新疆野生冰草抗旱功能基因BADH的克隆及表达载体的构建

[目的]克隆新疆野生冰草抗旱相关基因甜菜碱醛脱氢酶(betaine aldehyde dehydrogenase,BADH)基因,为进一步研究其抗旱功能奠定基础.[方法]利用同源克隆法和RACE方法扩增获得新疆草原区强抗旱植物沙生冰草抗旱相关基因BADH,并将其构建到植物表达载体pBI121上.[结果]克隆获得的新疆野生沙生冰草抗旱相关基因BADH全长1 422 bp,编码区序列全长为1 182 bp,GenBank注册号为GU181396.1,并成功构建了植物过表达载体.     

小麦DREB基因的表达特征分析

[目的]对新春6号小麦的抗旱DREB基因进行表达特征分析。[方法]在干旱逆境胁迫下,考察不同胁迫处理时间下新春6号小麦中DREB基因的表达情况,分析该基因对小麦抗逆性的影响。[结果]小麦的抗旱DREB基因受干旱胁迫诱导,与对照相比,在小麦干旱胁迫12h后表达量上升。[结论]小麦的抗旱DREB基因可能参与小麦对干旱胁迫的应答,为研究小麦的抗旱分子机理提供了依据。     

DREB 2A基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

研究提取盐处理的拟南芥植株叶片总RNA,用DREB2A基因特异引物通过RT-PCR扩增出1050bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的DREB2A基因序列同源性达100%。进一步将DREB2A基因分别克隆至植物表达载体卡盒pCCE12和pCC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的DREB2A基因植物表达载体pCDRE12和pCDR29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导的DREB2A基因对植物的遗传转化奠定基础。     

小麦DREB基因的克隆及植物表达载体构建

脱水应答元件结合蛋白在高等植物应答干旱、高盐和低温胁迫中发挥重要的作用。根据GenBank中小麦(Triticum aestivum L.)DREB基因的cDNA序列设计引物,采用RT-PCR技术从小麦中克隆了DREB基因837 bp的编码区。为进一步研究小麦DREB基因的功能,以pMD18-T-DREB质粒为模板,PCR扩增DREB基因片段,构建了该基因的植物表达载体。经菌液PCR和测序鉴定后,转化到农杆菌LBA4404中,为通过转基因技术深入研究小麦DREB基因的功能奠定了基础。     

草莓乙烯受体Ers1基因反义植物表达载体构建

[目的]构建草莓Ers1基因反义植物表达载体,为探明该基因的功能以及采用生物技术方法改良草莓品种奠定基础。[方法]根据已克隆的草莓乙烯受体Ers1基因序列及表达载体pBI121上的酶切位点设计1对带限制性内切酶位点的特异性引物,以Ers1基因的测序质粒为模板,PCR扩增到草莓Ers1基因片段,克隆片段及载体经双酶切消化后,回收产物定向连接,将克隆片段反向补插入到植物表达载体pBI121的35S和gusA之间,构建成该基因的反义植物表达载体。[结果]经酶切鉴定,成功构建了草莓Ers1基因反义植物表达载体。[结论]该研究为进一步探讨Ers1基因功能及利用生物技术方法调控果实成熟衰老进程,从而改善草莓果实的贮运性能奠定基础。     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

拟南芥DREB1A基因的克隆与植物表达载体构建

用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,序列分析发现,所克隆的DREB1A基因与已发表的DREB1A基因序列(AB007787)的同源性为99.69%.利用基因重组技术成功构建了植物表达栽体pBI121-DREB1A,为进一步利用DREB1A基因综合改良植物抗旱性奠定了基础.     

植物DREB转录因子研究进展

DREB转录因子在植物的非生物逆境胁迫(干旱、低温、高盐)中起着举足轻重的作用。综述了植物DREB基因的结构、功能及其克隆,并对DREB基因在植物抗逆基因工程方面的应用及其今后的研究方向进行了预测和展望。     

百脉根LjIPT3启动子的克隆及表达载体的构建

[目的]为深入研究LjIPT3的表达调控和功能奠定基础。[方法]利用TAIL-PCR技术克隆百脉根IPT基因LjIPT3起始密码子的上游序列,利用生物信息学手段对其序列特征和潜在的调控元件进行分析,并构建启动子表达载体。[结果]利用TAIL-PCR技术成功克隆了LjIPT3基因5′端上游调控序列。将目的片段连接到pMD18-T载体上,获长度为1 910 bp序列,其3′端有部分序列与LjIPT3的5′端相同,证明克隆的片段为LjIPT3起始密码子ATG的上游区域。该序列含有1个TATA-box和3个CAAT-box,还包含光响应元件、MYB结合位点、不同的激素反应元件以及各种胁迫元件,说明该基因的表达可能受多种因素的调控。成功构建了驱动报告基因GUS的植物表达载体。[结论]该研究为研究植物细胞分裂素的合成代谢和植物生长发育的调控奠定了基础。     

南瓜基因CmNAC的克隆与序列分析(英文)

[目的]克隆南瓜基因CmNAC并进行序列分析。[方法]以南瓜叶片为材料,根据甘蓝型油菜NAC1、番茄NAC和辣椒NAC保守结构域设计一对简并引物,采用RT-PCR方法扩增得出长度约为440bp大小的DNA片段,将其克隆至pMDl9-T载体上,对重组克隆进行测序,用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析。[结果]所获得的南瓜NAC基因片段由442个碱基组成,编码147个氨基酸,命名为CmNAC;该基因片段具有其它植物NAC基因中存在的保守区,并且属于NAC家族中ATAF1/2亚家族。[结论]实验拟在南瓜中获得和抗逆性相关的NAC基因,为进一步研究该基因的生物学功能和植物基因工程奠定理论基础。     

羽毛针禾种群遗传多样性分析

[目的]从分子水平对羽毛针禾居群内、居群间的遗传分化进行研究,揭示其遗传多样性水平。[方法]使用11条RAPD引物对生长于古尔班通古特沙漠的优良固沙植物羽毛针禾进行居群遗传变异分析。[结果]7个居群76个样品共检测到125个位点,总多态位点百分比为96.8%,居群内平均多态位点百分比为45.3%;羽毛针禾种群Shannon表型多样性指数（I）为0.5151,Nei’s基因多样度指数（h）为0.3471;居群间的基因分化系数为0.5284,即有52.84%的遗传多样性存在于居群间。[结论]羽毛针禾居群有较为丰富的遗传变异,且各居群间已有了明显分化。     

AtDREB2B基因的克隆及植物表达载体的构建

[目的]获得耐旱转录因子的植物表达载体,进而转化植物获得耐旱性提高的新植物株系。[方法]提取脱水处理的拟南芥总RNA,利用AtDREB2B特异引物通过RT-PCR扩增出1.2kb片段,并将其克隆至pBS-T上,测序。[结果]序列分析表明,该克隆序列与GenBank上登录AtDREB2B基因序列的一致性为100%。进一步通过片段的亚克隆,将其构建至植物表达载体pCAMBIA1301和pBin438上,分别由rd29A启动子和重复35S启动子调控基因表达。[结论]成功构建了2种AtDREB2B的植物表达载体,并通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101,为农杆菌介导的AtDREB2B基因对植物的遗传转化奠定基础。     

新疆野生盘羊TLR9基因的克隆·序列分析及其编码氨基酸结构预测(英文)

[目的]克隆鉴定新疆天山亚种野生盘羊Toll样受体9(TLR9)基因,预测其结构与功能,并对序列进行分析。[方法]以外周血液的总DNA为模板,运用PCR方法分3段克隆了新疆野生盘羊TLR9基因,PCR产物经凝胶回收纯化后测序,并运用分子生物学软件将测序结果进行分析及结构预测。[结果]克隆得到的新疆野生盘羊TLR9基因大小是3192bp,含1个完整的开放阅读框(ORF),共编码1064个氨基酸,其氨基酸组成中亮氨酸的含量高达18.51%,含有30个氨基酸的信号肽序列;在野生盘羊TLR9蛋白455～475、740～760和780～800位氨基酸有3个跨膜区;新疆野生盘羊TLR9蛋白的3D结构是由胞外段富含亮氨酸的重复序列(LRR)和胞内段TIL(Toll/ILIR)结构域构成的。[结论]上述结构特征为TLR9发挥生物学功能奠定了基础,同时也为进一步研究新疆野生盘羊TLR9基因提供了理论依据。     

番茄脯氨酸脱氢酶基因的克隆与RNAi植物表达载体的构建

[目的]克隆了脯氨酸脱氢酶ProDH基因的全长cDNA,构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体,并转化到农杆菌.[方法]以“耐运2000番茄”幼苗为试材,根据GenBan中公布的番茄脯氨酸脱氢酶ProDH基因的序列信息设计了一对特异性引物,克隆了该基因的全长cDNA,分析基因序列选择正反向片段并扩增,并通过酶切、连接的方法构建了ProDH基因的RNA干扰植物表达载体PBI121-PDHi利用冻融法将表达载体转化到农杆菌EHA105中.[结果]所克隆到的ProDH基因片段长2 001 bp,其中CDS为1 491 bp,编码380个氨基酸.测序结果与公布序列同源性100％,因此可以用来构建干扰载体;通过酶切与测序鉴定,证明表达载体构建成功.[结论]经特异性引物扩增检测,证明表达载体已转入农杆菌,为进一步的研究该基因奠定了基础.     

HbDREB1基因表达载体的构建及其转基因烟草的鉴定

[目的]研究强抗寒性牧草——短芒大麦DREB1（dehydration responsive element binding protein1）基因的功能,为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定理论基础。[方法]利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,对转基因烟草进行分子生物学鉴定,并对离子渗漏率、脯氨酸表达量生理生化特性进行测定。[结果]HbDREB1整合入烟草基因组,已在转录水平上表达,转基因烟草在冷胁迫条件下的离子渗漏率明显低于对照组,且其脯氨酸表达量明显增高。[结论]HbDREB1基因具有提高植物抗寒性的潜能。     

盐穗木HcPS_H基因真核表达载体的构建及转化

[目的]盐穗木(Halostachys caspica)属藜科盐生植物,是广泛分布于新疆干旱或半干旱荒漠盐碱环境中的一种极端耐盐的多年生稀盐多汁半灌木,对盐分适应性极强.PS_H基因是一个参与光合反应光系统的基因,在植物光合作用中起着重要的作用.构建盐穗木HcPS_H基因真核表达载体对于了解该基因在盐穗木耐盐过程中的作用有着重要意义.[方法]利用PCR技术扩增得到大小为441 bp的盐穗木HcPS_H基因,经限制性内切酶SalI和NotI进行消化,将目的基因与真核表达质粒pREP-5N连接,获得重组真核表达质粒HcPS_H-5N.[结果]通过菌落PCR、双酶切及测序等方法进行鉴定,重组真核表达质粒HcPS_H-5N构建成功.制备酵母感受态,将重组质粒电击转入酵母中,酵母菌落PCR结果显示电击转化成功.[结论]成功构建盐穗木HcPS_H基因真核表达载体,并且能在真核细胞中正常表达.     

新疆野生盘羊TLR9基因的克隆·序列分析及其编码氨基酸结构预测

[目的]克隆鉴定新疆天山亚种野生盘羊Toll样受体9（TLR9）基因,预测其结构与功能,并对序列进行分析。[方法]以外周血液的总DNA为模板,运用PCR方法分3段克隆了新疆野生盘羊TLR9基因,PCR产物经凝胶回收纯化后测序,并运用分子生物学软件将测序结果进行分析及结构预测。[结果]克隆得到的新疆野生盘羊TLR9基因大小是3 192 bp,含1个完整的开放阅读框（ORF）,共编码1 064个氨基酸,其氨基酸组成中亮氨酸的含量高达18.51%,含有30个氨基酸的信号肽序列;在野生盘羊TLR9蛋白455～4757、40～760和780～800位氨基酸有3个跨膜区;新疆野生盘羊TLR9蛋白的3D结构是由胞外段富含亮氨酸的重复序列（LRR）和胞内段TIL（Toll/IL IR）结构域构成的。[结论]上述结构特征为TLR9发挥生物学功能奠定了基础,同时也为进一步研究新疆野生盘羊TLR9基因提供了理论依据。     

拟南芥bZIP23基因过量表达载体的构建及过表达植株的筛选

[目的]以拟南芥为材料克隆bZIP23基因,构建bZIP23基因的过量表达载体和筛选过表达植株,为验证其功能奠定基础.[方法]提取拟南芥总RNA和RT-PCR克隆bZIP23基因,用限制性内切酶切割和T4 DNA连接酶连接,使bZIP23基因连接到35S强启动子的pART27载体上;将连接产物转化到Trans1-T1感受态细胞中,筛选阳性单克隆进行菌落PCR鉴定并测序验证,获得重组质粒.将该重组质粒电激转化至根瘤农杆菌GV3101菌株,浸花法转化拟南芥野生型植株.[结果]通过单菌落PCR鉴定和DNA测序结果显示,bZIP23基因与35S过量表达载体已连接,获得了重组载体;抗性筛选与遗传鉴定获得相应的转基因过量表达阳性植株.[结论]构建的过量表达载体及筛选得到的过量表达植株为验证bZIP23基因功能奠定了基础.