ApoCⅢ转基因小型猪的表型特征

应用体细胞核移植方法制备ApoCⅢ转基因小型猪,并分析其表型特征。通过血浆脂质检测、口服脂肪负荷试验、肝素后血浆脂蛋白酶活性测定以及静脉葡萄糖耐量试验,分析转基因小型猪的脂质和糖代谢特点。该小型猪表现出显著的高甘油三酯血症,与非转基因小型猪相比,转基因小型猪对甘油三酯(TG)的清除显著延迟,且肝素后血浆脂蛋白脂酶活性也显著降低,但静脉糖耐量未有改变。     

hApoCⅢ转基因小型猪的生物安全初步评估

为评估hApoCⅢ转基因小型猪的环境生物安全性,采用PCR技术,通过检测其粪便、接触的土壤、肠道菌、代孕母猪的血液DNA以及与之接触的普通猪DNA是否发生了水平基因转移。同时通过大鼠90d经口毒性试验,检测大鼠的血液、生理生化指标和脏器系数是否发生了显著性变化。结果显示:与对照组相比,hApoCⅢ转基因小型猪的肠道内微生物菌群、普通猪的血液和代孕母猪的血液、周围环境土壤都没有发生基因水平转移现象。与对照组相比,试验组大鼠各项观察指标及病理检测均正常,血液、生化指标均在正常范围;初步显示hApoCⅢ转基因小型猪对生物环境是安全的,没有对环境造成不利影响。     

载脂蛋白CⅢ刺激猪主动脉血管内皮细胞差异表达基因的研究

本研究旨在探究载脂蛋白CⅢ (ApoCⅢ)刺激猪主动脉血管内皮细胞前后的差异基因表达谱,从而揭示ApoCⅢ的功能。利用酶解法成功分离猪主动脉血管内皮细胞并进行体外培养,采用高通量测序技术筛选出ApoCⅢ刺激前后的差异表达基因。结果表明,ApoCⅢ刺激猪主动脉血管内皮细胞前后共有647个差异表达基因,包括390个上调表达基因和257个下调表达基因。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测表明,高通量测序数据结果正确可靠。GO及Pathway分析结果显示,差异表达基因的功能涉及免疫应答、细胞凋亡及死亡等。这表明ApoCⅢ可通过炎症反应、细胞黏附、细胞凋亡等分子通路影响猪主动脉血管内皮细胞的生理功能,为进一步解析ApoCⅢ引发动脉粥样硬化发生的分子机制提供了理论基础。     

从江香猪ApoC3基因的克隆及亚细胞定位研究

为了观察从江香猪载脂蛋白C3(ApoC3)基因及其表达产物在真核细胞中的亚细胞定位情况,以脂肪型小型猪从江香猪为研究对象,克隆ApoC3基因CDS区,构建携带有绿色荧光蛋白的pEGFP-C1-ApoC3重组质粒,转染HEK-293T细胞。结果显示:从江香猪ApoC3基因与GenBank上公布的序列相比,在141位有1个碱基发生转换,由腺嘌呤(A)突变成鸟嘌呤(G),为无义突变;对ApoC3蛋白的亚细胞定位分析表明,该蛋白在胞外基质占55.6%,内质网占22.2%,液泡占11.1%,细胞质占11.1%。pEGFP-C1-ApoC3重组质粒转染HEK-293T细胞后的荧光共定位结果显示,ApoC3蛋白在细胞中表达部位与PSORT II Prediction软件预测结果一致。本研究结果为进一步构建ApoC3基因转基因动物模型,开展ApoC3基因的多态性变化而导致的相关疾病研究奠定了基础。     

载脂蛋白CⅡ基因在猪肝脏组织中的发育性表达研究

试验旨在探究载脂蛋白CⅡ(apolipoprotein Ⅱ,ApoCⅡ)基因mRNA在马身猪和大白猪肝脏组织中的发育性表达规律,揭示ApoCⅡ基因表达水平与猪脂质代谢之间的关系。采用实时荧光定量PCR技术检测了马身猪和大白猪1~180日龄(1、30、60、90、120、150和180日龄)肝脏组织中ApoCⅡ基因mRNA表达。结果表明,马身猪和大白猪肝脏组织ApoCⅡ基因mRNA发育性变化趋势存在差异,马身猪ApoCⅡ表达量从1日龄到60日龄逐渐降低,在90日龄时上升,之后逐渐降低;而大白猪从1日龄到150日龄呈现逐渐降低趋势,180日龄时回升。1日龄时,马身猪和大白猪肝脏中ApoCⅡ基因mRNA的表达量差异不显著(P>0.05),在其他阶段,两品种间的表达量存在显著或极显著差异(P<0.05或 P<0.01)。这表明肝脏中ApoCⅡ mRNA的表达具有显著的日龄依赖性和明显的品种差异性,其表达可能对猪脂质代谢有显著影响。     

小型猪复合麻醉颉颃剂对大鼠各脑区p-p38蛋白及c-myc mRNA表达的影响

旨在研究小型猪复合麻醉颉颃剂对大鼠不同脑区p-p38蛋白及c-myc mRNA表达的影响,探讨小型猪复合麻醉颉颃剂的催醒机制。将18只大鼠随机分为C组(对照组)、J组(麻醉颉颃剂组)。J组又分为2个亚组,即J1组(注射小型猪专用复合麻醉颉颃剂5min)、J2组(注射小型猪专用复合麻醉颉颃剂1h)。各组大鼠到达相应的时间点后断头处死,分离大脑皮层、小脑、海马、脑干和丘脑,用Western blot的方法检测p-p38蛋白的表达量,实时荧光定量PCR方法检测c-myc基因mRNA的转录量。试验结果显示大鼠大脑皮层、丘脑和脑干的p-p38蛋白和c-myc mRNA的相对表达量显著升高,而小脑和海马的p-p38蛋白和c-myc mRNA的相对表达量显著降低。综合试验结果,小型猪复合麻醉颉颃剂能够影响p-p38蛋白和c-myc mRNA的表达,这可能是其产生催醒作用的机制之一。     

从江香猪ApoA1、ApoC3、ApoE基因在组织器官中表达差异分析

为研究载脂蛋白A1(ApoA1)、载脂蛋白C3(ApoC3)、载脂蛋白E(ApoE)基因在从江香猪不同组织中的表达差异情况,试验采用荧光定量PCR法,分析了ApoA1、ApoC3、ApoE 3个基因在从江香猪同一组织器官和不同组织器官中的表达差异情况。结果表明:在不同组织器官间ApoA1、ApoC3、ApoE 3个基因表达量均存在一定差异,且在肝脏中3个基因表达量最高;3个基因在肝脏中的表达量与其他组织器官相比差异显著(P0.05),说明3个基因主要在肝脏中发挥生理功能;在相同组织器官内,3个基因除在肝脏中表达量无显著差异外(P0.05),在其他组织中均存在显著差异(P0.05),说明3个基因在其他组织器官中功能各有差异。     

pEGFP-C1-ApoE真核表达载体的构建及在HEK-293T细胞中的表达

载脂蛋白E是决定血浆胆固醇水平的重要遗传因素之一,其作为多种脂蛋白的结构蛋白,在脂类的运输和代谢中起着非常重要的作用。本文以脂肪型小型猪从江香猪为研究对象,通过克隆从江香猪载脂蛋白E(ApoE)基因CDS区,构建携带有绿色荧光蛋白的p EGFP-C1-ApoE重组质粒,转染HEK-293T细胞,旨在研究ApoE基因表达产物在真核细胞中的表达情况。序列比对结果表明,从江香猪ApoE基因与Gen Bank上公布的野猪序列相比,有8处发生了碱基突变,其中7处发生在C和G之间,另一处103位T→C的碱基突变,导致丝氨酸(S)突变为稀有密码子脯氨酸(P),使ApoE基因稀有密码子由23个增加到24个;生物信息学分析发现,突变后从江香猪ApoE基因二级、三级结构,蛋白理化性质均发生了改变。信号肽预测软件发现,ApoE蛋白在1-18位氨基酸残基位具有信号肽。荧光共定位实验结果表明,ApoE蛋白在细胞中表达部位与软件预测结果一致,均在细胞质中表达。相关研究为进一步构建ApoE基因转基因动物模型奠定基础。     

神经内分泌因子对新生犊牛肝细胞MTP mRNA丰度的影响

微粒体甘油三酯转运蛋白(MTP)是继载脂蛋白B(apoB)之后发现参与TG转运及VLDL组装的内质网腔内蛋白,是一种重要的脂质转运蛋白.MTP主要作为载体在内质网腔与含脂蛋白的apoB等脂类结合以VLDL的形式转运出肝脏,对含脂蛋白的apoB装配和分泌起关键作用[1].     

F_1代转CuZnSOD基因猪的制备与研究

为进一步研究CuZnSOD基因对肉质表达调控的作用机理,探究通过磁性纳米颗粒介导精子载体法制备转基因猪的可行性。本试验在重组质粒先后与磁性纳米颗粒和精液共孵育的基础上,再通过人工授精获得F1代仔猪。对繁殖得到的F1代个体进行PCR、荧光定量PCR及Western blot检测,对屠宰的4头阳性猪采用绝对定量PCR进行转基因拷贝数鉴定,F1代个体达100kg左右时抽样屠宰进行肉质及抗氧化性能测定。结果表明,F1代阳性率为30.23%。阳性组CuZnSOD在5种组织中的RNA和蛋白水平上的表达量较阴性组均上调。本试验得到的标准曲线:ΔCt=-3.121 6lgN+17.281(R2=0.992 1,P0.001),4头阳性猪中外源基因拷贝数分别为25.89、80.61、106.69、83.03。肉质及抗氧化性能测定结果显示,阳性组肌肉滴水损失显著低于阴性组(P0.05);阳性组肌肉T-SOD1d、T-SOD2d活性显著高于阴性组,MDA1d、MDA2d含量显著低于阴性组(P0.05)。研究结果表明:CuZnSOD基因的过表达可以提高肌肉的抗氧化性能,降低滴水损失,进而改善肉质,同时,证明磁性纳米颗粒介导的精子载体法可以用于制备转基因动物。     

新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞体外培养体系的建立

利用微量液体组织块贴壁法原代培养分离新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞,进行常规传代培养、冷冻和复苏;通过接触抑制和解除抑制研究该类细胞的增殖潜力,免疫荧光进行鉴定;并通过脂质体介导对分离到的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞分别进行EGFP-N1和DsRed-N1基因转染。结果成功分离到新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞,体外可以大量传代和冷冻,目前已经传至50代以上,生长良好;冷冻复苏和接触抑制解除后仍可以正常培养和传代;细胞免疫荧光检测,波形蛋白表达阳性,角形蛋白表达阴性;转染48h后荧光显微镜下可以观察到绿色荧光和红色荧光,表明瞬时转染新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞可以获得成功,其中转染DsRed-N1基因的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞已经传至60代以上。结果表明,本试验成功建立了新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞的体外培养体系,在体外能稳定培养和传代,并可以成功获得转基因的新生广西巴马小型猪肾成纤维细胞。     

贵州小型猪血液生化指标检测

为了测定、分析贵州小型猪血液生化指标,试验对幼龄、青年、老龄3个年龄段43头贵州小型猪进行了血液生化指标检测分析.结果表明:贵州小型猪多个血液生化指标在不同年龄段的差异极显著(P<0.01)或显著(P<0.05),并有近1/2项目随月龄的增长呈增长或下降的趋势,其余项目在青年段增高之后在老龄段下降.     

转人血清白蛋白基因猪的表达分析

整合有人血清白蛋白基因的转基因猪 ,经琼脂糖扩散、蛋白质电泳、Western杂交等分析 ,发现 3头转基因猪不同程度地表达了人血清白蛋白 ,其中最高表达水平为 2 0 3mg/mL。     

转基因猪在武汉问世

6月27日,湖北省农科院对外公布:含人类基因、其血液能取代人血提取"医用白蛋白”的"转基因猪”正式问世武汉. 湖北省农科院生物所转基因课题组经过10多年的研究,成功地在国内首次用转基因猪表达人的血清蛋白.打日,在该所的试验猪场里,记者见到3头转基因猪.华中农业大学生命科学院测定,其中蛋白最高表达量为20.3g/L,是目前国内外转基因动物肝脏表达外源蛋白的最高水平.     

猪乙型脑炎病毒E蛋白结构域Ⅲ原核表达和抗原性分析

为分析猪乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白Ⅲ结构域的抗原性,本研究克隆了JEV疫苗株SA14-14-2的E蛋白结构域Ⅲ,并通过pET-28a载体进行融合表达和纯化。用纯化后蛋白作为免疫原,免疫8周龄BALB/c小鼠,通过SDS-PAGE、Western blotting、间接ELISA及间接免疫荧光方法(IFA)检测小鼠及猪抗体滴度,验证E蛋白结构域Ⅲ的抗原性。SDS-PAGE结果表明融合蛋白以包涵体形式表达;Western blotting、间接ELISA检测结果表明表达产物具有良好的抗原性;纯化的蛋白免疫BALB/c小鼠ELISA方法检测特异性抗体滴度可达1×10⁵;猪JEV阳性血清ELISA抗体滴度可达5.1×10⁴;IFA结果表明JEV E Ⅲ蛋白产生的抗血清能很好的识别乙型脑炎病毒抗原。以上结果表明,表达、纯化的重组JEV E Ⅲ蛋白具有良好的抗原性。本试验结果为建立以E蛋白结构域为抗原的诊断方法提供了重要依据。     

外源hDAF基因在转基因猪中的表达研究

衰变加速因子(DAF)是补体激活途径中的一个重要调节蛋白,转人DAF(hDAF)基因猪可以作为异种器官移植的供体.采用直接免疫荧光法对转hDAF基因猪耳组织冰冻切片进行了观察,并应多媒体图文分析系统测定荧光照片的平均灰度.结果表明,14头转基因猪中,有7头动脉肌肉展表达了外源hDAF基因,它可以作为外源基因在供体中表达的主要指标,用于转基因猪的检测.     

猪PLTP基因的PCR扩增及多态性检测

磷酸脂转运蛋白(PLTP)是脂代谢中重要的转运蛋白之一,在机体脂类代谢中主要介导高密度脂蛋白(HDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)间的磷酸脂转移,具有调控动脉粥样硬化(AS)、降低血浆HDL水平等作用.对云南大河猪85个血样进行了DNA的提取及检测,PCR扩增PLTP基因并进行PCR-RFLP分析(HaeⅢ).结果表明,PLTP基因具有丰富的多态性,为今后研究该基因的生物学功能提供了依据.     

广西巴马小型猪BMP2基因克隆、生物信息学及组织表达分析

本研究旨在对广西巴马小型猪骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic proteins 2,BMP2）基因进行克隆及其结构和功能的预测,并检测其在广西巴马小型猪和长白猪中的表达差异。以广西巴马小型猪基因组DNA为模板,通过测序鉴定BMP2基因外显子区的单核苷酸多态性（SNPs）,利用多种生物信息学软件对广西巴马小型猪BMP2基因启动子区、编码区（CDS）、3'UTR区进行了分析,预测分析广西巴马小型猪BMP2基因编码蛋白的基本理化性质、磷酸化位点、O-糖基化位点、跨膜区域、亲疏水性、蛋白质修饰结构、二级结构和三级结构等,并对miRNA结合位点及其相关通路进行分析,绘制了广西巴马小型猪和长白猪的组织表达谱。结果显示,试验成功克隆了广西巴马小型猪BMP2基因CDS区,总共1 188 bp,编码395个氨基酸;与猪参考基因组相比,广西巴马小型猪BMP2基因在G1663A、G1897C发生了同义突变,在C1896T（Pro→Leu）、T1971C（Gly→Ser）、G2000A（Leu→Ser）发生了3处错义突变;在3'UTR区域存在miR-142-5p、miR-129-5p等共13个miRNA结合区域;相似性比对结果显示,广西巴马小型猪与野猪、黄牛、水牛、山羊、绵羊、马、澳洲野犬、家犬、猕猴对应区段的相似性依次为99.92%、91.75%、91.84%、91.92%、91.92%、90.50%、89.43%、90.91%和90.91%;系统进化树结果表明,广西巴马小型猪与野猪的亲缘关系最近,与黄牛的亲缘关系相对较近,与猕猴亲缘关系较远;BMP2蛋白分子质量为44.55 ku,理论等电点为8.37,预测其有12个O-糖基化位点,42个磷酸化位点;预测分析发现该蛋白为亲水性蛋白,且是膜外蛋白。组织表达谱发现,广西巴马小型猪生长板软骨中BMP2基因表达量显著低于长白猪（P<0.05）。该研究为进一步探索广西巴马小型猪中BMP2基因的功能提供了理论基础,也为广西巴马小型猪品种资源的利用提供了重要参考。     

猪支原体肺炎亚单位疫苗的免疫应答

利用分子克隆、定点突变以及重组表达技术获得猪肺炎支原体的主要免疫原蛋白p36、p46、p65和p97R1-Nrdf。设立以重组蛋白p36、p46和p65为试验Ⅰ组,以p36、p46、p65和p97R1-Nrdf为试验Ⅱ组,猪支原体疫苗安百克（M＋PAC）为试验Ⅲ组,PBS＋佐剂为空白对照组来免疫BALB/c小鼠。检测小鼠血清、肺脏以及经蛋白刺激脾淋巴细胞的猪肺炎支原体抗体、IFN-γ和IL-4。结果显示,Ⅱ组的猪肺炎支原体抗体水平极显著高于Ⅰ、Ⅲ组（P〈0.01）;Ⅱ组IFN-γ水平极显著高于Ⅲ组,而Ⅱ组与Ⅰ组、Ⅰ组与Ⅲ组的IFN-γ水平无显著差异（P〈0.05）;但Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组的IL-4水平差异不显著（P〈0.05）,但都极显著高于对照组（P〈0.01）;肺的检测结果中猪肺炎支原体抗体、IFN-γ和IL-4水平呈现一致性,都为Ⅱ组〉Ⅰ组〉Ⅲ组〉对照组;而经刺激脾淋巴细胞检测结果为Ⅱ组的猪肺炎支原体抗体和IFN-γ水平最高,而IL-4水平为Ⅲ组最高。由此可见,Ⅱ组通过激活体液免疫和细胞免疫途径,产生的猪支原体肺炎抗体水平最高;Ⅰ组亦能通过这2种免疫途径达到与Ⅲ组同样的免疫效果。     

STC-1基因在大、小体型猪中表达与分布的差异分析

试验分别采集40日龄小体型猪（巴马猪）和大体型猪（大白猪）的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、头骨、骨骼肌组织,利用实时荧光定量PCR检测斯钙素-1（stanniocalcin 1,STC-1）基因mRNA在各个组织中的表达水平,并通过Western blotting检测STC-1蛋白在各个组织中的分布。实时荧光定量PCR检测结果表明,STC-1基因mRNA在巴马猪和大白猪肺脏、肾脏中相对表达水平较高,在骨骼肌中的表达水平最低;除心脏和骨骼肌外,巴马猪其余各组织中STC-1基因mRNA表达水平均显著高于大白猪（P < 0.05）。Western blotting检测结果表明,巴马猪肝脏中STC-1蛋白的表达量最高,而大白猪脾脏中STC-1蛋白表达量最高,两者差异显著（P < 0.05）;巴马猪肺脏、肝脏、骨骼肌及心脏组织中STC-1蛋白表达量均极显著高于大白猪（P < 0.01）;而巴马猪肾脏、脾脏中STC-1蛋白表达量极显著低于大白猪（P < 0.01）。本研究首次对大、小体型猪不同组织的STC-1基因mRNA表达水平及其STC-1蛋白分布进行检测,导致该基因表达与分布差异的原因可能与两种猪受外界环境应激及生长发育差异有关。