犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化

为了研究犬细小病毒(canine parovirus,CPV)VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPVVP2基因插入原核表达载体pET-32a(+)中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中,在不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件。最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,重组质粒pET-VP2经双酶切鉴定分别获得大小为5 900bp左右的载体条带和1 755bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-VP2重组质粒;重组VP2蛋白的分子质量约为64ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0mmol/L IPTG、诱导5h条件下表达量最高,条带最亮;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,只在沉淀中出现了目的条带,而上清中并未出现相应条带,说明重组蛋白均以包涵体的形式存在;纯化后获得的重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在64ku处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-VP2。本试验通过对CPV VP2蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的CPV VP2蛋白,为今后制备CPV VP2蛋白多克隆抗体及进一步研究该蛋白在对治疗犬细小病毒病中的临床应用价值提供了基础理论依据。     

犬细小病毒VP2蛋白的原核表达与纯化

为了研究犬细小病毒（canine parovirus,CPV）VP2蛋白的结构和功能,本试验对CPV VP2蛋白进行表达和纯化。采用大肠杆菌表达外源蛋白的方法,将CPV VP2基因插入原核表达载体pET-32a（+）中构建重组原核表达载体pET-VP2,转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,在不同IPTG浓度、诱导温度和诱导时间条件下进行原核表达,确定最佳诱导条件。最佳条件下的诱导产物经超声破碎离心后,利用镍柱对重组蛋白进行纯化并用SDS-PAGE和Western blotting进行双重鉴定。结果显示,重组质粒pET-VP2经双酶切鉴定分别获得大小为5 900 bp左右的载体条带和1 755 bp左右的目的基因条带,成功构建了pET-VP2重组质粒;重组VP2蛋白的分子质量约为64 ku,与预期大小一致,且在37℃、1.0 mmol/L IPTG、诱导5 h条件下表达量最高,条带最亮;蛋白超声破碎后经SDS-PAGE发现,只在沉淀中出现了目的条带,而上清中并未出现相应条带,说明重组蛋白均以包涵体的形式存在;纯化后获得的重组蛋白,经SDS-PAGE和Western blotting双重鉴定,均在64 ku处出现条带,说明纯化后的蛋白为重组蛋白pET-VP2。本试验通过对CPV VP2蛋白的原核表达及纯化成功获得了大量纯度较高的CPV VP2蛋白,为今后制备CPV VP2蛋白多克隆抗体及进一步研究该蛋白在对治疗犬细小病毒病中的临床应用价值提供了基础理论依据。     

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白的原核表达与纯化

为制备高致病性的TGEV毒株重组S蛋白,试验将重组质粒pET28a-TGEV-S2、pET28a-TGEV-S3,转化至E. coli BL21(DE3)表达菌株,设置不同的诱导温度、IPTG浓度和诱导时长对其进行表达条件的优化,并使用纯化试剂盒将其纯化,采用SDS-PAGE和Western blot进行蛋白鉴定。结果表明,重组TGEV毒株S蛋白的分子量分别约为28 kDa、30 kDa,在不同诱导条件下均以包涵体形式存在,在28℃条件下以终浓度为1 mmoL·L^-1 IPTG诱导4 h表达量达到最高。结果表明:试验成功制备了TGEV重组S蛋白,为TGEV抗体检测试剂盒和基因工程疫苗、检测试剂的研究奠定了基础。     

与兔出血症病毒VP60蛋白相互作用蛋白的初步鉴定

为获得与兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白(VP60)相互作用的细胞蛋白,本研究以pMD-VP60重组质粒为模板扩增RHDV的VP60基因,克隆于表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组表达质粒pGEX-VP60,并转化大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达GST重组蛋白(rVP60),western blot分析表明该蛋白具有与VP60单克隆抗体(MAb)良好的反应原性。以亲和层析纯化的rVP60进行pull-down实验,从兔的肝脏细胞膜蛋白中获得与VP60相互作用的蛋白,多肽质量指纹图谱分析表明,其相互作用的蛋白为ATP合成酶β亚基,提示该蛋白可能与RHDV的感染相关。     

脑心肌炎病毒BD2株VP1基因的原核表达及生物信息学分析

应用RT-PCR技术扩增脑心肌炎病毒(EMCV)BD2株VP1基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a(+),利用在线分析软件对该基因所编码的蛋白序列进行生物信息学分析。将重组质粒pET-32a-VP1转化到E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,在不同浓度的IPTG和不同温度条件下对目的蛋白进行诱导表达。结果显示,EMCV VP1基因全长831bp,编码277个氨基酸,VP1蛋白为酸性、亲水性蛋白质,蛋白空间结构以α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲为主。经SDS-PAGE分析可知,VP1蛋白在37℃,1.0mmol/L IPTG的诱导条件下以包涵体形式获得了高效表达,重组蛋白的相对分子质量约为49 300。Western blot结果表明其具有良好的反应原性。综上所述,EMCV VP1蛋白是一种抗原性较高的亲水性蛋白,在原核系统中能高效表达,该研究为进一步建立相应的抗体检测方法和DNA疫苗的研制提供理论基础。     

犬细小病毒NY株VP2蛋白多克隆抗体的制备与鉴定

试验旨在制备犬细小病毒（canine parvovirus,CPV）VP2蛋白多克隆抗体。构建pET28a-CPV-VP2重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导,SDS-PAGE鉴定融合蛋白的表达,纯化目的蛋白与佐剂混合、乳化制备后作为免疫原,免疫家兔制备VP2蛋白多克隆抗体;采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法（immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）检测抗体的免疫活性、抗体滴度、病毒滴度及中和活性。结果表明,重组VP2蛋白（rVP2）以包涵体形式存在,分子质量约为72 ku;所制备的多克隆抗体滴度为1 600倍,病毒滴度为10⁷ TCID₅₀ /mL,中和效价为1∶2 884,该抗体与体外培养的CPV呈特异性反应,CPV VP2蛋白的多克隆抗体免疫活性和特异性良好,且中和活性高,为CPV基因工程疫苗的研究和临床治疗奠定了基础。     

水貂阿留申病病毒VP2截短基因的原核表达

为获得水貂阿留申病病毒G株(ADV-G株)VP2截短基因表达的蛋白,将ADV-G株VP2基因的主要抗原区片段克隆至原核表达载体pGEX-4T-1中,通过不同浓度的IPTG,不同诱导时间以及加入不同的化学分子伴侣(甘油、葡萄糖、蔗糖、二甲基亚砜、乙醇)进行诱导表达,确定目的蛋白表达的最佳条件。经SDS-PAGE和Western blot分析,表明终浓度为1mmol/L的IPTG诱导6h目的蛋白的表达量最高,分子质量约为53ku。SDS-PAGE分析表明,葡萄糖和乙醇抑制了目的蛋白的表达,而蔗糖、甘油和二甲基亚砜提高了目的蛋白的表达量,获得的目的蛋白具有良好的反应原性。     

鸡传染性法氏囊病病毒BC6/85株VP2基因的原核表达、纯化及鉴定

为获得可用于鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)抗体检测的重组抗原VP2蛋白,根据GenBank中发表的IBDV VP2序列设计一对特异性引物,应用RT-PCR技术克隆IBDV经典标准攻毒株(BC6/85株)的VP2基因,插入质粒pET-32a中构建重组表达质粒pET-32a-VP2,经IPTG诱导后获得了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,Western-blot检测表明具有良好的反应原性。本研究为下步建立IBDV抗体的间接ELISA方法及新型疫苗的研制奠定了基础。     

猪细小病毒PPV-SD1株VP2全基因的克隆及原核表达

为研究猪细小病毒PPV-SD1分离株的VP2蛋白的结构与功能,自行设计引物,通过PCR扩增的方法,获得VP2全基因,克隆到pMD18-T载体中进行测序,然后亚克隆到pET30a(+)表达载体中,构建并筛选出阳性重组子,标记为pET30a-VP2。将阳性重组质粒转化进RosettaTM宿主菌中,通过改变IPTG浓度、诱导温度和诱导时间,使重组蛋白获得表达,并确定最佳诱导条件为:IPTG终浓度1.0 mmol/L、诱导温度37℃、诱导时间为3~4 h。经SDS-PAGE和Western-blotting分析表明该重组蛋白相对分子量约为68 ku,具有良好的免疫学活性。     

犬细小病毒北京分离株VP2基因的表达与抗原性分析

本研究基于犬细小病毒(canine parvovirus, CPV) VP2基因序列设计引物,利用PCR技术扩增该基因。扩增的VP2基因连入表达载体pET-32a(＋),经PCR及双酶切鉴定基因连入正确。重组表达载体转入大肠杆菌后,经IPTG诱导,SDS-PAGE及Western blotting分析表明有特异蛋白的表达,分子质量大小为87 ku。将表达的蛋白包被酶标板后用抗犬细小病毒单抗与其反应,表明表达的VP2蛋白可以与相应抗体特异结合。