苜蓿DUS测试标准品种SSR分子标记指纹图谱的构建

苜蓿在育种过程中,由于其异花授粉特性和骨干亲本的集中使用,导致品种间的遗传差异日益缩小,品种之间通过形态学鉴定愈加困难。通过构建苜蓿DUS测试标准品种DNA指纹图谱数据库,可以实现苜蓿品种的快速、准确鉴定。本研究利用筛选得到的10个SSR标记对33个苜蓿DUS测试标准品种进行指纹图谱构建和遗传多样性分析。结果表明,10对SSR引物共扩增出69个等位基因,平均每个标记可产生6.9个等位基因;多态性比率(PPB)从25%到90%不等,平均值为56.7%;各SSR标记的多态信息含量(PIC)范围为0.56~0.87,平均值为0.75。利用不同引物间的组合能有效区分33个苜蓿 DUS标准品种,并为每份标准品种建立了唯一标识的指纹代码,为苜蓿品种的审定和保护以及遗传背景分析提供了技术依据。     

淮阴苜蓿SSR指纹图谱的构建

采用不同的取样策略,利用SSR分子标记研究淮阴苜蓿（Medicago sativa Huaiyin）遗传多样性,确定最佳取样数,在此基础上利用筛选的SSR引物构建淮阴苜蓿的指纹图谱,并对淮阴苜蓿进行品种鉴定。本研究对320株淮阴苜蓿的单株基因组DNA设置6个处理（10、20、30、40、50、60单株DNA随机等量混合）,每处理8个重复,利用筛选的4对SSR引物进行遗传多样性分析。结果表明,40株单株随机DNA的混合样品的遗传多样性指数开始趋于稳定,由此取40株即可代表淮阴苜蓿群体。采用取样数为40株单株DNA混合样,利用筛选的3对SSR引物构建淮阴苜蓿指纹图谱,并对15份供试苜蓿材料进行检测,结果表明,该方法所构建淮阴苜蓿SSR指纹图谱可以用于对淮阴苜蓿品种的鉴定。     

杂花苜蓿种质SRAP标记遗传多样性研究

利用SRAP(Sequence-related Amplified Polymorphism)分子标记技术,于2009年5月对来自中国新疆、哈萨克斯坦、波兰等地区的31份杂花苜蓿(Medicago varia Martyn.)种质进行遗传多样性研究,旨在探究中亚及欧洲等地区杂花苜蓿种质的遗传变异和亲缘关系,为杂花苜蓿品种选育和利用提供参考。结果表明:17对引物组合共检测出179条清晰条带,平均每对引物扩增出8.41条具有多态性的条带,多态性条带比率(PPB)为79.89%,材料间的相似性系数在0.59到0.874之间,平均相似性系数值为0.723,与中亚和欧洲的参试种质材料相比,新疆的材料具有较为丰富的遗传多样性;UPGMA聚类结果显示,可将供试材料分为3类,来自中国新疆的7份材料分别聚在第1类和第3类,反映出中国新疆的供试材料间遗传变异丰富,与中亚材料有着密切的亲缘关系;不同杂花苜蓿材料的亲缘关系与地理环境具有密切的联系。     

海南岛红毛丹种质资源DNA指纹图谱构建

分别利用筛选出的多态性高、谱带清晰的8条ISSR标记和18对SRAP标记对海南岛69份红毛丹种质资源进行PCR扩增,8条ISSR引物共检测到425个多态性条带,其中品种(系)特异条带47个,平均位点多态性信息含量(PIC)值为0.928,可鉴别的种质资源数25～67份；18对SRAP引物共检测到894个多态性条带,其中品种(系)特异条带69个,平均位点多态性信息含量(PIC)值为0.936,可区分的种质资源数为17～63份。综合各项指标利用ISSR16和ISSR5引物21个条带用于构建红毛丹种质DNA指纹图谱,该图谱可有效区分69份红毛丹种质资源。同时该DNA指纹图谱还可为下一步红毛丹种质资源鉴定、利用、品种权保护和分子育种等提供了理论依据。     

苜蓿遗传多样性和亲缘关系的SSR和ISSR分析

在苜蓿(Medicago sativa L.)基因组SSR和ISSR分析的基础上,筛选出8对SSR引物和12个ISSR随机引物,通过PCR扩增在55个国内外苜蓿品种(品系)中获得126条多态性位点.利用SSR和ISSR标记对其DNA指纹图谱和遗传多样性进行研究.采用类平均法(UPGMA)Nei氏距离进行聚类分析,将55个苜蓿种质划分为4个大类群和7个类型,为苜蓿引种、亲本选配和种质资源评价提供依据.分子标记分析结果表明:我国苜蓿地方品种遗传基础广阔,在基因型表现特异性的同时又有较强的地域性;我国苜蓿育成品种间的遗传距离大,表现出遗传基础的异质性.     

利用RAPD分子标记研究苜蓿种质资源遗传多样性

利用RAPD分子标记对53份苜蓿Medicago sativa种质资源的遗传多样性进行分析,计算了35个RAPD分子标记的多态性比率和每份苜蓿种质资源的Shannon多样性指数和Nei指数,并通过计算53份苜蓿种质资源的遗传距离(CD),进行聚类分析,探讨它们之间的素缘关系.结果如下:1)35个RAPD标记扩增共得到306条带,其中多态性条带288条,多态位点比率为94.12%.说明这53份苜蓿种质资源具有较高遗传多样性.2)53份苜蓿种质资源的Shannon多样性指数和Nei指数变化规律一致.直立黄花苜蓿的Shannon多样性指数和Nei指数最低,说明其遗传多样性最小;公农1号的Shannon多样性指数和Nei指数最高,说明其遗传多样性最大.3)53份苜蓿种质资源间的遗传距离变异范围为0.136 3～0.661 0.以λCD=0.275为标准将53份苜蓿种质资源划分为7个组群,直立黄花苜蓿单独被划分成一个组群.     

两类SSR对苜蓿属种质遗传多样性和亲缘关系的比较研究

利用33对细胞核SSR标记和28对叶绿体SSR标记对38份苜蓿属种质进行了遗传多样性和亲缘关系分析。在38份苜蓿属种质中,叶绿体SSR标记的平均等位变异数高于细胞核SSR标记,而遗传多样性指数则相反;分别用细胞核SSR、叶绿体SSR和61对SSR标记对38份苜蓿属种质进行聚类,结果显示:3次聚类都把38份苜蓿属种质划分为一年生和多年生苜蓿两个大类群;以相似系数0.8为准,3次聚类结果的差异主要显示在一年生苜蓿内部尤其是蒺藜苜蓿种质内的品种(系)划分上。     

利用SSR、ISSR和RAPD技术构建苜蓿基因组DNA指纹图谱

在建立可靠的苜蓿基因组DNA提取分离和PCR扩增技术体系的基础上,筛选具有稳定多态性位点的RAPD、SSR和ISSR引物,建立苜蓿基因组DNA的SSR、ISSR和RAPD分子标记技术体系,并利用分子标记检测苜蓿品种(系)的DNA分子标记多态性,构建苜蓿品种的DNA指纹图谱.筛选出36个RAPD引物,8个SSR引物和12个ISSR随机引物,通过PCR扩增在55个国内外苜蓿品种(系)中获得了182个RAPD多态性位点和丰富的SSR和ISSR多态性位点,构建了55个苜蓿品种(系)的SSR、ISSR和RAPD指纹图谱.结果表明,不同苜蓿品种(系)的SSR多态性有较大差异;苜蓿品种ISSR指纹图谱多态性丰富,稳定性比RAPD强;可以通过2～3个引物鉴别我国主要苜蓿品种和引进品种,SSR和ISSR指纹图谱可以更好地用于苜蓿品种鉴定和遗传多样性分析.     

基于EST-SSR及SRAP标记构建苦荬菜品种(系)DNA指纹图谱

苦荬菜是优良的一年生菊科青饲牧草,为构建苦荬菜品种(系)DNA指纹图谱,筛选出24对EST-SSR引物、32对SRAP引物组合构建指纹图谱。24对EST-SSR多态性引物对收集的14份苦荬菜品种(系)共扩增出270个清晰条带,多态性条带223个, PIC均值0.834,基因多样性指数变幅为0.2464~0.4288,Shannon指数变幅为0.3597~0.6148,可区分品种3~14个;32对SRAP引物检测到多态性条带367个,PIC均值0.826,基因多样性指数变幅为0.2006~0.3898,Shannon指数为0.3167~0.5716,可区分品种2~12个。7个引物在9个品种(系)上能扩增出特征谱带,综合各项遗传多样性指标筛选出IpSSR102、IpSSR80、IpSSR91、Me10+Em5、Me9+Em17,共5个核心引物的40个多态性条带构建苦荬菜品种(系)DNA指纹图谱,每个品种(系)都有一个特异分子身份指纹编码。     

利用基因组SSR分子标记对老芒麦品种(种质)鉴别和品种纯度鉴定

利用从老芒麦(Elymus sibiricus)自身基因组中开发出来的6对多态性SSR引物,对3个老芒麦牧草品种和7个种质进行分子指纹图谱鉴别研究.结果表明:6对SSR引物在这10个材料中共检测出21个多态性SSR标记片段,每对引物可以检测到2~5个数目不等的片段,平均为3.5个.6对引物中3对核心引物组合可以将这10个材料进行有效鉴别.进一步选用3对引物对2个老芒麦品种进行纯度鉴定,表明SSR标记可以对品种群体中具有变异位点的个体进行有效鉴定,同时揭示野生栽培品种‘同德’老芒麦比育成品种‘多叶'老芒麦具有较高的遗传变异度.     

不同抗虫性苜蓿根围土壤线虫群落研究

为探索不同抗虫性苜蓿品种根围土壤线虫群落的特征，本试验以线虫为生物指标，对‘草原2号’杂花苜蓿（Medicago varia Martin. ‘Caoyuan No.2’）和‘草原4号’紫花苜蓿（Medicago sativa L. ‘Caoyuan No.4’）根围土壤线虫群落特征进行了研究。结果表明：‘草原2号’感虫苜蓿根围土壤线虫种类及数量显著高于‘草原4号’抗虫苜蓿；‘草原4号’土壤线虫富集指数（Enrichment index，EI）显著高于‘草原2号’；‘草原4号’0~10 cm土层的土壤线虫区系位于土壤养分好且以细菌降解为主的A区，其它位于D区。综上所述，种植抗虫性不同的苜蓿品种会对其根围土壤线虫群落组成、数量及营养类群产生不同的影响。在建立人工苜蓿草地及土壤恢复过程中应优先选择抗虫性强的苜蓿‘草原4号’。     

杂花苜蓿SRAP-PCR反应体系的正交优化

利用正交设计L₁₆(4⁵)对杂花苜蓿(Medicago varia Martin.)SRAP-PCR反应体系的5因素(Taq酶、Mg₂⁺、模板DNA、dNTP、引物)在4个水平上进行优化试验,旨在建立一套适用于苜蓿属(Medicago L.)种质资源的SRAP标记技术体系。结果表明:各因素对PCR反应结果都有显著影响,由F值可知,dNTP的量对反应结果影响最大,其次是Taq酶的量,模版DNA浓度的影响最小,各因素水平的变化对PCR反应的影响依次为:dNTP>Taq酶>Mg₂⁺>引物>模板DNA;筛选出各反应因素的最佳水平,建立杂花苜蓿SRAP-PCR反应的最佳体系(25μL)为:dNTP 2μL(0.20 mmol·L^-1),TaqDNA聚合酶0.3μL(1.50 U),Mg₂⁺3μL(1.50mmol·L^-1),上、下游引物各1μL(0.40μmol·L^-1),50ng模板DNA1μL,10×PCR buffer 2.5μL(不含Mg₂⁺)。这一优化体系的建立,为今后利用SRAP标记技术进行苜蓿属植物遗传图谱构建、遗传多样性分析及种质资源鉴定等研究奠定了技术基础。     

苜蓿品种对2种色型豌豆蚜的抗生性

在21~23℃,湿度50%~70%,光照时间14 h的人工气候箱条件下,组建生命表并用其参数测定评价了5个苜蓿品种对2种色型豌豆蚜的抗生性。结果表明,同一苜蓿品种和不同苜蓿品种之间对2种色型豌豆蚜的抗生性都存在差异。以内禀增长率为抗性指标,俄罗斯杂花苜蓿对绿色型豌豆蚜的抗性高于红色型;阿尔冈金对红色型豌豆蚜抗性高于绿色型;甘农5号对2种色型豌豆蚜均具有一定的抗性;不同苜蓿品种对红色型豌豆蚜抗性大小为:俄罗斯杂花苜蓿<陕北野生苜蓿<阿尔冈金=甘农3号<甘农5号;绿色型豌豆蚜抗性为:阿尔冈金<俄罗斯杂花苜蓿<陕北野生苜蓿=甘农3号<甘农5号。     

草原2号杂花苜蓿浸提液对4种牧草种子萌发的影响

通过研究草原2号杂花苜蓿(Medicago varia cv. caoyuan No.2)浸提液对4种牧草种子萌发的影响,探索利用生物检测法初步确定其与自身及其他3种牧草间化感作用。用草原2号杂花苜蓿根、茎、叶水浸提液处理草原2号杂花苜蓿、蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)、扁穗冰草(Agropyron cristatum (L.) Gaertn.)和红豆草(Onobrychis viciaefolia Scop.)的种子,测定其发芽率、苗高、根长,利用生物检测法确定草原2号杂花苜蓿对受体植物的化感效应。结果表明:草原2号杂花苜蓿的自毒性及化感作用存在浓度效应,即不同浓度的根、茎、叶浸提液对不同受体植物种子萌发、幼苗高度、根长影响效果不同,其叶浸提液对扁穗冰草和蒙古冰草种子发芽的抑制效应小于草原2号杂花苜蓿和红豆草;其叶、茎、根浸提液对蒙古冰草、扁穗冰草的苗高、根长的促进作用大于红豆草和草原2号杂花苜蓿;根据试验结果,初步认为草原2号杂花苜蓿与蒙古冰草、扁穗冰草混、间播效果要比与红豆草混、间播和单一连播杂花苜蓿效果好。     

44个紫花苜蓿品种的酸铝适应性与耐受性评价

为了解紫花苜蓿在贵州地区的适应性及耐酸铝胁迫机理，以44份紫花苜蓿品种为研究对象，研究紫花苜蓿处于酸铝胁迫下的生理变化，并揭示其生理变化与耐酸铝胁迫间的关系。利用基因与环境互作模型对两个地点1年的紫花苜蓿进行产量分析，筛选出阿尔冈金、新疆大叶苜蓿、Trifecta、Vernal和中牧1号苜蓿5个耐酸铝强适应品种。利用敏感型UC-1465和耐受型阿尔冈金进行酸铝胁迫试验。结果表明：相同处理下，耐受型紫花苜蓿的电导率、相对铝含量、死亡率显著低于敏感型；紫花苜蓿对酸铝胁迫的响应主要通过柠檬酸、苹果酸、乙酸、酒石酸、反丁烯二酸和草酸的显著（P<0.05）增加来体现，其中苹果酸的合成和分泌增多可能是其耐酸铝胁迫的重要原因。     

全基因组水平蒺藜苜蓿反转录转座子IRAP分子标记开发及应用

由于苜蓿品种间遗传差异日益缩小,通过传统形态学鉴定表型愈加困难。在苜蓿育种过程中,利用分子标记可大大提高育种效率和品种鉴定。反转录转座子长末端重复序列（LTR）广泛分布在植物基因组中,基于LTR的分子标记具有丰富的多态性和高信息量等优势,被广泛用于物种品种鉴定、评价种质资源多样性等方面。本研究在全基因组水平鉴定和设计了大量蒺藜苜蓿LTR反转录转座子扩增多态性（IRAP）标记,并利用其对国内外40个紫花苜蓿种质资源进行遗传多样性分析。结果表明,根据设计开发出的431个IRAP引物,并按照其染色体位置信息组合获得69对IRAP引物。利用筛选出的37对多态性引物组合共扩增出325个等位位点,平均每个标记可产生8.8个等位位点;多态性条带比率（PPB）为50%~100%,平均值为79.9%;多态性信息含量（PIC）的范围为0.34~0.88,平均值为0.69。基于遗传相似系数（GS）对供试品种采用算术平均值非加权组平均法（UPGMA）进行聚类分析,以0.82为阈值可将40份供试材料分为4类,其分组结果与不同材料地理分布信息以及STRUCTURE分析相对一致。本研究首次在蒺藜苜蓿全基因组水平上开发了IRAP分子标记并在紫花苜蓿种质资源中进行评价与应用,获得的大量IRAP分子标记可对后续苜蓿品种的鉴定保护以及遗传背景分析提供技术支撑。     

干旱和高温胁迫下紫花苜蓿PEPC酶活性变化及其基因序列分析

紫花苜蓿(Medicago sativa L.)是一种分布极其广泛的多年生优质豆科牧草，分析干热胁迫下其磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(Phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)酶活性变化及PEPC蛋白的生物信息学。本研究以‘阿尔冈金’紫花苜蓿和云南德钦县野生紫花苜蓿为材料，测定其在干旱胁迫和高温胁迫下的PEPC酶活性的变化，同时扩增了PEPC基因，并对PEPC蛋白进行了生物信息学分析和系统发育分析。结果表明，在胁迫第12 h酶活性达到峰值，两种胁迫下野生紫花苜蓿的酶活性基本高于‘阿尔冈金’紫花苜蓿，两种紫花苜蓿PEPC蛋白均为不稳定蛋白和亲水性蛋白。干旱胁迫与高温胁迫都对紫花苜蓿PEPC酶活性产生了较大的影响，且两种紫花苜蓿PEPC氨基酸序列保守性均较高。本研究可为提高高温和干旱条件下紫花苜蓿的光合特性进而增加产量提供理论依据。     

不同根型苜蓿根系发育能力研究

从根系发育角度对根茎型清水苜蓿、直根型陇东苜蓿、根蘖型野生黄花苜蓿和甘农2号杂花苜蓿在甘肃省天水半湿润区、兰州半干旱区和武威干旱区生长前3年的适应性进行了连续研究。结果表明,不同根型苜蓿的根系特性差异明显。根茎型清水苜蓿主根长度最短,主根直径和侧根直径均最细,侧根数较少;根蘖型野生黄花苜蓿和甘农2号的主根长度较长,主根直径和侧根直径均较粗,侧根数较多;直根型陇东苜蓿各项根系指标介于根茎型和根蘖型苜蓿之间,与根蘖型苜蓿更接近。主根直径和侧根直径在温度较高的夏秋季增长较快。不同根型苜蓿根系体积、生物量在3个生态区均表现为从表层到深层逐次递减,随着年限的增长逐年增大。对各根型苜蓿综合分析,相对来说,根茎型清水苜蓿在天水半湿润区、根蘖型甘农2号和黄花苜蓿在兰州半干旱区和武威干旱区、直根型陇东苜蓿在天水半湿润区和兰州半干旱区具有较强的根系发育能力。     

苜蓿抗寒性与根系抗氧化酶活性相关性分析

为探究不同苜蓿材料的抗寒性与低温胁迫下苜蓿根颈抗氧化酶活性变化的关系,本研究在科尔沁沙地种植黄花苜蓿（Medicago falcata L.）和4个紫花苜蓿（Medicago sativa L.）品种,越冬前挖取越冬器官并进行-10℃,-15℃,-20℃,-25℃,-30℃低温胁迫处理,以低温（4℃）贮藏为对照,测定苜蓿根颈抗氧化酶活性及相对电导率,利用相对电导率值拟合Logistic回归方程计算苜蓿半数致死温度（LT₅₀）,进行LT₅₀与抗氧化酶活性相关性分析。结果表明,黄花苜蓿的抗寒性强于紫花苜蓿,其中紫花苜蓿‘北极熊’品种抗寒性最强,‘骑士T’品种最弱。LT₅₀与不同温度处理下抗氧化酶活性呈负相关,在-30℃处理下超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）活性和过氧化氢酶（Catalase,CAT）活性分别与LT₅₀呈显著和极显著负相关。综上所述,苜蓿通过提高SOD,CAT活性增强抗寒性,-30℃处理下的SOD活性和-10℃,-30℃处理下CAT活性可以作为衡量苜蓿抗寒性强弱的生理指标。