抗菌肽研发现状及其改造策略

抗菌肽已成为替代抗生素来预防和控制疾病的潜在药物,但因其产量低,生产成本高而缺乏大规模生产的条件,因此,通过基因工程技术对抗菌肽进行改造成为必然。文章分析了抗菌肽的研发现状、抗菌肽的基因改造策略,介绍了在天然抗菌肽基础上开展的氨基酸残基设计、肽片段拼接设计、肽链的环合设计、计算机辅助设计、靶向设计和模拟生物模型设计等衍生肽的分子设计策略及通过融合表达、串联表达、多拷贝表达等基因重组技术制备抗菌肽的优势及抗菌肽表达调控等研究进展,为抗菌肽的低成本和规模化生产奠定理论基础。     

蚕抗菌肽研究与产业化35年的回顾和展望

1981年国内研究者首次从中国柞蚕(Antheraea pernyi)蛹血淋巴中分离出抗菌肽,测定其序列约37个氨基酸残基。之后又设计合成了柞蚕抗菌肽D、AD及CAD,并且在酿酒酵母、毕赤酵母及芽孢杆菌中得到高效表达,通过优化培养基配方及建立先进的发酵工艺流程后生产的蚕抗菌肽产品质量稳定。目前国内已有广东、河南、山东及湖北等省的多家生产蚕抗菌肽的企业,产品已应用于农业、养殖业、医药、食品、化妆品等领域。例如:蚕抗菌肽代替抗生素作为安全、无药物残留、不污染环境的绿色饲料添加剂用于饲养肉鸡、肉猪及对虾等,能有效预防疾病,提高成活率,增加体质量,降低料肉比;将蚕抗菌肽基因转化作物培育抗病品种,其中转入抗菌肽基因的抗青枯病辣椒品种已在广东、广西2个省(区)推广应用。今后需要进一步通过建立先进、高效的蛋白质重组技术和发酵工程技术,完善蚕抗菌肽产业化开发应用过程的相关标准、法规,努力推进蚕抗菌肽这一绿色生物制品发挥其潜在的巨大经济效益。     

抗菌肽Thanatin转基因小鼠建立的初步研究

人工合成抗菌肽Thanatin基因的3条片段,利用重叠延伸PCR扩增技术得到完整的Thanatin基因,通过分子克隆方法构建出pIRES2-EGFP-Thanatin重组表达载体。然后与脂质体混合,采用睾丸打点注射将新构建的抗菌肽基因注入小鼠睾丸内,共注射公鼠5只。6周后与雌鼠交配,对新生仔鼠进行断尾,提取尾尖基因组DNA,利用PCR和Southern印迹方法对其进行检测。结果显示,得到的52只新生仔鼠中PCR检测阳性率为38.46%,Southern印迹检测阳性率为30.77%;在活体荧光成像系统下转基因小鼠呈现绿色荧光表达。通过睾丸注射法使Thanatin基因在小鼠的基因组中得到整合,为进一步研究抗菌肽的作用机理、培育抗病动物品种以及通过建立转基因动物生物反应器进行抗菌肽的大量生产奠定了基础。     

蚕类抗菌肽及其研究进展

抗菌活性肽被认为是从细菌到高等哺乳动物都普遍存在的一类防御性多肽。被称之为“第二防御体系”，具有抗细菌、真菌、病毒、原虫及抑癌活性，有潜在的应用价值。近年来。对抗菌肽的研充已成为一个迅速发展的新领域，越来越引起人们的关注和重视。本介绍蚕类抗菌肽的种类、作用机理、生物活性、抗菌肽基因的分子设计、克隆与表达以及抗菌肽在转基因动植物方面的研究状况。并探讨了抗菌肽的应用前景及存在的问题。     

转柞蚕抗菌肽D基因辣椒的目的基因及表达产物检测

应用现代生物技术,从核酸和蛋白质水平对转柞蚕抗菌肽D基因辣椒第4代的目的基因进行了检测。发现所分离的柞蚕抗菌肽D基因与原设计的序列一样;辣椒组织中也含有抑菌物质,经与天然抗菌肽D对比,表明抗菌肽D基因得到了表达。     

T3代抗菌肽转基因辣椒的PCR检测及青枯病抗性测定

对T3代抗菌肽转基因辣椒的11个株系进行了PCR分子生物学检测，证明T3代抗菌肽转基因辣椒仍保持外源抗菌肽基因；对T3代转基因辣椒群体进行了抗枯病测定试验。转基因辣椒群体抗病力提高，表明在转基因辣椒中蚕抗菌肽D、B基因得到了有效表达，从而缓减了青枯病症状。     

抗菌肽的应用及存在的问题

1应用 1．1基因工程 抗菌肽分子量较小,对多种动、植物病原菌具有广谱的抗性作用,同时,对动、植物细胞无毒副作用。因此,动、植物抗菌肽基因工程研究得到了广泛开展,期望将抗菌肽的基因转入动、植物体内并得到表达,达到抗病的目的。有人构建猪抗菌肽转基因小鼠,并成功获得该基因的表达,显著提高小鼠对链球菌感染的抵抗力。抗菌肽转基因植物方面的研究在模式植物烟草及马铃薯的研究较为成功,     

转基因植物疫苗研究进展

自十八世纪末期首次用疫苗预防疾病以来,疫苗已成为目前预防疾病最有效的的手段之一.近年来,随着基因工程、蛋白质工程以及免疫学理论与技术的迅速发展,以开发新型高效疫苗为目标的新的研究领域异常活跃,使传统的疫苗生产方式发生了根本性的变化,基因工程亚单位疫苗、活载体疫苗、核酸疫苗等已成为科学家们的关注热点.     

抗菌肽的效用及其在畜牧生产上的应用

抗菌肽具有免疫调节和创伤修复的功能,被广泛用于防治动物疾病的治疗和预防。本文介绍了抗菌肽的特点、效用、种类、分布,阐述了在养猪生产中、在家禽饲养中的应用情况,以期为抗菌肽在畜牧业的应用提供参考。     

抗菌肽在猪病防治中的应用

目前，抗菌肽已广泛应用于转基因动植物．药物开发．临床治疗．食品防腐剂与饲料添加剂等领域，并显示出良好的应用与发展前景。大连三仪动物药品有限公司研发的动物用抗菌肽，经几年来的兽医临床实践证明，对动物疾病有良好的防治效果。     

家蚕和果蝇的抗菌肽cecropin B基因的原核表达及抑菌活性分析

动物抗菌肽天蚕素(cecropin)因具有抗菌谱广、活性较强、不易产生耐药性等特点而成为新型抗菌剂开发的材料。为了探讨通过原核表达的途径高效获取天然cecropin,以重叠PCR方法分别人工合成家蚕(Bombyx mori)和果蝇(Drosophilamelanogaster)的抗菌肽cecropin B基因(CecB2)并克隆至T载体,测序确认后分别克隆至pET-32a载体,转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌进行表达。通过SDS-PAGE和Western blotting检测到2种目的蛋白均得到表达,但表达量存在差异,Bradford法测定纯化后的BmCecB2融合蛋白和DmCecB2融合蛋白的质量浓度分别为0.6、2.0 mg/mL。经Ni-NTA亲和层析纯化和透析处理后的2种产物的抗菌活性存在明显差异:DmCecB2和BmCecB2的质量浓度为10 mg/mL时,对E.coli DH5α的抑菌圈直径分别为15、8 mm左右,最小抑菌浓度分别为0.05、0.10 mg/mL。以上结果说明DmCecbB2的原核表达效率及表达产物的抑菌活性均明显高于BmCecB2。用生物信息学方法分析家蚕和果蝇的CecB2蛋白在结构上存在差异,这可能是导致2种产物活性不同的主要原因。     

抗菌肽cecropin P1的研究进展

cecropin P1是一种哺乳动物抗菌肽,对G-菌及一些G 菌有抑制杀灭作用.本文就cecropin P1的结构、抗菌机理、抗菌活性、基因工程及其应用前景做一综述.     

家蝇抗菌肽天蚕素基因的定点突变和高效表达质粒的构建

运用反转录聚合酶链式反应 (RT PCR)技术从家蝇体内扩增出抗菌肽天蚕素 (cecropin)基因的开放阅读框(ORF) ,与pMD 18T载体重组 ,经限制性酶切片段分析和核苷酸序列分析 ,与GenBank中报道的序列一致。根据此ORF ,重新合成 1对引物 ,并在碳末端进行定点突变 ,加上Asn编码 ,使其末端酰氨化 ,再利用半嵌套式PCR扩增出家蝇cecropin基因的成熟肽 ,与双酶切的酵母表达载体pPICZαA连接 ,经PCR和双酶切鉴定 ,成功构建了分泌型表达质粒。     

昆虫抗真菌肽Thanatin-CAD双价基因的合成、克隆及其表达

为促进昆虫抗菌肽基因在转基因抗病育种和生物工程制药的应用,通过设计嵌合引物结合分段PCR的方法将抗真菌肽Thanatin基因与Cecropin AD基因(CAD基因)融合拼接为Thanatin-CAD双价基因,采用T-A克隆法将其克隆至pGEM-T Easy载体,进行测序,结果证实与预期设计的完全一致;然后再将其亚克隆至表达载体pET-21d中,用IPTG诱导含重组表达质粒的菌株,对表达产物进行生物活性测定,初步结果显示Thanatin-CAD双价基因的融合表达产物对受试细菌无抑菌活性,但对部分病原真菌有较强的抑菌作用。     

抗菌肽Cecropin AD在毕赤酵母中的组成型表达及中试发酵研究

构建表达抗菌肽Cecropin AD蛋白的真核重组表达质粒pGAPZα-A-CAD,并转化酵母菌Pichia pastoris X-33,Zeocin抗性筛选阳性重组子,通过PCR鉴定、Tricine-SDS-PAGE分析和琼脂孔穴扩散法筛选获得抗菌肽CAD组成型表达菌株,并采用pH-溶氧监控策略进行工程菌Pichia pastoris X-33/pGAPZα-A-CAD的50 L中试发酵研究。结果表明,本实验成功实现了抗菌肽CAD在毕赤酵母Pichiapastoris X-33中的组成型表达pGAPZα-A,Tricine-SDS-PAGE分析显示在4.0 kDa处有明显的目的条带,工程菌经50 L发酵罐培养48 h后收获的上清液,100℃热处理10 min后,对金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠杆菌ATCC25922等均有明显的抑杀作用。抗菌肽的组成型表达方法在本研究中得到了成功应用,中试研究为以后的规模化生产和应用奠定了基础。     

猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2 基因的真核表达及表达产物的抗菌活性研究

为获得猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2基因并研究其抗菌功能,根据CecropinP2成熟肽的编码基因,人工合成3条寡聚核苷酸片段,经PCR获取Cecropin P2基因序列,成功构建了重组表达质粒pPIC9 K-Cecropin P2-His6并转化毕赤酵母GS115感受态细胞。转化子经MD、MM以及G418筛选,1%甲醇诱导表达,利用Tris tricine-SDS-PAGE对表达产物进行检测。体外抑菌试验表明,获得的重组蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌活性。本试验为抗菌肽的应用和新抗菌肽类药物的开发提供了必要的试验基础。     

Investigation of morphological changes of HPS membrane caused by cecropin B through scanning electron microscopy and atomic force microscopy

BackgroundAntimicrobial peptides (AMPs) have been identified as promising compounds for consideration as novel antimicrobial agents.ObjectivesThis study analyzed the efficacy of cecropin B against Haemophilus parasuis isolates through scanning electron microscopy (SEM) and atomic force microscopy (AFM) experiments.ResultsCecropin B exhibited broad inhibition activity against 15 standard Haemophilus parasuis (HPS) strains and 5 of the clinical isolates had minimum inhibition concentrations (MICs) ranging from 2 to 16 μg/mL. Microelectrophoresis and hexadecane adsorption assays indicated that the more hydrophobic and the higher the isoelectric point (IEP) of the strain, the more sensitive it was to cecropin B. Through SEM, multiple blisters of various shapes and dents on the cell surface were observed. Protrusions and leakage were detected by AFM.ConclusionsBased on the results, cecropin B could inhibit HPS via a pore-forming mechanism by interacting with the cytoplasmic membrane of bacteria. Moreover, as cecropin B concentration increased, the bacteria membrane was more seriously damaged. Thus, cecropin B could be developed as an effective anti-HPS agent for use in clinical applications.     

致倦库蚊天蚕素CecB2基因的原核表达及蛋白纯化

构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。