建可降解木质纤维素的人工重组菌具有重要的理论价值。     

纤维素酶高产菌株桧状青霉9-3的诱变选育及产酶条件研究

本文以桧状青霉9-3为出发菌株,采用硫酸二乙酯（DES）诱变,通过筛选得到一株酶活力高且遗传稳定性良好的菌株H16,其滤纸酶活力、β-葡萄糖苷酶酶活力与蛋白产量均较出发菌株相比均提高了4倍左右。并通过对发酵培养基以及发酵条件的优化,确定了最佳的产酶条件为：微晶纤维素浓度为2%,玉米浆干粉浓度为1.5%,发酵温度为30℃,初始pH为5.5,装液量为30 mL/250 mL,发酵周期为5 d。在优化的条件下,该菌株的纤维素酶和蛋白产量均进一步提高25%左右。     

黑曲霉发酵麦麸生产β-葡萄糖苷酶的工艺优化及动力学研究

用单因素和正交试验对黑曲霉M85以小麦麸皮为发酵基质生产β-葡萄糖苷酶的工艺条件进行了优化，并研究了最优发酵条件下的动力学模型。正交试验结果表明，培养基中麦麸的有效添加量为2%，适合摇瓶和5 L罐最佳发酵工艺条件：转速分别为(200±5)r/min和(400±10)r/min，发酵温度均为(30±0.5)℃，接种量分别为15%和10%。黑曲霉M85在摇瓶和5 L罐发酵过程中动力学曲线具有相同的变化趋势，发酵第3 d发酵液中β-葡萄糖苷酶酶活分别达到1103.73 U/mL和1318.82 U/mL，对麦麸的转化率分别为55186.61 U/g和76085.82 U/g。其细胞生长和产物合成可以分别用Monod方程和Luedeking-Piret方程拟合。结果可为麦麸资源生物发酵深加工生产β-葡萄糖苷酶提供技术基础。     

海洋枯草芽孢杆菌UMBR1027产抑金黄色葡萄球菌活性蛋白分离鉴定及发酵条件优化

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)是一种能引起严重传染性疾病的人兽共患病原菌,由于其严重的致病性及其易产生耐药性的特点,使得探索新的具有活性的药物的需求越发迫切.为了研究对S.autrgus有抑制作用的活性蛋白,本实验采用硫酸铵沉淀法对海洋枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)UMBR1027产抑S.aureus活性蛋白进行提取,并利用葡聚糖凝胶SephadexLH-20柱层析、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)凝胶电泳进行分离、ABI 4800 plus MALDI-TOF进行鉴定;为了提高活性蛋白在B.subtilis UMBR1027发酵过程中的产量实验采用滤纸片扩散法,以抑菌圈直径为指标,分别从培养基pH、培养基的盐度以及培养温度这3个关键因素对B.subtilis UMBR1027产抑S.aureus活性蛋白的影响进行考察,并设计Box-Behnken实验以优化其发酵条件.结果显示活性蛋白主要含有碱性丝氨酸蛋白酶、α-淀粉酶、枯草杆菌蛋白酶和内切-β-1,3-1,4葡聚糖酶,优化实验得出B.subtilis UMBR1027产活性蛋白的最佳发酵条件组合为培养基pH为6.95、培养基盐度为10.38％、发酵培养温度为34.95℃;拟合实验中选取发酵培养基pH为6.95,发酵培养基盐度为10.38％,发酵温度为35℃进行验证,抑菌圈直径为20.4 mm,与理论值基本吻合.本研究对B.subtilis UMBR1027所产抗菌粗蛋白进行了分离,并成功对抗菌粗蛋白分离纯化后的各个部分进行了鉴定.响应曲面法有效提高了B.subtilis UMBR1027产抑制S.aureus的抗菌蛋白类物质,此研究为探索来自海洋的活性抗菌蛋白类天然药物分子提供了理论依据.     

高温大曲中高产α-淀粉酶菌株分离鉴定及其产酶性能研究

以前期实验从高温大曲中筛选得到的8株产酱香的细菌为研究对象,利用α-淀粉酶透明圈和α-淀粉酶活性测定相结合的方法从中筛选出1株高产α-淀粉酶的菌株GX05。通过形态观察及生理生化试验和16S r DNA分子生物学鉴定为假蕈状芽孢杆菌属(Bacillus pseudomycoides),并对该菌株产酶条件进行研究,最适条件为外加碳源为葡萄糖,氮源为尿素,初始p H 6,接种量13%,培养时间72 h,酶活可以达到180.12 U/g。     

纤维素降解真菌A25-2的分离、鉴定及其产纤维素酶的酶学特性

本研究以Avicel-刚果红选择培养基为初筛培养基,从云南哀牢山国家级自然保护区和广西猫儿山国家级自然保护区的土壤样品中分离筛选得到4200株真菌,从中筛选出透明圈与菌落直径比较大、透明程度较为清晰的12个菌株。通过液体培养发酵,测定其上清液中的羧甲基纤维素酶活力、滤纸酶活力和Avicel酶活力,最终筛选出一株产该三种酶且其活力均最高的真菌菌株A25-2。通过对菌株A25-2形态学观察和其内转录间隔区（internal transcribed spacer,ITS）序列同源性比对分析,将菌株A25-2鉴定为哈茨木霉（Hypocrea lixii）。酶活测定结果表明菌株A25-2产纤维素酶的酶活力较高,在最适作用pH4.5和最适作用温度55℃下,其羧甲基纤维素酶活力为2.26IU/mL,滤纸酶活力为0.58IU/mL,Avicel酶活力为0.39IU/mL。薄层层析实验表明A25-2具有完整的纤维素酶系统。因此,真菌A25-2可作为饲料加工等生产和纤维素酶相关研究的备选菌株。     

产β-葡萄糖苷酶的菌种的筛选,鉴定及其酶学特性

β-葡萄糖苷酶来源广泛,几乎存在于所有的生物体中,而不同来源的β-葡萄糖苷酶其性质也各不同。本文利用七叶苷分离培养基从土样中分离筛选出产6种β-葡萄糖苷酶时间较快的菌种,其中发现菌种WGEA1酶活性较高,随后对菌种WGEA1进行初步的鉴定并且采用DNS法测该菌株所产粗酶液的酶学特性。酶学特性表明,WGEA1产的β-葡萄糖苷酶最适温度是在50～55℃之间,最适pH在6～7之间;在低于50℃条件下,pH为5～8时,酶活较稳定,同时在最适反应时间30min下,金属离子和有机溶剂都对酶活性影响很大,这些发现都为在非水相体系中酶法合成烷基糖苷奠定了一定的基础。     

产低温淀粉酶菌株的筛选、鉴定及酶学性质初步研究

对低温淀粉酶资源的开发是功能酶研究的新热点,本研究从东帕米尔高原江布拉克冰川冻土中分离获得多株高产低温淀粉酶菌株,最高产酶菌株D5-2经16S rDNA鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas sp.)细菌.对D5-2所产淀粉酶性质进行初步分析,结果表明,其最适作用温度和pH值分别为25 ℃和6.5,酶的热稳定性较差,40 ℃处理1h后酶活急剧下降,至70℃酶活力仅存23％;在pH 5.5～8.0条件下,酶活力相对稳定;Mn2+和Mg2+对淀粉酶有激活作用,而乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、Fe2+和Na+则抑制酶活.结果提示,菌株D5-2分泌的淀粉酶符合低温酶特性,应用空间较大,值得深入探究开发.     

耐低温纤维素降解真菌的筛选、鉴定及酶活性研究

【目的】为筛选低温下高效降解纤维素的菌种资源,促进秸秆在低温条件的快速腐解。【方法】本研究利用低温稀释平板涂布法分离、刚果红定性、内切β-葡聚糖酶活力定量等分析方法进行低温纤维素降解真菌的筛选,依据菌株形态特征及rDNA-ITS序列分析鉴定菌种,探究其在不同温度下的产酶能力,并对粗酶提取物进行酶学性质的初步研究。【结果】(1)筛选到一株低温下高效产纤维素酶的真菌ZY-50,鉴定为球芽异普可尼亚菌(Metapochoniabulbillosa),目前尚无该菌产纤维素酶的报道;(2)球芽异普可尼亚菌ZY-50可在低温条件下生长并具有较强产纤维素酶能力,其内切β-葡聚糖酶活力在28℃、16℃、10℃温度下分别为76.03 U mL^-1、128.34 U mL^-1和115.67 U mL^-1,该菌在16℃下产外切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的能力较稳定,最高分别为2.31 U mL^-1、2.43 U mL^-1,16℃下滤纸酶活力最高为7.89 U mL^-1;(3)...