短芒大麦钙依赖蛋白激酶基因的克隆与功能分析

【目的】克隆强抗寒性牧草短芒大麦钙依赖蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinase,CDPK)基因,分析其生理生化特性,为理想抗逆工程基因的筛选和利用奠定基础。【方法】采用RACE-PCR技术,获得短芒大麦CDPK基因全长cDNA序列;采用Northern杂交分析该基因在逆境条件下(低温(4℃)、干旱(200 g/L PEG6000)、盐(300 mmol/L NaCl)、激素(100μmol/L ABA))的表达模式;采用农杆菌介导的方法,对该基因编码蛋白进行亚细胞定位,并对转基因烟草的离子渗漏率和脯氨酸含量进行测定。【结果】获得了短芒大麦CDPK基因的编码序列,将其命名为HbCDPK;HbCDPK编码的蛋白是一个膜定位钙依赖蛋白激酶,该基因在短芒大麦根、幼苗叶片和成熟胚中均有表达;在低温、干旱、盐和ABA胁迫条件下处理不同时间,HbCDPK的表达丰度有差异,其在低温胁迫条件下的表达信号最强;转HbCDPK基因烟草相对离子渗漏率降低,脯氨酸含量升高。【结论】HbCDPK基因参与了低温胁迫信号转导,具有提高植物抗寒性的潜能。     

拟南芥AtCOR15a转化烟草及后代抗寒性研究

【目的】研究拟南芥AtCOR15a基因的抗寒功能。【方法】构建pCAMBIA1301-COR15a的植物表达载体,利用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,通过抗生素筛选和PCR检测获得转基因烟草。低温胁迫后,利用蒽酮法和酸式茚三酮法测定转基因烟草后代与野生型烟草的可溶性糖和脯氨酸含量,同时观察其抗寒能力。【结果】转基因烟草后代可溶性糖含量和脯氨酸含量均比野生型烟草有所提高,并在第5 d达到峰值。低温处理后转基因烟草后代能正常生长,而野生型烟草则全部死亡。【结论】生理生化指标的测定发现,可溶性糖含量与脯氨酸含量的变化趋势与烟草的抗寒性呈正相关,AtCOR15a基因导入烟草中可以明显提高烟草对低温胁迫的抵抗力。     

小黑杨PsnAP1基因转化烟草的研究

[目的]研究杨树APETALA1基因的功能,为缩短林木育种周期及杨树成花机理的研究提供参考。[方法]以杨树为研究对象,构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,并对转基因烟草进行分子水平鉴定。[结果]杨树APETALA1基因已经整合入烟草基因组中,且转基因烟草比野生型提早开花。[结论]杨树APETALA1基因能促进转基因植株开花,为研究杨树成花机理奠定了基础。     

脯氨酸代谢途径在调控水稻phyB突变体干旱胁迫耐性中的作用

本研究分析了水稻野生型和phyB突变体中脯氨酸代谢途径关键基因的表达水平。结果显示,干旱处理能够诱导脯氨酸生物合成相关基因OsP5CS1和OsOAT的表达,抑制脯氨酸生物降解基因OsP5CDH的表达。且phyB突变体中OsP5CS1基因的表达水平明显高于野生型,据此推测phyB负调控OsP5CS1基因的表达。为了分析OsP5CS1基因的高水平表达是否与phyB突变体较强的干旱胁迫耐性有关,本研究进一步培育了转OsP5CS1基因烟草。离体叶片失水速率结果表明,转基因烟草的失水速率小于野生型;盐胁迫条件下,转基因烟草的分化率明显高于野生型。综上所述,phyB对脯氨酸代谢途径的调控是phyB突变体具有较强干旱胁迫耐性的重要因素之一。     

小黑杨PsneIF5A2/4基因植物表达载体的构建及在烟草中的转化研究

[目的]研究杨树eIF5A基因的功能,为林木抗性育种研究提供参考。[方法]构建植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草叶盘,并对转基因烟草进行分子水平鉴定。[结果]杨树eIF5A基因已经整合入烟草基因组中,且转基因烟草比野生型烟草叶片抗重金属能力提高。[结论]杨树eIF5A基因能促进转基因烟草的抗胁迫能力,为林木抗逆育种机理奠定了理论基础。     

农杆菌介导BtCry1Ac、NTHK1双价基因转化烟草植株的研究

为探讨多基因植物转化载体p096899中外源基因BtCry1Ac和NTHK1在转基因植株中的表达情况,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化野生烟草,经卡那霉素筛选,初步获得了10株转基因烟草植株.经PCR鉴定,证明目的基因已被整合到烟草基因组中.利用荧光定量PCR和ELISA分析目的基因在转录水平和翻译水平的表达量,并对转基因烟草株系进行了抗虫试验和耐盐性试验.结果表明,目的基因在转录水平和翻译水平分别得到表达,但表达量存在差异,其中2号转基因株系毒蛋白表达量最高,其含量达可溶性总蛋白的0.028 5％;饲虫试验中,部分转基因烟草株系对斜纹夜蛾的毒杀作用明显高于未转化烟草,其中2号转基因株系的抗虫性最高,饲喂第6天斜纹夜蛾幼虫死亡率达到75.56％,与Bt毒蛋白表达量相一致;在盐胁迫下,转基因烟草的叶片生长状况均好于对照(非转基因)烟草的生长.证明BtCry1Ac基因和NTHK1基因的转入在一定程度上提高了烟草的抗虫性和耐盐能力.     

AtNHX1提高烟草耐盐性的研究

[目的]探讨利用AtNHX1基因提高烟草耐盐性的效果。[方法]利用农杆菌侵染的方法对烟草的叶盘进行遗传转化,将拟南芥的液泡膜Na＋/H＋逆向转运蛋白基因AtNHX1成功地转入了烟草中,对获得的28株潮霉素抗性转基因植株中的6株进行了Southern检测,并用200mmol/LNaCl对转基因植株进行盐分胁迫与耐盐性鉴定。[结果]分子检测表明,AtNHX1已经整合到烟草的基因组中,并得到了表达。在盐分胁迫下,各转基因株系具有较高的光合速率和PSⅡ活性,光合速度和Fv/Fm值均显著高于野生型对照,株系T1、T5的SOD酶活分别是野生型的1.8和2.1倍,各转基因株系GR活性也均显著高于野生型,而MDA含量则低于野生型。[结论]转At-NHX1基因的各株系的耐盐性较野生型对照有了较大程度的提高。     

转拟南芥P5CS1基因羽衣甘蓝的抗寒性

为提高羽衣甘蓝的抗寒性,本试验将拟南芥△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS1)基因经农杆菌介导转入羽衣甘蓝植株中,检测转基因株系在4℃低温胁迫下P5CS1 mRNA表达量、幼苗脯氨酸含量、可溶性糖含量、相对电导率、叶绿素荧光参数(Fv/Fm)和植株存活率。结果显示,在4℃低温胁迫下,转基因植株的P5CS1基因的mRNA过量表达,脯氨酸含量、可溶性糖含量、Fv/Fm和植株存活率均显著高于野生型对照(P0.05),但丙二醛含量和相对电导率均显著低于野生型对照(P0.05)。表明拟南芥P5CS1基因在羽衣甘蓝中的表达明显改善了转基因植株的抗寒性。     

公农2号紫花苜蓿抗寒基因CAS19在烟草中的表达

[目的]研究公农2号紫花苜蓿抗寒基因CAS19在烟草中的表达。[方法]根据苜蓿抗寒基因（CAS19）核酸序列设计1对引物,用RT-PCR扩增出分离CAS19的蛋白基因,并克隆到pMD18-TVector载体中,再亚克隆到表达载体PBI121,成功构建重组表达质粒PB-CAS。经农杆菌介导转基因入烟草,并通过Sounthern-blotting杂交分析检测转基因苗。[结果]CAS19抗寒基因可以在烟草中得以高效表达。[结论]为进一步探明CAS19抗寒基因在烟草中的表达机制提供了理论依据。     

公农2号紫花苜蓿抗寒基因CAS19在烟草中的表达(摘要)(英文)

[目的]研究公农2号紫花苜蓿抗寒基因CAS19在烟草中的表达。[方法]根据苜蓿抗寒基因(CAS19)核酸序列设计1对引物,用RT-PCR扩增出分离CAS19的蛋白基因,并克隆到pMD18-T Vector载体中,再亚克隆到表达载体PBI121,成功构建重组表达质粒PBCAS。经农杆菌介导转基因入烟草,并通过Sounthern-blotting杂交分析检测转基因苗。[结果]CAS19抗寒基因可以在烟草中得以高效表达。[结论]该研究为进一步探明CAS19抗寒基因在烟草中的表达机制提供了理论依据。     

短芒大麦DREB2基因的克隆及其转基因烟草的鉴定

以短芒大麦为材料,应用RT-PCR技术扩增获得792 bp的DREB2基因,构建了重组植物表达载体pBI-DREB2。通过农杆菌转化法将其导入烟草,并利用PCR、PCR-Southern和RT-PCR技术对获得的20株卡那霉素阳性转基因烟草进行分子鉴定。结果表明:短芒大麦DREB2基因已整合到烟草基因组中,并能在转录水平上表达。     

紫大麦草中DREB类转录因子基因Hvi917DREB2的克隆、原核表达及序列分析

DREB类转录因子是一类与植物逆境胁迫响应相关的重要蛋白,本研究利用同源克隆方法和RACE技术从紫大麦草(Hordeum violaceum)中分离到1个DREB类转录因子基因,命名为Hvi917 DREB2。序列分析表明Hvi917 DREB2基因含有1个792bp的开放阅读框,编码264个氨基酸残基,含有1个保守的AP2结构域,属于AP2大家族。该基因编码的氨基酸序列与Genebank中短芒大麦草AP2蛋白HbDREB2、DREB1(登录号分别为:AAU29412.1和AER42620.1)具有99%的氨基酸序列一致性。将该基因构建成原核表达载体,经IPTG诱导表达了1个分子量为34.5kD的蛋白。     

紫茎泽兰类黄酮3′-羟化酶在烟草中的表达

 【目的】研究紫茎泽兰F3′H在次生代谢途径中的功能。【方法】构建了F3′H过表达载体,并将其转入烟草体内,进一步通过半定量RT-PCR和Real-time PCR检测F3′H的表达情况。【结果】F3′H在烟草体内能正常表达,但在开花后则受到抑制,表现为转F3′H烟草花色较野生型变淡,F3′H表达量低于野生型表达量。【结论】F3′H与次生代谢途径中花色素的形成密切相关,且转入烟草体内时,其表达与烟草内源基因表达相互影响,导致烟草的花色变淡。     

短芒大麦DREB1基因的克隆与特性分析

在已知短芒大麦DREB1基因3′端序列的前提下,根据其他植物中DREB1转录因子基因序列,首次克隆了短芒大麦全长DREB1基因(899 bp,具有1个编码220个氨基酸的完整阅读框)。序列分析和生物信息学分析表明,该基因具有转录因子的典型特征及AP2/EREBP结构域,并且具有6个丝氨酸、2个苏氨酸、2个酪氨酸磷酸化位点,这可能与翻译后在冷胁迫抗性中发挥作用有关。     

披碱草和野大麦及其杂种回交后代的农艺特性研究

[目的]探明BC1F3代对亲本(披碱草和野大麦)优良特性的继承情况、杂种优势及育性恢复情况。[方法]重点对披碱草和野大麦及其BC1F3代的农艺性状,包括生育期、生长速度、花粉育性、结实性、再生性和株丛鲜草产量等进行系统的比较研究。[结果]BC1F3代各株系的生长节律趋向于亲本野大麦,不同株系的生育天数有所不同,但都接近轮回亲本野大麦;BC1F3代不同株系花粉育性和结实性有较大差异,但回交后各株系的花粉育性和结实性都有一定程度的提高,YF3-93花粉育性已经超过亲本野大麦,自然结实率也较高。有的株系花粉育性和开放授粉结实率较低,如PF3-52。BC1F3代各株系产草量有较大变异,不同株系间存在明显的差异,如YF3-64、YF3-74和YF3-83的杂种优势分别为75.53%、75.12%和66.16%,而PF3-52、PF3-15、YF3-42产草量不及亲本。[结论]该研究为培育适合干旱、盐渍生境的牧草新品种提供了依据。     

茶树CsCBF1基因表达载体的构建及其转基因烟草的抗寒性分析

【目的】通过转基因烟草验证茶树CsCBF1基因抗寒性功能,为发掘、筛选茶树重要功能基因提供理论依据。【方法】 利用根癌农杆菌介导法将构建的表达载体pBI121-CsCBF1导入烟草,通过PCR、RT-PCR和GUS活性染色鉴定外源CsCBF1基因是否导入并整合到烟草基因组上转录表达。然后将转pBI121-CsCBF1型、转pBI121型和野生型烟草分别置于25,4和0 ℃下处理48 h后,检测其膜质通透性、丙二醛（MDA）含量和叶绿素荧光参数Fv/Fm,并将0 ℃处理3 d的转pBI121-CsCBF1型和野生型烟草置于25 ℃下培养1周后观测恢复表型和统计死亡率。【结果】 成功构建表达载体pBI121-CsCBF1,PCR、RT-PCR和GUS活性染色证明,CsCBF1已整合到烟草基因组中并转录表达。25 ℃处理下,转pBI121-CsCBF1型、转pBI121型和野生型烟草的膜质通透性、丙二醛含量和Fv/Fm均无显著差异,而在4和0 ℃处理下,转pBI121-CsCBF1型烟草的膜质通透性和丙二醛含量均显著低于转pBI121型和野生型烟草,但Fv/Fm显著高于转pBI121型和野生型烟草。生长恢复试验中,转pBI121-CsCBF1型的存活率为66.7％,而野生型仅为23.3％。【结论】 茶树CsCBF1基因能够显著增强非低温驯化植物烟草的抗寒性,说明茶树CsCBF1基因存在于细胞抗寒的分子调控途径中,从而提高植物细胞的低温防御能力。     

披碱草和野大麦及其杂种回交后代的农艺特性研究

为了使披碱草和野大麦的优良特性综合在一起，培育出适合干旱、盐渍生境的牧草新品种，王照兰等（1992—1993年）将披碱草和野大麦组合进行了远缘杂交，成功地获得了高度不育的披碱草和野大麦的正、反交F1代。在正交F1代（披碱草X野大麦）的植株形态学和细胞学初步研究的基础上，笔者拟定了用回交法克服杂种F1代不育性的研究计划。用分株繁殖方法，     

野大麦盐胁迫rbcS基因的克隆及序列分析

[目的]对野大麦盐胁迫rbcS基因进行克隆及序列分析。[方法]以盐胁迫下的野大麦幼嫩叶片为试材,根据GenBank中小麦和大麦rbcS基因核酸序列的同源性设计引物,对野大麦基因组DNA进行PCR扩增、回收、连接、转化及测序。[结果]在野大麦的基因组中克隆了2个大小不同的rbcS基因序列rbcS1和rbcS2,长度分别为1252和908bp。rbcS1和rbcS2均由2个外显子和1个内含子组成,外显子长度相等,编码序列为525bp,同源性为96%,编码174个氨基酸;rbcS1和rbcS2内含子大小不同,分别为448和107bp。[结论]为进一步探讨rbcS基因在野大麦耐盐机制中的分子机制奠定了基础。