口蹄疫病毒VP2基因重组表达载体的构建及其稳定表达细胞系的建立

本试验旨在构建Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)的VP2基因重组表达载体,并建立稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系。利用RT-PCR方法扩增Asia 1型FMDV的cDNA,获得VP2基因完整的编码区,构建可表达VP2的带有绿色荧光蛋白标记基因的pIRES2-EGFP-VP2重组表达载体。经鉴定正确后,利用LipofectamineTM2000将重组质粒转染293T细胞,通过Western Blot技术检测VP2蛋白的瞬时表达;然后再转染BHK-21细胞,通过G418筛选,形成单克隆细胞系,经荧光筛选到表达EGFP的抗性单克隆细胞,扩繁培养克隆细胞,再通过West-ern Blot技术检测其VP2的表达,最终筛选到稳定表达FMDVVP2基因的BHK-21细胞系。结果表明,VP2基因重组表达载体pIRES2-EGFP-VP2构建正确,能够在293T细胞内瞬时表达;转染BHK-21细胞,经G418筛选到表达VP2基因的BHK-21细胞克隆,经长达60d的传代,获得了稳定表达VP2基因和EGFP的BHK-21细胞系。上述结果表明,我们建立了稳定表达VP2基因的BHK-21细胞系,为进一步探讨VP2基因在FMD...     

表达O型口蹄疫病毒VP1蛋白的重组塞内卡病毒的构建与鉴定

A型塞内卡病毒(SVA)是近年来新流行的一种传染性病原，与口蹄疫病毒(FMDV)具有相似的基因组结构，所致临床症状也十分相似。为了研发一种新型的基因工程活载体疫苗，用于预防塞内卡病毒感染和口蹄疫，以SVA全长感染性克隆pSVA-GX01为基础，在SVA 2A与2B基因之间插入O型FMDV的VP1基因，经双酶切及测序鉴定，成功获得了重组质粒pSVA-FMDV-VP1-O。将重组质粒转染BHK-21细胞，拯救获得重组病毒rSVA-FMDV-VP1-O,间接免疫荧光试验鉴定显示，该重组病毒可在细胞中表达O型FMDV的VP1蛋白。对该重组病毒进行体外生长增殖特性以及遗传稳定性分析表明，重组毒株和亲本毒株在BHK-21细胞上具有相似的增殖特性，插入的FMDV VP1基因可在细胞传代过程中稳定存在6代。研究结果为开发以塞内卡病毒为载体构建表达口蹄疫病毒VP1蛋白的重组基因工程活载体疫苗提供了参考。     

逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体基因和绿色荧光蛋白基因在BHK-21细胞中的表达

为建立逆转录病毒载体介导的口蹄疫病毒衣壳前体蛋白哺乳动物细胞表达体系,将口蹄疫病毒（FMDV）衣壳前体基因（P1）和绿色荧光蛋白基因（EGFP）依次插入逆转录病毒载体pBABEpuro构建重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP。将重组逆转录病毒载体和pVSV-G质粒载体共转染GP2-293包装细胞,用产生的重组逆转录病毒感染幼仓鼠肾细胞（BHK-21）。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达,用嘌呤霉素筛选抗性细胞,间接免疫荧光方法检测细胞中FMDV衣壳前体蛋白的表达。结果表明,重组逆转录病毒载体pBABEpuro-P1-2A-EGFP构建正确,绿色荧光蛋白和FMDV衣壳前体蛋白在细胞中能稳定表达。FMDV衣壳前体蛋白基因细胞表达体系的成功建立为进一步开展口蹄疫亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

短发夹结构RNA对口蹄疫病毒2B基因瞬时表达的抑制

为探讨siRNA在哺乳动物细胞中对口蹄疫病毒（FMDV）2B基因的抑制作用,针对WFL株FMDV的2B基因,设计了4个siRNA,并将shRNA表达模板插入pSilencer1.0-U6载体,构建shRNA表达质粒,将其与含绿色荧光蛋白报告基因的pEGFP＋2B融合表达质粒瞬时共转染BHK-21细胞,以荧光显微镜和流式细胞仪检测荧光表达量的变化,以实时定量RT-PCR法检测对2B基因mRNA的抑制作用。结果表明,本试验所构建的针对2B基因的shRNA表达载体可以在BHK-21细胞中抑制2B基因的瞬时表达。     

TPL2促进口蹄疫病毒在BHK-21细胞复制

为研究肿瘤进行性位点2(TPL2)在仓鼠肾细胞(BHK-21)中对口蹄疫病毒(FMDV)复制的影响,使用FMDV感染BHK-21细胞,通过qRT-PCR技术检测FMDV感染对内源性TPL2转录水平的影响;根据GenBank公布的TPL2基因序列(NM007746.2)设计构建TPL2的真核表达质粒以及设计并合成宿主TPL2的RNAi序列,利用脂质体方法转染BHK-21细胞,通过qRT-PCR和Western blotting技术分析TPL2在BHK-21细胞过表达和干扰对FMDV复制的影响。结果表明,FMDV感染BHK-21细胞后,TPL2转录水平显著上调;过表达TPL2能够促进FMDV在BHK-21细胞中复制,而下调表达内源性TPL2后FMDV的复制受到抑制,表明TPL2促进FMDV在BHK-21细胞中进行复制,本结果进一步拓展了我们对FMDV与天然免疫机制之间关系的认识,同时为TPL2的相关研究积累了科学资料。     

表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株的构建及筛选

为构建和筛选表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的山羊痘病毒弱毒株,用已构建的口蹄疫病毒O/Chi-na99毒株的EGFP-P7.5-P1-2A-3C基因整体通过平末端连接到KpnⅠ酶切后的线性载体pUC119-TK中,得到重组载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C。重组载体通过缺失的TK基因与羊痘病毒弱毒株在BHK-21细胞中同源重组,用EGFP作为标记筛选出重组毒株,并进行PCR鉴定、抗原捕获ELISA试验检测及Western blot分析。结果显示该重组弱毒株能在1~10代BHK-21细胞中稳定传代,扩增出约3000bp片段,并经测序确证为基因P1-2A-3C;抗原捕获ELISA试验检测均为阳性;Western blot分析表明转移载体pUC119-TK-EGFP-P7.5-P1-2A-3C在感染的GTPV AV41BHK-21细胞中表达的蛋白可被O型FMDV高免血清特异性识别,并具有反应原性。这些结果表明获得了表达O型口蹄疫病毒P1-2A-3C基因的重组山羊痘弱毒株。     

共表达O型FMDV衣壳蛋白和绿色荧光蛋白重组腺病毒的构建

为构建表达O型口蹄疫病毒(FMDV)的P12A3C基因及GFP基因的重组腺病毒rAdV-P12aEGFP2a3C,本研究以FMDV的2A基因序列为Linker,将报告基因EGFP插入FMDV的P12A与3C之间。重组腺病毒感染HEK-293细胞后可以观察到绿色荧光,表明EGFP蛋白获得表达。应用FMDV的VP2单克隆抗体4B2对重组病毒感染细胞进行western blot检测,反应条带与FMDV衣壳蛋白VP0和VP3的分子量大小相符,表明FMDV的完整衣壳蛋白和3C蛋白酶也均获得表达,而且EGFP的插入并未影响P1蛋白的表达和3C蛋白酶对P1的正确切割。重组腺病毒的生长特性分析表明,EGFP的插入也未影响该重组腺病毒的增殖特性。上述研究结果显示,表达FMDV衣壳蛋白P12A3C的重组腺病毒可以作为载体,以2A蛋白作为Linker表达一个小分子蛋白,为改进以腺病毒为载体的口蹄疫基因工程疫苗提供了新思路。     

Asia1型FMDV感染BHK-21细胞差异蛋白质点2-DE分析

为研究Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)感染BHK-21细胞后蛋白质组的变化及差异,将FMDV接种于培养的单层BHK-21细胞,同时设未接毒的BHK-21细胞作对照组.待细胞病变后分别提取2组细胞总蛋白借助2-DE技术及PDQuest8.0软件进行细胞蛋白质组二维电泳图谱差异性分析.结果显示感染组有1 457个可见蛋白质点,而对照组可见的蛋白质点为1 427个.感染组蛋白点的表达量与对照组相比,二者具有统计学差异(P<0.05)的蛋白质点472个,其中表达上调251个点,表达下调221个点,新合成蛋白点30个.结果表明FMDV感染BHK-21细胞后弓l起了细胞蛋白质组表达模式的改变,这种变化是病毒与细胞相互作用的结果.本研究首次利用蛋白质组学技术研究Asia 1型FMDV感染BHK-21细胞后蛋白质组学差异,有助于深入研究Asia 1型FMDV和BHK-21细胞相互作用的分子机制.     

O型泛亚谱系口蹄疫病毒cDNA感染性克隆的建立

本研究采用RT-PCR技术将O型口蹄疫病毒(FMDV)O/YS/CHA/05株全长基因组分4个cDNA片段进行克隆、拼接,构建了具有感染性的FMDV cDNA克隆pOKT7-OY/S/CHA/05.将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05在细胞外转录获得的病毒RNA转染BHK-21细胞,经培养可见典型的细胞病变(CPE).同时,将线性化的pOKT7-O/YS/CHA/05与含有编码T7 RNA聚合酶的真核表达重组质粒共转染BHK-21细胞,同样也观察到典型的CPE.对拯救的病毒进行RT-PCR扩增、酶切和序列分析鉴定表明,拯救病毒含有不同于亲本病毒的分子标记,即在病毒核酸的3 510位人工消除了Xba Ⅰ酶切位点.免疫电镜观察和间接免疫荧光试验进一步表明,拯救出了FMDV.病毒生长比较试验表明,拯救病毒与亲本病毒具有相似的增殖特性.本研究构建了O型口蹄疫病毒的感染性克隆并获得了拯救病毒,为深入研究FMDV的致病机理以及开发新型疫苗提供了有效的反向遗传操作平台.     

Asia1型口蹄疫病毒前导蛋白(Lpro)亚细胞定位

为研究Asia 1型口蹄疫病毒(FMDV)前导蛋白(Lpro)亚细胞定位,利用RT-PCR方法获得L基因,将其定向克隆入pEGFP-N1真核表达载体,经PCR扩增、酶切鉴定及序列测定分析,将鉴定为阳性重组表达质粒命名为pEGFP-L.利用脂质体介导法将pEGFP-L转染BHK-21细胞,用荧光显微镜观察和Western blotting.方法检测目的基因的表达,经碘化丙啶(PI)染色后在激光共聚焦显微镜下观察Lpro的亚细胞定位.结果表明,成功构建重组表达质粒pEGFP-L;FMDVL基因在BHK-21细胞中得到表达;western blotting证实表达的Lpro具有反应活性;激光共聚焦显微镜观察发现Lpro在BHK-21细胞中呈弥散性分布.