利用Wx基因的分子标记筛选部分糯小麦的研究

为了筛选出更多用于培育优质面条小麦的Wx基因缺失材料,用分子标记技术对260份中国核心小麦种质资源进行了分析,并用SDS-PAGE进行了验证.筛选出缺失Wx-A1蛋白亚基的品种2份,缺失Wx-B1蛋白亚基的品种14份,得到1份不同于"白火麦"的Wx-D1蛋白亚基缺失的地方品种"秃芒麦".对它们的地区分布分析发现,长江以北各麦区的小麦品种Wx基因缺失多于长江以南各麦区,且分布更为集中.对收集的20对Wx基因的分子标记引物进行了筛选,并对PCR扩增条件和产物分析条件进行优化,得到了3对可以在相同条件下对Wx基因进行筛选的引物,且能用同一电泳条件对产物进行分析,提高了分析效率.     

小麦TILLING突变体检测中基因组DNA提取方法的优化

为了优化小麦高通量TILLING突变体扫描所需基因组DNA提取的方法,对利用SDS法、改良SDS法、CTAB法、改良CTAB法、AxyPrep DNA提取试剂盒、Qiagen DNeasy Plant Mini Kit试剂盒以及再生Qiagen硅胶柱方法提取的小麦基因组DNA进行了系统比较。结果表明,尽管7种方法所提取DNA的纯度及琼脂糖凝胶电泳检测结果均良好,但再生Qiagen硅胶柱方法、CTAB法和改良SDS法的DNA浓度显著高于其他方法。根据小麦细胞分裂素氧化酶基因1(TaCKX1)的DNA序列设计引物,以新鲜DNA样品用于PCR扩增大于1 000bp的片段时,后4种方法扩增效果优于前3种方法;DNA在-20℃下保存100d后重新进行PCR扩增时,则只有Qiagen试剂盒和再生Qiagen硅胶柱2种方法提取的DNA能扩增出大于1 000bp的片段。采用本实验室与新西兰坎特伯雷大学合作建立的再生硅胶柱与自配提取液提取小麦基因组DNA,既保证了DNA的高质量,又降低了使用试剂盒的成本,为小麦TILLING库的构建及其他相关试验提供了一种经济有效的DNA提取方法。     

转基因小麦的定性PCR筛选检测技术

为了建立转基因小麦的PCR检测方法标准,以B73、B72、B102三个被转入外源高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)基因的转基因小麦品系为材料,对目前国内外转基因小麦中通用的标记基因bar和uidA、NOS终止子和Ubiquitin启动子进行了定性PCR的筛选检测,在国内外首次找到了小麦中特有的内参照基因麦谷醇溶蛋白基因(GAG56D),设计并合成了麦谷醇溶蛋白基因(GAG56D)和Ubiquitin启动子的引物序列,并对PCR反应条件进行了优化,PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳分析后,可以检测到预期大小的目的片段.同时对PCR产物用实时荧光定量PCR进行了确证实验,并得到预期的结果.定性PCR最低检测灵敏度为0.5%(w/w).建立的转基因小麦定性PCR筛选检测方法具有通用性.     

半夏凝集素基因对小麦的遗传转化研究

为了拓宽农杆菌介导的小麦遗传转化的受体基因型,同时改良小麦品种的抗蚜特性,以甘肃省主推春小麦品种陇春22和优良品系9614的幼胚为转基因受体材料,以预培养4d的幼胚愈伤组织为受体,以含有半夏凝集素基因的C58c1农杆菌菌株为供体,将重组质粒pBI pta导入小麦,建立了农杆菌介导的小麦遗传转化体系。经G418 25mg.L-1抗性筛选、PCR检测共获得转基因植株7株,其中9614的4株,陇春22的3株;采用荧光定量PCR分析得出转基因植株中单拷贝的有1株,2个拷贝的1株,3个拷贝和4个拷贝的各有2株,1株没有得到扩增。对整合有2个拷贝半夏凝集素基因的陇春22-20转基因小麦的T1代植株进行了PCR检测,其中有50%的植株扩增出目的基因,50%没有扩增出目的基因,初步说明T1代植株中外源基因得到了遗传。     

一种适于PCR扩增的荞麦DNA大量提取及纯化方法

为满足对大批量材料进行分子标记检测的需要,以荞麦叶片为材料,针对荞麦叶片中黄酮含量高,提取荞麦基因组DNA时采用改良的CTAB方法,该方法提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳和检测,获得的DNA条带较亮、无RNA、无拖尾现象;经分光光度计检测获得数据证明酚类、蛋白质较少。利用ISSR引物对提取的荞麦基因组DNA进行PCR检测,能获得清晰稳定的条带,说明该方法提取的荞麦基因组DNA能满足PCR反应的需要。     

马铃薯卷叶病毒CP基因的RT-PCR扩增

根据马铃薯卷叶病毒CP基因的序列设计合成了两对特异性DNA引物,用RNA提取试剂RNAplant从感病的马铃薯叶片中提取总RNA,在3′引物引导下以总RNA为模板反转录合成cDNA第一链,然后进行PCR,分别扩增出了长627 bp和336 bp的特异性PCR产物,其大小与预期的CP基因及其部分序列一致,实现了马铃薯卷叶病毒CP基因及其片段的简便、有效的RT-PCR扩增。     

基因组DNA快速提取及在转基因大豆检测中的应用

基因组DNA的提取是DNA分子水平研究和检测的重要环节.为补充完善现场检测方法,根据硅膜吸附DNA的特性,结合过滤膜和注射器,开发一种现场快速提取植物基因组DNA的方法.选取大豆、棉花、油菜、玉米、水稻5种主要作物的叶片和种子为样品提取DNA,利用PCR和普通重组酶聚合酶扩增(recombinase polymeras...     

甘蔗锌指蛋白ShZP基因正义反义植物表达载体的构建及转化烟草

根据本实验室克隆的甘蔗锌指蛋白ShZP基因cDNA序列,在开放阅读框两侧设计特异引物,通过PCR扩增引入相应的酶切位点,把甘蔗ShZP基因的编码区(大小为725bp)cDNA片段,分别以正向和反向插入到中间载体pCRBI的Prd29A启动子和NOS终止子之间,构建了其正义植物表达载体pCRBIShZP和反义表达载体pCRBIantiShZP.采用冻融法分别将pCRBIShZP和pCRBIantiShZP导入根瘤农杆菌菌株EHA105中,通过农杆菌介导法对烟草进行转化,经过12mg/L的PPT连续抗性筛选,共获得23株抗性植株,对其中的5株转正义基因烟草植株和9株转反义基因烟草植株进行PCR检测,分别获得3株转正义基因的阳性植株和4株转反义基因的阳性植株.PCR检测结果初步证明外源甘蔗锌指蛋白ShZP基因已成功整合到烟草基因组中,这一研究为植物抗逆基因工程研究打下了一定的基础.     

冰草EST-SSR引物和小麦EST-SSR引物在黑麦属基因组的通用性分析

为研究黑麦属植物的遗传多样性,开发R基因组特有的分子标记并绘制其遗传连锁图谱,选用1 343对冰草EST-SSR引物和786对小麦EST-SSR引物对新疆杂草黑麦和栽培黑麦(共计6份材料)的全基因组进行了PCR扩增,结果显示,有679对冰草EST-SSR引物能够扩出清晰的条带,占引物总数的50.6%;其中有187对引物在6份黑麦材料基因组中扩增产物表现为多态性,占其引物总数的13.9%,平均每对引物扩增条带数为1.1。有364对小麦EST-SSR引物可扩增出清晰的条带,占其引物总数的46.3%;其中有135对引物在6份黑麦材料基因组中扩增产物具有多态性,占其引物总数的17.1%,平均每对引物扩增条带数为2.0。冰草EST-SSR引物在黑麦中的有效扩增效率高于小麦EST-SSR的有效扩增效率,但扩增多态性后者大于前者。两种来源引物扩增强带比率分别为51.8%和32.6%。结果表明小麦和冰草的EST-SSR引物均可用于黑麦基因组分析研究。     

玉米抗大斑病Ht基因有效SSR标记的筛选

以含有不同抗大斑病基因的鉴别寄主近等基因系为试材,选用分别位于Ht1、Ht2、Ht3、HtN附近的SSR引物进行PCR扩增检测,筛选到Ht1基因有效标记4对,Ht2基因有效标记7对,Ht3基因和HtN基因位点均没有检测到有效标记。     

应用PCR-DHPLC技术高通量快速检测转基因玉米

利用多重PCR结合DHPLC技术首次建立转基因玉米高通量快速检测方法。根据公布的转基因玉米外源基因序列设计并合成适合多重PCR的引物序列,以转基因玉米为模板,通过优化多重PCR和DHPLC的反应条件,建立一套同时快速筛选检测玉米中多种转基因成分的7重PCR-DHPLC检测方法。该方法的检测灵敏度为0.195 ng/μL,质粒检测灵敏度为1×103拷贝/μL。     

小麦中转基因成分PCR与实时荧光PCR的定性检测低限

为了确定小麦转基因成分PCR和实时荧光PCR方法的定性检测低限,将转基因小麦B73与非转基因小麦(检测外源基因)、小麦与大米(检测内源基因)分剐进行质量分数配比后提取DNA用于测定相对检测低限,再将100%转基因小麦B73的DNA进行浓度稀释用于测定绝对检测低限,并应用已知的NOS、bar、ubiquitin,ui-dA(GUS)外源基因和肌Wx012、GAG56D内源基因的引物和探针时模板DNA分别进行PCR与实时荧光PCR扩增.结果表明,最终确定PCR方法检测小麦转基因成分的相对检测低限为0.1%(质量分数),绝对检测低限为0.5 ng/ⅡL;实时荧光PCR方法的相对检测低限为0.1%(质量分数),绝对检测低限为0.01 ng/μL.所确定的检测低限可满足国家对转基因产品的最低标识要求.     

Optimisation of droplet digital PCR for determining copy number variation of α-gliadin genes in mutant and gene-edited polyploid bread wheat

Targeted and random mutagenesis of gene families require accurate quantification. Droplet digital PCR (ddPCR) enables high-throughput screening of copy number variation (CNV). We tested the accuracy of ddPCR for CNV analysis in the large α-gliadin gene family, using degenerate primers. First, duplex ddPCR assays measured α-gliadins in diploid (15–17 copies) and tetraploid (70–76 copies) wheat accessions and a corresponding number in resulting Synthetic Hexaploid Wheat, demonstrating linear amplification up to 86–95 genes. Second, we amplified 61 α-gliadin genes in Chinese Spring. Most α-gliadins of the homoeologous chromosomes 6A and 6D were correctly amplified, as corroborated using deletion and nullisomic-tetrasomic lines, but one group of genes from 6B were not amplified with these primers. Third, in Paragon we amplified 61 α-gliadin genes while selected γ-irradiated mutant lines revealed reductions of 25–50%. Finally, using two duplex ddPCR assays, we showed that CRISPR/Cas9-targeting of α-gliadins in Fielder produced indels (1–50 bp) in up to 10 α-gliadin genes plus large deletions (>300 bp) in 20 of 87 amplified α-gliadin genes. ddPCR is suitable for high-throughput screening of CNV and gene-editing-induced mutations in large gene families, in polyploids. In wheat, ddPCR enables screening of gliadins in breeding programs towards hypoimmunogenic gluten for coeliac patients.     

Separation of DNA for molecular markers analysis from leaves of the Vitis vinifera

In the present study, three DNA extraction procedures were examined to determine which might yield DNA from Grape leaves suitable for molecular analysis for RAPD, SSR. AFLP and etc analysis. The three methods examined were: the miniprep procedure and the modified CTAB for difficult species and protocol CTAB. Only the modified CTAB method consistently yielded DNA suitable for Polymerase Chain Reaction (PCR) amplification, regardless of plant growing conditions or leaf age. The quality and quantity of extracted genomic DNA gained from these methods are deliberated by means UV biophotometer, electrophoresis in 1.2% agarose gel and PCR. In this regard, application chosen for young and mature leaves, the most value of qualified DNA, is extracted from fully expanded leave when PVP was added to the extraction buffer. This same procedure also yielded PCR-amplifiable DNA from various other perennial, woody species and from other fruit species such as apple (Malus domestica), cherry (Prunus avium), peach (Prunuspersica), plum (Prunus domestica). DNA yield from this procedure is high (up to 1 mg g(-1) of leaf tissue). DNA is completely digestible with restriction endonucleases and amplifiable in the Polymerase Chain Reaction (PCR).     

农杆菌介导法向小麦茎尖导入DREB1A基因的研究初报

为了研究以小麦茎尖为受体进行农杆菌转化的可行性,选用小麦品种H6756,以茎尖为受体进行了农杆菌转化.构建了含有拟南芥逆境诱导转录因子DREB1A及除草剂bar基因的表达载体pC3300IS-DREB1A,酶切鉴定此载体,结果证明其连接完全正确,具有转录和表达的功能.农杆菌介导法向小麦茎尖导入DREB1A基因,共获得247株转化苗.转化苗经除草剂筛选,获得66株抗性苗,对抗性苗进一步进行PCR检测,有30株抗性苗扩增出特异性片段,转化率达到12.1%,初步说明本试验中以小麦茎尖为受体的转化系统用于基因转化是可行、高效的.     

转基因大豆中外源基因g10evo-epsps的qPCR检测方法的建立和验证

耐除草剂基因g10evo-epsps在我国转基因农作物研发中常常被用作目标性状基因或筛选标记基因,因此可作为转基因成分检测的重要筛查基因,但目前缺少相应的检测方法.本研究旨在建立g10evo-epsps基因特异性的实时荧光定量PCR(qPCR)检测方法,从而为转基因大豆的监测提供一种稳定可靠的方法体系.本研究基于转基因...     

转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法的建立

为了防止国外商业化生产的转基因番木瓜流入国内市场,建立转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法,对于保护国内消费者知情权意义重大。本研究以转基因抗环斑病毒番木瓜 55-1 为研究材料,利用外源基因和番木瓜基因组序列设计了 9 对特异性检测引物,通过特异性引物筛选、熔解曲线分析、退火温度优化、特异性验证、灵敏度分析及检测限验证,建立转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法。结果表明：本研究筛选出的检测引物,可特异的检出转基因番木瓜 55-1 转化事件,引物的检测灵敏度达到了 0.1%的标准,高于欧盟0.9%的检测要求,完全可满足转基因检测标识制度的顺利实施。     

转基因甘蔗BtG-2的T-DNA侧翼序列分析及其转化事件特异性检测

转基因甘蔗BtG-2是利用农杆菌介导法把Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因导入‘新台糖22号’的转基因甘蔗株系,具有良好的抗虫特性和农艺性状。为了明确转基因甘蔗BtG-2的分子特征及其检测方法,推进其生物安全性评价工作,以BtG-2的T2代为研究材料,利用Southern杂交检测外源基因在转基因甘蔗基因组内的拷贝数;利用染色体步移技术分离外源基因在甘蔗基因组中插入位点的侧翼序列,并建立了该转化体高效灵敏的特异性PCR检测方法。结果表明：Southern杂交检测证明外源T-DNA以单拷贝方式插入BtG-2株系;经过3次的热不对称巢式PCR扩增,获得外源基因T-DNA左边侧翼序列984 bp和右边侧翼序列705 bp;以这2个序列和相应的T-DNA的左右端序列分别设计3对检测引物对,建立了BtG-2株系的转化事件特异性PCR检测方法,扩增效率最高的引物对LS011/LA451和RS160/RA588分别扩增到440 bp和428 bp的特异片段。其中T-DNA左侧设计的LS011/LA451检测引物对扩增的灵敏度高、特异性强,能够在甘蔗BtG-2基因组DNA相对含量为0.1%的模板中检测出转基因目的成分,相当于9个单倍体基因组拷贝数。本研究完成了转基因株系BtG-2的分子特征及其转化事件特异性检测,为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。     

A specific qualitative and real-time PCR detection of MON863 maize based on the 5′-transgene integration sequence

Genetically modified crops are widely grown in the world today. Labeling is required when genetically modified organisms (GMOs) are placed on the market. There is a need to establish a specific method for the detection of genetically modified foods. MON863 transgenic maize containing a Cry3Bb1 sequence that produces insecticidal protein cry3Bb1 is a major GMO crop. In this paper, we report studies that designed specific PCR primers and TaqMan probes based upon the 5′-transgene integration sequence, and developed qualitative and quantitative PCR conditions using these primers and probes. We determined the 5′-transgene integration sequence using a ligation-mediated polymerase chain reaction (LM PCR) method. In qualitative PCR studies, the limit of detection (LOD) was 0.5% for MON863 in 100 ng genomic DNA. In the quantitative PCR assays, the limit of detection (LOD) and limit of quantitation (LOQ) are 10 and 100 haploid copies, respectively. Maize samples with different contents of genetically modified component were tested using the established TaqMan real-time PCR system.