海雀稗SRAP-PCR分子标记体系优化及引物筛选

以4个代表性海雀稗（Paspalum vaginatum）种质的叶片DNA为模板,采用L₉（3⁴）正交试验设计,对影响海雀稗SRAP-PCR反应的Mg²⁺、dNTP、引物和TaqDNA聚合酶的用量进行了优化,并比较了不同浓度模板DNA对扩增的影响,以确定适合海雀稗的SRAP-PCR最佳反应体系。结果表明：海雀稗SRAP-PCR最佳反应体系为10×PCR buffer 1 μL、模板DNA50 ng、Mg²⁺2.5 mmol·L^-1、dNTP150 μmol·L^-1、引物0.4 μmol·L^-1、TaqDNA聚合酶1.0 U,总体积10 μL。利用该反应体系从100对引物中筛选出可扩增清晰条带的引物83对,在83对引物中选出多态性丰富的引物44对。SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选,为今后利用SRAP标记技术进行海雀稗遗传多样性研究、基因定位、遗传图谱的构建以及分子标记辅助育种提供技术支持。     

白三叶RAPD分析条件优化

对白三叶RAPD反应体系中的模板DNA用量、随机引物浓度、dNTP浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg²⁺浓度分别进行了梯度试验。结果表明,在总体积25μL体系中,模板DNA20ng、引物9.9ng、dNTP浓度0.4mmol/L、T aqDNA聚合酶3U、Mg²⁺浓度1mmol/L的反应体系可得到稳定清晰的RAPD扩增图谱,该体系可用于白三叶遗传多样性分析。     

结缕草属植物ISSR-PCR反应体系研究

以SDS法提取的结缕草(Zoysia spp.)叶片DNA为模板,应用正交试验设计,从Mg²、dNTP、引物和DNA聚合酶并通过比较不同浓度的模板DNA对PCR扩增的影响,确立结缕草属植物ISSR-PCR反应的最佳体系。结果表明:各因素不同浓度对PCR反应结果有显著影响,正交设计可以用于ISSR反应体系建立,该方法建立的结缕草属植物ISSR-PCR优化反应体系为10X Buffer7、0 ng模板DNA、Mg²+2.0 mmol·L^-1、dNTP 150μmol·L^-1、Primer 0.3μmol·L^-1、Taq DNA聚合酶1.0 U,总体积20μL;经对11份结缕草属植物进行检验,证明该体系稳定可靠。该体系的建立可为今后利用ISSR标记技术进行结缕草属遗传多样性研究、种质资源鉴定和亲缘关系分析等提供依据。     

苜蓿假盘菌ISSR反应体系优化及指纹图谱构建

以北京苜蓿假盘菌(Pseudopeziza medicaginis (Lib.) Sacc.)菌株为试材,用ISSR-23引物[序列为(AC)8T]研究PCR反应体系的主要成分及退火温度对假盘菌ISSR扩增的影响,以期为苜蓿假盘菌的深入研究奠定基础。结果表明:Primer、Mg²⁺、Taq酶和dNTP浓度对扩增均有影响,以Primer影响最为明显;优化的反应体系为:20μL反应体系中含0.1 ng模板DNA,2.0mmol/L MgCl₂、0.5μmol/L Primer、1U Taq DNA聚合酶、0.2 mmol/LdNTP,2μL 10×PCR Buffer和2.5%去离子甲酰胺;在此基础上,建立6个不同地理来源苜蓿假盘菌菌株的指纹图谱并分析其亲缘关系;对44条ISSR引物进行筛选,22条可产生清晰稳定的多态性条带,其中16条可将6个供试菌株完全分开,建立了苜蓿假盘菌指纹图谱;经聚类分析,在0.55遗传相似水平下,6个供试菌株分为两个遗传谱系,菌株的遗传谱系与其地理来源之间不表现相关性。     

正交设计优化草地早熟禾SRAP-PCR反应体系及引物筛选

采用L9(34)正交试验设计方法,对草地早熟禾(Poa pratensis)基因组DNA SRAP PCR反应体系中的Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物及dNTP四因素的用量进行优化,并比较不同模板DNA用量对扩增的影响,建立草地早熟禾SRAP PCR最佳反应体系,同时,利用该体系对SRAP引物进行筛选。结果表明,草地早熟禾SRAP PCR最佳反应体系为Taq DNA聚合酶1.0 U、Mg2+ 1.75 mmol·L-1、引物0.25 μmol·L-1、dNTP 220 μmol·L-1、40 ng模板DNA、2 μL 10×PCR buffer,总体积20 μL。运用该体系从100对SRAP引物中筛选出43对引物能够产生清晰稳定的扩增条带且多态性丰富。优化体系的建立及引物的筛选可为今后利用SRAP标记技术对草地早熟禾进行遗传多样性分析、图谱构建、种质资源鉴定奠定技术基础。     

利用SCoT标记分析不同秋眠型苜蓿的遗传多样性

用L₁₆(4⁵)正交实验设计研究模板DNA、dNTPs、Mg²⁺、Taq酶和引物5个因素的浓度对SCoT扩增迁移率重现率的影响。结果表明,在20 μL反应体系中,2.5 ng/μL DNA、1.00 mmol/L Mg²⁺、1.20 U Taq酶、0.40 mmol/L dNTPs和0.30 μmol/L浓度的引物最为稳定,重现率达到100%。利用最优反应体系从50条引物中筛选出13条扩增效果好的引物,将它们分别扩增34个苜蓿品种,共检测到103个SCoT标记,其中92个位点具有多态性。聚类分析表明,从安徽和江苏两地收集的野生南苜蓿和栽培苜蓿的遗传距离最远,单独聚为一类;其余32个品种苜蓿在相似系数0.757附近分为3个亚群,秋眠型苜蓿品种主要分布在第Ⅱ亚群中,半秋眠型在3个亚群中都有分布,而非秋眠型苜蓿分布在第一和第二亚群中,表明SCoT标记的聚类结果在一定程度上能够反映苜蓿的秋眠型,但并不完全一致。     

蒺藜苜蓿SSR反应体系优化及在一年生苜蓿种质鉴定中的应用

利用正交设计和完全随机试验优化蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn)SSR标记的PCR反应体系。结果表明,适合于一年生苜蓿(Medicago L.)遗传分析的SSR技术体系为:10μL反应体系中TaqDNA聚合酶为1U,dNTP浓度为0.20mmol/L,Mg²⁺浓度为2.0mmol/L,引物浓度为1.5umol/L,模板DNA用量为20ng/uL;利用该反应体系将2个蒺藜苜蓿亲本和杂交种有效鉴别;利用SSR标记对19个一年生苜蓿种质进行SSR-PCR扩增,用8%的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测,不同种质间DNA谱带多态性丰富,通过UPGMA方法聚类分析可以明确区分19个一年生苜蓿种质。     

紫花苜蓿耐盐测序扩增区段标记条件优化

以中苜一号紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Zhang mu No.1)为材料,对SCAR反应中的引物浓度、退火温度、Mg²⁺、dNTP浓度、模板DNA用量及Taq酶用量进行优化。结果表明:在3对SCAR中有2对引物出现目标扩增带,其中以SCAR1的效果最好;适宜反应体系总体积为25μL、Mg²⁺浓度2.5mM、dNTP浓度200μM、引物浓度0.5μM、Taq酶1.5U、模板DNA为50~100ng;优化后的反应体系能得到清晰稳定的SCAR扩增条带,可用于苜蓿耐盐性分子标记鉴定分析。     

狗牙根SRAP-PCR反应体系优化及引物筛选

利用正交设计,从Mg2 、dNTP、引物浓度和DNA聚合酶4种因素3个水平以及不同的模板DNA浓度来优化狗牙根SRAP-PCR反应体系,并对引物进行了全面筛选。狗牙根SRAP-PCR优化反应体系结果为:2μL 10×buffer4、0 ng模板DNA、Mg2 1.25 mmol/Ld、NTP 260μmol/L、引物0.2μmol/L、Taq DNA聚合酶1.0 U,总体积20μL。运用该结果从90对引物中共筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的SRAP引物34对。优化体系的建立及其引物的筛选为今后利用SRAP标记技术进行狗牙根遗传分析、图谱构建、基因定位与种质资源鉴定奠定了技术基础。     

RAPD分子标记鉴定紫花苜蓿品种的反应体系优化

以中苜1号紫花苜蓿(Medicago sativa L.cv.Chongmu No.1)为研究材料,通过对RAPD-PCR反应退火温度、反应体系中的模板DNA、Taq聚合酶、Mg²⁺、dNTP、引物用量的梯度处理,分别对各项单因子进行优化。结果表明,当退火温度为37℃,总反应体积25μl时,各反应物适宜用量为模板DNA80ng,Taq聚合酶1.5U,Mg²⁺6.25×10^-5mmol,dNTP0.3×10^-5mmol,随机引物0.4×10^-5mmol,缓冲液KCl1.25×10^-3mmol,扩增结果清晰、稳定,并且在不同实验室扩增结果具有较好的一致性。     

正交设计优化黑褐苔草ISSR-PCR反应体系

采用正交设计对黑褐苔草（Carexa trofusca）ISSR-PCR反应的Mg²⁺、Taq DNA聚合酶、dNTP、引物和DNA模板进行优化,以期建立最佳反应条件并筛选退火温度。结果表明：黑褐苔草20μLISSR-PCR最佳反应体系为：1.80μmol·L^-1 Mg²⁺、0.60 U Taq DNA聚合酶、0.125μmol·L^-1 dNTP、0.3μmol·L^-1 Primer和50ngDNA模板;引物UBC807适宜退火温度为55℃。该体系能在不同个体中扩增出清晰的、稳定性好的条带。     

紫花苜蓿ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过优化影响紫花苜蓿(Medicago sativa L.)ISSR-PCR的主要参数,建立适于紫花苜蓿的ISSR反应体系和扩增程序。在20μL体系中各反应物的最适含量为:15 ng模板DNA,0.2 mmol/L dNTP,0.4μmol/L ISSR引物,0.8 U Taq DNA聚合酶,2μL 10×PCR Buffer,1.5 mmol/L MgCl₂,2.5%去离子甲酰胺。PCR扩增程序为:94℃预变性4 min,94℃变性30 s,62℃(62℃~58℃)退火45 s,72℃延伸1 min 45 s,共11个循环,每个循环退火温度降1℃;94℃变性30 s,52℃(52℃~48℃)退火45 s,72℃延伸1 min 45 s,共24个循环;72℃延伸5 min,25℃保温。     

鹰嘴豆ISSR反应体系的正交优化

鹰嘴豆(Cicer arietinum)ISSR反应体系的建立可以为鹰嘴豆种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位提供理论依据和技术参考。本研究以CTAB法提取的鹰嘴豆DNA为模板,采用L₁₆(4⁵)正交设计直观分析法,对鹰嘴豆ISSR-PCR反应中的4个主要因素(Mg²⁺浓度,引物浓度,TaqDNA聚合酶浓度,dNTPs浓度)在4个水平上进行优化,并在最优ISSR-PCR反应体系的基础上对引物UBC826的最适退火温度进行筛选。结果表明:Mg²⁺和引物浓度对PCR扩增结果有显著影响,dNTPs和Taq酶的浓度变化对PCR扩增结果无显著影响。鹰嘴豆ISSR-PCR优化反应体系(25 μL)为:3 mmol·L^-1 Mg²⁺,0.2 mmol·L^-1 dNTP,0.24 μmol·L^-1引物,2 U Taq DNA聚合酶。UBC826最适退火温度为56℃。     

结缕草属植物RAPD反应体系的优化

为建立一个稳定的结缕草属植物RAPD-PCR反应体系,以结缕草种源Z111(Zoysia japonica Steud.)为实验材料,研究了模板DNA浓度、Taq酶、mg²⁺浓度、dNTP浓度、引物及扩增缓冲液浓度等各个主要因素对结缕草RAPD-PCR反应的影响,并分别对各项单因子进行优化。结果表明:总反应体积为20×L时,各反应物的适宜用量分别为模板DNA浓度30 ng、Taq酶1.0U、mg²⁺2.5 mmol/L、dNTP 0.19mmol/L、引物0.5×mol/L、10×buffer2.0×L;5种、1变种共20份结缕草种源材料验证,显示该体系扩增条带多、清晰结果稳定,表明该体系是一个适合结缕草属植物RAPD-PCR反应的体系。     

冰草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为进一步开展冰草属植物种质资源遗传多样性研究,寻找可用于冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn.)的ISSR-PCR最适反应体系并建立与优化,具有重要的意义。通过优化影响ISSR-PCR体系的主要参数,最终确定在20μL体系中各反应物的最适含量为:40 ng模板DNA,0.2 mmol·L^-1dNTP,0.5μmol·L^-1ISSR引物,1 UTaq DNA聚合酶,2μL10×PCR Buffer,2.5 mmol·L^-1MgCl₂;引物815号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行冰草属种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。