一种快速高效的DNA提取方法研究

DNA提取技术是分子实验的一个重要步骤,快速、高效的植物DNA提取方法是样品需要量大的分子实验的一个关键技术。本实验通过改进传统的DNA提取方法,使用96孔联体试管板,而不是单个离心试管,对叶片进行冷冻干燥后粉碎,无需使用液氮。在实验过程中,使用排枪操作,CTAB法提取DNA。以小麦为例,依据该方法提取幼苗叶片DNA,并选取6对引物对DNA样品进行PCR扩增,使用ABI PRISM 3730 DNA分析仪对扩增产物进行分析,以检测提取的DNA质量。结果表明,本实验的DNA提取方法所得到的PCR扩增条带均有较高的强度。在6对实验引物的扩增结果中,扩增条带强度最好的引物有98%的样品在6 935～16 786 RFU( Relative Fluorescence Unit)之间;扩增条带强度较低的引物有93% 的样品在532～1 111 RFU之间;在所有的PCR扩增反应中,最低PCR扩增条带强度为205 RFU,缺带样品数量平均只有0.8%。按照本实验的方法操作,每人每天可提取上千个样品的DNA。因此,该DNA提取方法是一种高效、快速、能获得高质量DNA的有效方法。     

基因组DNA快速提取及在转基因大豆检测中的应用

基因组DNA的提取是DNA分子水平研究和检测的重要环节。为补充完善现场检测方法,根据硅膜吸附 DNA的特性,结合过滤膜和注射器,开发一种现场快速提取植物基因组DNA的方法。选取大豆、棉花、油菜、玉米、 水稻5种主要作物的叶片和种子为样品提取DNA,利用PCR和普通重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase am⁃ plification, RPA）对快速提取和QIAGNE试剂盒提取的DNA进行内源基因的扩增。结果显示,快速方法不需要离心 机,现场3分钟完成DNA提取;在DNA得率上要高于QIAGEN方法,但在DNA纯度上低于QIAGEN方法。不过两种 方法提取的DNA都能满足PCR和RPA的需要。利用DNA快速提取方法结合普通PCR、荧光RPA和荧光定量PCR 对转基因大豆SHZD32-1进行实际检测,3种方法的检测结果一致,均能准确检出大豆SHZD32-1的转基因成分。     

小麦幼叶DNA微量快速提取方法的改进

为满足对大批量材料进行分子标记检测的需要,以小麦幼叶为材料,探索了在液氮和无液氮条件下提取DNA方法的改进.结果表明,改进提取法Ⅰ(用液氮)中,水浴中加KCl抽提一次便可得到质量较好的DNA,且液氮用量是常规提取法的1/40～1/30;改进提取法Ⅱ(无液氮)中,水浴后加KCl比水浴前加KCl及不加KCl的RNA含量和杂质含量低,OD260/OD280比值大,DNA浓度和纯度有所提高.两种改进方法提取的DNA经琼脂糖凝胶电泳检测都能得到质量较高的DNA图谱,又经SCAR-PCR扩增均能得到2条片段大小相同的条带.     

一种高效便捷的水稻DNA提取法及其应用

 以水稻叶片、根和种子为材料,采用高通量快速法提取基因组DNA,用稻瘟病Pita基因分子标记进行检测,获得与预期片段大小一致的特异性条带,对165份育种材料的检测结果与稻瘟病接种鉴定一致。操作方法如下：将少量水稻叶片、根或种子放入 200 μL PCR盘中,加入70 μL 缓冲液A (含NaOH和Tween20),在PCR仪中加热到95℃,保持 10 min,再加入70 μL 缓冲液B (Tris HCl和EDTA),该提取液可以直接用于PCR扩增。该方法具有几个优点：1）成本低,仅用4种化学试剂,共140 μL 提取液;2）操作简便,仅需3步,每人每天可以提取上千份样品;3）仪器设备简单,只用常规的PCR仪;4）可直接提取干种子的DNA;5）DNA质量好,能检测出水稻中的抗稻瘟病单基因Pita,并且与稻瘟病接种鉴定结果一致;6）用量少,只需要 5~20 mg 叶片、20 mg 根或半粒籽粒。尤其是检测大量样本的基因型时, 此种方法更显得高效便捷。     

一种快速高效适于橡胶树叶片AFLP分析的DNA提取方法

以近200个巴西橡胶树种质材料(品种及无性系)幼嫩叶片为材料，采用改良的CTAB法对其基因组总DNA的提取进行了研究。结果表明，该方法提取的DNA溶液无色透明，OD260 /OD280 的比值均为1.8～2.0，1%琼脂糖凝胶电泳为清晰的一条带，无降解现象，RNA去除干净，能被限制性内切酶完全消化；其AFLP分析(引物EcoRI- TA/MseI- CTT)条带清晰，多态性好，说明此方法提取的巴西橡胶树幼嫩叶片基因组总DNA较适于AFLP分析。     

大豆种子DNA的提取方法

用大豆干种子和叶片分别为材料，进行以PCR为目的大豆模板DNA的提取和分析。实验结果表明：利用大豆干种子为材料，虽然在提取DNA量上比用叶片提取的少，但对PCR扩增结果没有影响。因此，用大豆干种子直接提取DNA可以节省育苗时间，获得完全可以满足试验要求的大豆模板DNA。     

小麦TILLING突变体检测中基因组DNA提取方法的优化

为了优化小麦高通量TILLING突变体扫描所需基因组DNA提取的方法,对利用SDS法、改良SDS法、CTAB法、改良CTAB法、AxyPrep DNA提取试剂盒、Qiagen DNeasy Plant Mini Kit试剂盒以及再生Qiagen硅胶柱方法提取的小麦基因组DNA进行了系统比较。结果表明,尽管7种方法所提取DNA的纯度及琼脂糖凝胶电泳检测结果均良好,但再生Qiagen硅胶柱方法、CTAB法和改良SDS法的DNA浓度显著高于其他方法。根据小麦细胞分裂素氧化酶基因1(TaCKX1)的DNA序列设计引物,以新鲜DNA样品用于PCR扩增大于1 000bp的片段时,后4种方法扩增效果优于前3种方法;DNA在-20℃下保存100d后重新进行PCR扩增时,则只有Qiagen试剂盒和再生Qiagen硅胶柱2种方法提取的DNA能扩增出大于1 000bp的片段。采用本实验室与新西兰坎特伯雷大学合作建立的再生硅胶柱与自配提取液提取小麦基因组DNA,既保证了DNA的高质量,又降低了使用试剂盒的成本,为小麦TILLING库的构建及其他相关试验提供了一种经济有效的DNA提取方法。     

油菜高纯度线粒体DNA的高效提取及检测

为了建立一种快速、有效的油菜线粒体DNA（mtDNA）提取方法,以30℃黑暗条件下培养的油菜黄化苗为材料,通过差速离心结合蔗糖缓冲液洗涤和垫衬,利用50-250g材料分离线粒体,经SDS裂解后抽提纯化,可从每10g黄化苗中得到1μg以上的mtDNA。所获得的mtDNA经琼脂糖凝胶电泳检测发现仅有一条大小在10kb以上的条带,没有明显的降解现象,完整性良好,适用于PCR等常用分子生物学实验需要。利用细胞核基因的特异性引物进行PCR检测,证实没有核基因组的污染。与密度梯度离心法提取mtDNA相比,该方法具有对设备的要求低、提取效率高、纯度好等优点,是进行线粒体基因组及其控制的重要性状分子生物学研究的关键基础技术。     

2种提取椰子树RNA方法的比较研究

椰子树组织中富含多糖和酚类化合物，为了获取高质量的RNA，笔者以椰子树叶片和根部为材料，比较分析CTAB法和SDS法提取RNA的效果。结果表明：CTAB法提取椰子树组织的总RNA效果较好，能有效克服酚类物质和多糖对RNA提取的影响。经OD值检测和电泳检测，总RNA的28 S和18 S条带清晰可见，纯度较高，完整性好，无明显降解，以此RNA为模板进行RT-PCR反应，能获得特异条带，表明该RNA完全可以用于后续的分子生物学操作。     

不同方法从大豆不同组织中提取基因组DNA效果的比较

从大豆组织中获得高质量和足够产量的基因组DNA,是进行大豆分子生物学研究的基础.为进行大豆基因组的PCR,RAPD,SSR等分子生物学研究,分别以大豆种子和其叶片为实验材料,采用改良的SDS法和CTAB法对大豆基因组DNA进行了提取.对DNA的提取效果,采用紫外分光光度检测、琼脂糖凝胶电泳分析及DNA的限制性内切酶图谱分析进行了综合比较.结果表明,在以叶片为材料时,SDS法和CTAB法的大豆基因组DNA的提取效果差别不大,SDS法稍好于CTAB法.在以大豆种子为材料时,SDS法的提取效果明显优于CTAB法,SDS法可从大豆种子中提取到能够充分满足各种分子操作的高质量和数量的大豆基因组DNA.     

甜菜基因组DNA三种提取方法的对比研究

采用CTAB法、SDS法、蛋白酶K法分别提取甜菜基因组DNA,并对得到的DNA进行含量测定、PCR扩增效果鉴定、限制性内切酶酶切。比较3种方法的提取效果,结果表明:CTAB法提取的DNA产量最高,蛋白质和多糖含量低,PCR结果和酶切结果均比较好;SDS法提取的DNA产量也较高,PCR结果不如CTAB法效果好;蛋白酶K法提取的DNA产量最低,且含有较多的RNA,PCR扩增无结果。所以,CTAB法是适合于甜菜基因组DNA提取的最佳方法。     

彩色甜椒基因组DNA提取方法的优化

以不同颜色的甜椒为试验材料，采用CTAB法、SDS法、ROSE法和氯化苄法提取彩色甜椒基因组DNA。结果表明，CTAB法所提取DNA的质量和纯度较高，以此DNA为模板进行RAPD-PCR分析，DNA扩增效果较好，带形清晰、整齐，说明CTAB法提取的DNA较为完整，能用作RAPD-PCR模板来开展彩色甜椒分子水平的研究。     

一种可用于PCR分析的水稻DNA简易提取法

 以水稻黄化苗为材料，用NaOH溶液抽提DNA，对其用于基于PCR技术的DNA标记中的效果进行了分析。结果发现，用0.5 mol/L NaOH对黄化苗进行直接处理，并用等量1 mol/L Tris-HCl进行稀释、中和，离心所得的上清液即可直接用于各种PCR扩增和随后的DNA标记鉴别，包括转基因PCR片段检测、微卫星标记多态性分析(琼脂糖电泳法或毛细管电泳法)，用这种方法提取的DNA可以在短期内保存，在PCR分析中其效果与用常规CTAB法提取的DNA相当。     

内参法在线粒体DNA纯度鉴定中的应用

为了确定普通差速离心法提取的小麦线粒体DNA(mtDNA)的纯度,以小麦肌动蛋白β亚基(β-Actin)、1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶大亚基(RabcL)和细胞色素C 氧化酶第三亚基(COXIII)基因的片段作为内参标记,依靠聚合酶链式反应(PCR)及琼脂糖凝胶电泳技术,对提取的mtDNA进行了检测.结果表明,普通差速离心法提取的mtDNA中混杂有核DNA和叶绿体DNA(ctDNA).对提取的mtDNA稀释后再进行内参法检测,结果发现,当mtDNA稀释到DNA原液的300～400倍时,混杂其中的核DNA已达不到PCR反应的敏感度,但mtDNA、ctDNA仍能满足作为PCR反应体系模板的要求.此时,提取到的mtDNA可视为无核DNA污染的细胞质基因组DNA.     

A Simplified Rice DNA Extraction Protocol for PCR Analysis

DNA molecular marker technology has been advancing rapidly during past decades and its application perspective seems very brilliant in crop breeding, varietal purity test of crop seeds and germplasm fingerprinting [1]. Among various DNA markers, the PCR-based marker is the most popular and efficient one since it needs small amounts of DNA with relative low quality [2]. Meanwhile, PCR is also an essential approach for detection of target genes in transgenic breeding and genetic modified (…     

橡胶林土壤微生物2种DNA提取方法的比较

比较了橡胶林土壤微生物CTAB-SDS提取法和SDS提取法的效果。结果表明,2种提取方法均获得约 23.1kb的DNA片段,2种提取方法在颜色、提取量和纯度上存在较大差异。CTAB-SDS提取法提取DNA的纯度较好,不需要纯化可以直接用于PCR扩增、酶切等后续操作;SDS提取法提取的纯度低,不能直接用于PCR扩增。2种方法都适合橡胶林土壤DNA的提取,如果要求获得纯度高的DNA,CTAB-SDS提取法是最佳选择。橡胶林土壤微生物DNA的提取,推荐使用CTAB-SDS提取法。     

橡胶树胶乳全蛋白的提取及双向电泳分析

以橡胶树无性系RRIM600为材料，采用TCA(三氯乙酸)-丙酮沉淀法提取胶乳全蛋白，17 cm pH 5～8固相pH梯度预制干胶条和快速银染法对提取的蛋白进行分离和染色，所得到的电泳图谱背景清晰，横条纹和竖条纹少，且蛋白点数量多。通过本研究获得了高分辨率的胶乳全蛋白双向电泳(2-DE)图谱的方法，为进一步开展橡胶树胶乳全蛋白质组学研究奠定了基础。     

Rapid DNA extraction protocol from stool, suitable for molecular genetic diagnosis of colon cancer

BACKGROUND: Colorectal cancer (CRC) is one of the most common forms of cancers in the world and is curable if diagnosed at the early stage. Analysis of DNA extracted from stool specimens is a recent advantage to cancer diagnostics. Many protocols have been recommended for DNA extraction from stool, and almost all of them are difficult and time consuming, dealing with high amount of toxic materials like phenol. Their results vary due to sample collection method and further purification treatment. In this study, an easy and rapid method was optimized for isolating the human DNA with reduced PCR inhibitors present in stool. METHODS: Fecal samples were collected from 10 colonoscopy-negative adult volunteers and 10 patients with CRC. Stool (1 g) was extracted using phenol/chloroform based protocol. The amplification of P53 exon 9 was examined to evaluate the extraction efficiency for human genomic targets and also compared its efficiency with Machiels et al. and Ito et al. protocols. RESULTS: The amplification of exon 9 of P53 from isolated fecal DNA was possible in most cases in 35 rounds of PCR using no additional purification procedure for elimination of the remaining inhibitors. CONCLUSION: A useful, rapid and easy protocol for routine extraction of DNA from stool was introduced and compared with two previous protocols.     

巴西橡胶树胶乳DNA的提取及特性分析

利用改良的SDS-醋酸钾沉淀法可以有效分离纯化胶乳DNA。胶乳经过高速离心后分为3层,上层主要是橡胶粒子,中间层是胶乳的可溶性胞质成分即C-乳清,下层主要是黄色体。分别对这3层组份进行DNA提取分析,结果显示胶乳DNA主要存在于黄色体层。限制性内切酶分析表明所得胶乳DNA是序列不均一的DNA分子。胶乳DNA主要由线粒体DNA和少量细胞核DNA组成。健康树中胶乳DNA含量要大于死皮树胶乳DNA含量。