农杆菌介导向玉米茎尖导入HAL1基因的初步研究

选用玉米优良自交系郑58的茎尖为受体,研究以玉米茎尖为受体进行农杆菌转化体系的可行性。用农杆菌介导法将耐盐碱基因HAL1转入玉米中,获得70株转化苗,经过300 mg/L的除草剂(Basta)筛选,共获得9株转基因植株。进一步进行 PCR检测,其中6株表现阳性,转化率达8.57%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体孢子体的转化系统可用于基因转化。     

根癌农杆菌介导的大麦茎尖转化研究

为了建立农杆菌介导的大麦茎尖遗传转化技术,以我国大麦主推品种鄂大麦9号、鄂大麦32122为材料,以农杆菌介导法转化大麦茎尖,经PPT筛选获得了转抗除草剂基因的大麦株系。PCR鉴定表明,以鄂大麦9号茎尖为受体,筛选获得4个转基因植株,阳性率为0.59%;以鄂大麦32122茎尖为受体,筛选获得10个阳性植株,阳性率为1.96%。转基因T1代Southern杂交分析证实,外源基因确已整合到大麦基因组中,已鉴定的转基因株系均含单个转基因拷贝,不同转基因株系整合的位点不同。因此大麦茎尖可作为农杆菌转化的受体。本研究结果为拓宽大麦遗传转化受体提供了技术和方法。     

农杆菌介导的大豆植株整体转化

农杆菌介导的植物整体转化法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导人的受体,通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触,以完成可遗传细胞的转化,通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代.以大豆幼苗的顶端生长点和叶腋生长点为靶点,通过农杆菌介导的整体转化法--注射法进行转录因子DREB1C基因的遗传转化,最终获得6株T0代PCR阳性转基因植株,转化率为9.2%.T1代植株的PCR、Southern blot和RT-PCR鉴定结果表明获得1株阳性植侏,DREB1C基因以单拷贝形式整合于大豆基因组中,在200 mmol·L-1NaCl胁迫条件下在转录水平得到成功表达.该方法克服了大豆组织培养再生难、转化率低的缺点,是一种高频、简单、快捷的非组培遗传转化途径.     

农杆菌介导植酸酶基因转化大豆的研究

以大豆胚尖为受体,利用农杆菌介导法将来源于泡盛曲霉的植酸酶基因phy转入黑农37和吉林小粒豆中。此法取材方便,操作简单,产生嵌合体的可能性低。在筛选培养基中经草胺膦(1.0 mg.L-1)筛选,获得抗性植株。对获得的草胺磷抗性植株采用除草剂(10%Basta)筛查表型鉴定与目的基因、筛选标记基因PCR分子检测相结合的方法,检测结果直观、可信度高。最终获得5株阳性植株,转化率为0.5%。     

半夏凝集素基因对小麦的遗传转化研究

为了拓宽农杆菌介导的小麦遗传转化的受体基因型,同时改良小麦品种的抗蚜特性,以甘肃省主推春小麦品种陇春22和优良品系9614的幼胚为转基因受体材料,以预培养4d的幼胚愈伤组织为受体,以含有半夏凝集素基因的C58c1农杆菌菌株为供体,将重组质粒pBI pta导入小麦,建立了农杆菌介导的小麦遗传转化体系。经G418 25mg.L-1抗性筛选、PCR检测共获得转基因植株7株,其中9614的4株,陇春22的3株;采用荧光定量PCR分析得出转基因植株中单拷贝的有1株,2个拷贝的1株,3个拷贝和4个拷贝的各有2株,1株没有得到扩增。对整合有2个拷贝半夏凝集素基因的陇春22-20转基因小麦的T1代植株进行了PCR检测,其中有50%的植株扩增出目的基因,50%没有扩增出目的基因,初步说明T1代植株中外源基因得到了遗传。     

利用农杆菌介导合子胚转化法将Bar基因转入玉米自交系的研究

基于农杆菌介导的合子胚转化方法是一种具有自主知识产权的转基因新方法。利用该方法转化玉米合子胚,可直接获得转化种子。以东北春玉米区玉米自交系8902、Pa91、丹340作为转化受体,通过合子转化法进行抗草丁膦除草剂基因Bar的转基因研究。在获得的3 560份材料中,通过对T_1代种子苗叶面喷施草丁膦除草剂Basta,共获得153株抗性植株,抗性频率为4.3%。PCR鉴定阳性植株为102株,转化频率为2.87%。对PCR检测出的阳性植株进行自交获得T_2代,对材料继续进行抗性筛选,对抗除草剂表型的分离比率进行抗性遗传分析。     

人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子在大豆中表达的初步研究

构建了人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（hGM-CSF）的植物表达载体pCAMBIA3300-CSF-KD，转化大豆，获得转hGM-CSF基因的植株。hGM-CSF的植物表达载体pCAMBIA3300-CSF-KD，该因子末端被加上内质网驻留信号（KDEL），适合在植物中表达。用大豆合丰47的茎尖作为外植体，通过农杆菌介导的转化，获得17株T1转化株。PCR扩增验证转基因植株，检测到11株阳性植株。     

利用玉米萌动胚转化体系获得抗除草剂转基因新材料

以玉米杂交种郑单958为受体材料, 建立农杆菌介导的玉米萌动胚转化体系, 并获得抗除草剂转基因玉米材料。经过对农杆菌菌液浓度、共培养时间、乙酰丁香酮的浓度的优化, 农杆菌介导的玉米萌动胚转化法的最优参数为菌液浓度OD₆₀₀值为0.8, 共培养时间为48 h, 乙酰丁香酮的浓度为100 μmol/L。获得69株PCR阳性植株, 其中54株为bar基因金标免疫试纸条检测阳性植株, 29株获得种子;T1代植株具有草丁膦抗性, 并显示出胶体金免疫酶联反应阳性, 表明目的基因已整合玉米基因组内并有效表达, 而且能够稳定遗传给后代。     

根癌农杆菌介导小麦成熟胚遗传转化影响因素的研究

为了进一步完善根癌农杆菌介导的小麦遗传转化体系,以小麦成熟胚为转化受体,研究了根癌农杆菌介导法转化小麦的主要影响因素,结果表明,以gus基因瞬时表达率、抗性愈伤组织获得率和分化率为转化指标,小麦成熟胚在预培养基CM4C1P上预培养14d后,用侵染培养液Ⅰ侵染3 h,再经干燥共培养方式处理3 d,是根癌农杆菌介导成熟胚转化的合适条件.在优化条件下,转化约30 d后GUS稳定表达的愈伤组织数占受体组织总数的15.83%;GUS稳定表达的抗选择剂G418的植株数占受体组织总数的0.28%.     

农杆菌侵染玉米芽尖转化BcWRKY1转录因子基因的初报

以玉米自交系鲁9801、K10芽尖为受体,采用农杆菌介导法转化BcWRKY1转录因子基因,同时优化了遗传转化体系。结果表明,乙酰丁香酮浓度为100μmol/L、0.05个大气压下真空处理侵染10 min转化率最高。实验共筛选出98株除草剂抗性植株,其中23株PCR呈阳性,18株结实。     

根癌农杆菌介导的大豆子叶节转化体系的优化

以13种不同基因型的大豆为材料,研究了大豆外植体再生过程中不同大豆基因型对丛生芽数目的影响,选取优势基因型为受体材料,比较了在草丁膦和潮霉素筛选压力下外植体的再生情况,并确定其合适的筛选浓度,在对农杆菌介导的子叶节转化体系优化的基础上进行了大豆转化效率的研究。结果显示:在相同的芽诱导条件下,山宁14产生的丛生芽最多,更适合于大豆子叶节转化;与其它筛选剂相比,采用潮霉素的梯度筛选更有利于抗性苗的成活,其最适筛选浓度为8 mg.L-1;通过检测GUS基因的表达和分子鉴定证明外源的GUS基因已插入到转基因植株的基因组中,转化效率达到3.2%。     

几丁质酶基因转化甜菜的初步研究

本试验通过农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）介导法将菜豆几丁质酶基因导入甜菜（Ｂｅｔａ ｖｕｌｇａｒｉｓ,Ｌ．）,再生植株经卡那霉素筛选后,进行ＰＣＲ分析,结果表明：再生植株的转化率为２７．３％,甜菜叶柄是转化的较好受体。     

利用农杆菌介导法将BrCS基因导入大豆的研究

以大豆子叶节作为外植体,通过农杆菌介导法将含有BrCS基因的pCAMBIA3300的双子叶植物表达载体,导入到大豆品种黑农59和黑农53中,并对黑农59遗传转化的影响因素进行了优化,最终获得了抗性植株.经PCR检测和PCR-Southern杂交分析,初步证明了目的基因已整合到大豆的基因组中.     

大豆转化体系的优化和Dof4基因转入大豆的研究

研究优化了包括种子消毒方法、生长调节剂用量和抗生素种类在内的影响农杆菌介导大豆子叶节遗传转化效率的多个因素,并将Dof 4基因转入绥农14中.结果表明:氯气熏蒸消毒方法对大豆伤害小,子叶节丛生芽分化率高;菌液侵染时间和共培养时间控制直接影响长菌和丛生芽状态.芽诱导培养阶段,当6-BA 浓度为1.6 mg·L-1,IBA浓度为0.1 mg·L-1,分化率较高,畸形率和愈伤状况都较轻.最优的抗生素组合为头孢噻肟钠(Cefotaxime Sodium)200 mg·mL-1 加羧苄青霉素(Carbenicillin) 250 mg·mL-1.     

根癌农杆菌介导的马铃薯高效遗传转化体系的研究

通过根癌农杆菌介导的遗传转化方法,建立了马铃薯栽培品种“费乌瑞它(Favorita)”茎段和试管薯的遗传转化体系,其转化频率分别可达25.6%和36.8%。实验结果表明,玉米素有助于茎段和试管薯转化再生芽的分化,乙酰丁香酮可以提高茎段的转化率,但对试管薯的转化作用效果不明显。卡那霉素生根筛选和PCR鉴定结果显示,在分化培养基上再生的转化植株假阳性率较高,在遗传转化工作中要加大转基因植株的数量,才有可能获得所期望的转基因植株群体。     

通过农杆菌介导将菜豆几丁质酶基因导入马铃薯

选用两个生产上主栽马铃薯品种“鲁引 1号”和“鲁引 4号”的试管微型薯为材料 ,通过农杆菌介导成功地将菜豆几丁质酶基因导入到马铃薯中。试管微型薯薯片与农杆菌共培养 3d后 ,转到含卡那霉素 10 0mg/L的分化培养基上诱导不定芽分化。待抗性芽长到 1 0～ 1 5cm高时 ,转入含卡那霉素 10 0mg/L的液体培养基中进行生根筛选。经过分化和生根两轮筛选的转化植株的PCR检测结果均为阳性 ,而未经转化的对照植株为阴性 ,证明该筛选系统是可靠的。早熟品种鲁引 1号的转化频率明显高于晚熟品种克新 4号 ,其最高转化频率为 4 1 0 % ,平均每个外植体可得到 3 85株转化苗。转化植株的抗病性鉴定正在进行中     

Bt基因导入马铃薯品种大西洋的研究

通过基因工程手段,利用农杆菌介导法,将Bt基因导入马铃薯品种大西洋,同时对马铃薯品种大西洋的叶片再生体系进行优化,探讨了影响植株再生频率和遗传转化效率的因素,确立了最佳植株再生体系和遗传转化条件,获得了转基因植株。     

In vitro direct plant regeneration and Agrobacterium‐mediated transformation of lucerne (Medicago sativa L.)

In vitro direct plant regeneration of lucerne was achieved by simultaneous application of thidiazuron (TDZ) and 6‐benzyladenine (BA) in Murashige and Skoog (MS) medium. Seedlings were germinated and grown for 6 d on growth regulator–containing MS medium. The shoot tip, consisting of the apical meristem along with parts of the cotyledonary leaves and hypocotyl, was then cultured on a medium containing the growth regulator(s). Adventitious budding of the shoot tip was promoted synergistically by treatment with TDZ and BA, and a maximum of thirty‐five shoots per explant was obtained on a medium supplemented with 2 mg L^?1 TDZ and 1 mg L^?1 BA. Plant regeneration frequency varied from 67 to 93%, and five Indian lucerne cultivars responded well to the regeneration protocol. The Agrobacterium‐mediated transformation frequency from co‐cultivated explants was 13% following multiple shoot induction. Southern analysis of the T₀ plants and T₁ progenies confirmed stable inheritance of the hpt marker gene. Agrobacterium infection of the explant caused a significant reduction in the plant regeneration frequency (23%) and the number of shoots induced (11) when compared with uninfected explants. A single shoot tip provided sufficient material to regenerate and establish twenty‐seven lucerne plants, whereas only nine plants could be regenerated from an Agrobacterium co‐cultivated explant. This transformation protocol could represent a valuable improvement over existing ones for lucerne.