堆型艾美球虫广东株3—1E基因的克隆与序列分析

根据GenBank中登录的堆型艾美球虫3—1E基因序列，设计了3条引物，以广东株堆型艾美球虫裂殖子总RNA为模板，利用反转录一聚合酶链反应(RT—PCR)扩增获得了3—1E基因部分片段，将这一片段克隆至pGEM—TEasy载体中，经PCR、限制性内切酶分析和克隆片段的序列测定、比较，证实了克隆片段的可靠性。序列比较发现，所克隆的基因片段与Eimeria acervulina美国株(US)、E.acervulina QH株3—1E cDNA的核苷酸同源性分别为99．0％和99．2％，推导氨基酸的同源性分别为98．2％和97．6％。     

伪狂犬病病毒Min—A株gE基因的克隆及序列分析

参考GenBank中伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列设计了1对引物，对PRVMin—A株进行了PCR扩增，扩增产物克隆于pGEM—TEasy载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序，证实了克隆片段的可靠性。测序结果表明，目的片段包含1个1740bp的开放性阅读框(ORF)，编码由579个氨基酸组成的多肽。同源性分析表明，PRVMin—A株与PRVEa株、SH株PE基因的核菩酸同源性分别为99．2％、98．7％；推导氨基酸的同源性分别为98．6％、97．2％。     

Enterocin A结构基因和免疫基因的克隆及序列特征分析

采用PCR技术从屎肠球菌的染色体DNA上扩增到1条529 bp的DNA片段entAIc，以pGEM—T为载体，将该基因片段克隆到大肠杆菌中，对阳性重组质粒pGAI测序。序列分析结果表明：片段entAIc含有2个ORF，Enterocin A结构基因ent A和免疫基因entI，2个基因紧密相连。核苷酸序列分析显示，不同菌株来源的ent A和ent I具有较高的同源性，分别达到99．87％和99．76％。氨基酸序列分析显示不同菌株来源的Enterocin A前体完全相同，免疫蛋白仅有1个氨基酸差异。     

伪狂犬病病毒Ea株糖蛋白基因gL的克隆和序列分析

根据已发表的基因序列设计了1对PCR引物，以伪狂犬病病毒Ea株(pseudorabies virus Ea，PRv Ea)基因组DNA为模板．扩增出一大小为511bp的片段。通过酶切和测序证实，该基因为伪狂犬病病毒Ea株的又一糖蛋白基因，即gL基因。Blast软件分析表明，该基因与Kaplan株核苷酸序列的同源性为94％，氨基酸序列的同源性为95％。将测序结果输入GenBank，获得登录号AF448456。     

禽传染性支气管炎病毒S1基因毕赤酵母表达载体的构建

本试验根据已公布的IBV株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列，去掉由18个氨基酸构成的信号肽后，设计一对IBV S1基因表达片段的PCR引物，利用RT—PCR扩增得到了IBV四川分离株的S1基因片段，将该片段克隆到PMD18-T载体上，通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、菌落PCR鉴定，证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒，测序分析片段长为1566bp，已经成功切除了由18个氨基酸构成的信号肽序列。将该基因亚克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点，并通过菌落PCR、双酶切鉴定了该重组质粒的正确性，IBV S1基因毕赤酵母表达载体的构建为进一步利用毕赤酵母表达IBV S1蛋白提供了基础材料，并对表达产物的免疫原性和禽传染性支气管炎基因亚单位疫苗及特异性诊断抗原的研究打下了基础。     

猪CuZnSOD基因片段的克隆及不同生长阶段猪肝脏CuZnSOD基因表达的差异

从体质量1、20、40、60、90kg左右的杜长大猪的肝脏组织中提取基因组RNA，RT—PCR扩增CuZnSOD基因，获得了1务255bp的片段，以pGEM—TEasyVector为载体，将该片段克隆到大肠杆菌（E．coli）中，筛选阳性克隆测定其序列，分析表明该片段与报道的猪CuZnSODcDNA部分序列同源性达到100％，编码85个氨基酸组成的多肽，是成熟肽的一部分。以CuZnSOD基因片段的克隆为基础，构建了优化的半定量RT—PCR法，以18SrRNA为内标，研究不同生长阶段猪肝脏组织中CuZnSOD基因mRNA表达的差异。结果显示，1kg左右猪肝脏组织中CuZn—SODmRNA表达水平较高，体质量1～20kg猪的肝脏组织中CuZnSOD基因表达量呈下降趋势，体质量40kg的猪又显著上升，到生长后期即体质量90kg左右，CuZnSOD基因表达量又急剧下降。     

猪胸膜肺炎放线杆菌apxⅠA基因的克隆及其原核表达

参照GenBank上登录的猪胸膜肺炎放线杆菌血清5型菌株(AF363361)的apxⅠA基因序列设计了1对特异性引物，用PCR法扩增apxⅠA基因，获得了3069bp的片段，将其克隆到pMD18-T载体，经酶切、PCR鉴定和序列分析，表明克隆是成功的。再将长为1149bp的apxⅠA基因的部分片段(编码ApxⅠ的N-端的片段)插入到原核表达载体pET-28(a)中，构建了重组表达质粒pET—apxⅠA，转化大肠埃希氏菌JM109(DE3)，在IPTG诱导下获得了高效表达，经SDS-PAGE检测，证实表达产物大小约为41ku。     

犬新孢子虫NcSRS2基因真核表达质粒的构建

根据犬新孢子虫NcSRS2基因序列，设计了1对含有Kozak序列、PstⅠ和XbaⅠ酶切位点的引物，以含有NcSRS2基因的质粒P43为模板，经PCR扩增获得NcSRS2 ORF基因片段，用PstⅠ和XbaⅠ双酶切该片段，回收得到含有以上2个酶切位点黏端的NcSR2 ORF基因，将此基因片段克隆至相同酶切回收后的pcDNA3．1（＋）真核表达载体中，获得重组质粒pcNCSRS2。经PCR鉴定、限制性内切酶分析和克隆片段序列测定、比较，证实了重组质粒的正确性。     

大肠埃希菌O157:H7 eaeA基因的克隆及其表达质粒的构建

采用自行设计的引物，应用PCR方法直接从广东分离株大肠埃希菌0157：H7021210的染色体DNA中扩增出既8A基因的完整阅读框，得到了一条大小约为2800bp的基因片段。T—A克隆后将其亚克隆至原核表达载体pET-28a（＋），经PCR鉴定、酶切鉴定及核苷酸序列测定，证实成功构建原核重组表达质粒pET—eaeA。大肠埃希菌O157：H7eaeA基因的克隆及原核表达质粒的成功构建，为下一步进行诱导表达、活性鉴定及既8A基因表达蛋白诊断抗原的研制奠定了基础。     

西门塔尔牛肌肉生成抑制素基因编码序列的克隆与序列分析

本研究根据Genbank中牛肌肉生成抑制素基因序列设计引物，在设计的引物两端分别加上限制性内切酶BarnHI和EcoRI的识别位点序列。利用RT—PCR技术从西门塔尔牛肌肉组织的总RNA中扩增出MSTN基因的CDNA序列，扩增出1125bp片段，该片段与pMD18-T载体连接，转化JM109感受态细胞，所得阳性克隆进行酶切和PCR鉴定，并进行了测序分析，得到的克隆序列与设计的序列基本一致，表明成功地克隆了西门塔尔牛的肌肉生成抑制素基因的蛋白编码序列。     

快速诊断鸽瘟方法的研究

从疑似鸽瘟的6例临床病例中分离到5株鸽Ⅰ型副黏病毒（SCP1-SCP5），经本实验室建立的检测中、强毒力新城疫（NDV）病毒的SYBR GREENⅠRT—PCR（RRT—PCR）方法诊断，确诊为中、强毒力新城疫毒感染，用常规RT—PCR扩增SCP1包括F蛋白裂解位点的基因片段，并进行克隆、序列测定。分析表明，SCP1编码F蛋白的基因片段裂解位点处的序列为^112K-R-^114Q—K—R-^117F，与新城疫强毒在这一区域的序列相符；与21株已报道的NDV进行核苷酸同源性比较，并建立进化树，聚类为基因Ⅵ型。     

伪狂犬病病毒Ea株UL31基因克隆、序列分析及其在大肠杆菌中的表达

以伪狂犬病病毒Ea株基因组DNA为模板,通过PCR扩增含UL31基因的1 000bp片段,扩增产物克隆于pMD18-T中,双脱氧末端终止法序列测定.通过OM1GA2.0软件包分析发现,Ea株UL31基因编码271个氨基酸,蛋白质分子量为30.38 kD,与Ka株UL31基因核苷酸与氨基酸序列同源性均在98%以上.将α-疱疹病毒亚科9个不同成员UL31同源基因编码的氨基酸序列进行多重比对分析,发现4个保守的功能性结构域.将该片段插入原核表达载体pGEX-KG中GST下游,构建的原核表达质粒pGEX-UL31在大肠杆菌BL32(DE3)中获得了高效表达,SDS-PAGE结果显示,表达的融合蛋白质分子量为56 kD.     

猪胸膜肺炎放线杆菌Apx Ⅳ A2．5kb基因片段的分子克隆及其表达

以猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清1型国内分离株72—1株基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出ApxⅣA基因2．5kb特异片段，将其克隆于pMD 18-T中，经酶切鉴定筛选重组质粒后进行核苷酸序列测定，并与GenBank中登录的血清1型ApxⅣA(AⅪ302405)基因进行比较，结果显示核苷酸同源性为99．5％。将该片段亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1的EfoRⅠ／SalⅠ位点，成功地构建了重组表达载体pGEX—apxⅣA，并转化大肠埃希氏菌BL2l，获得了表达。SDS-PAGE检测结果显示，表达的融合蛋白分子质量约为117ku，与预期片段大小相符；Western-blotting分析证实，该融合蛋白具有免疫学活性。     

新兴猪IFN-α成熟蛋白基因的克隆与序列分析

根据NCBI GenBank上登录的猪IFN—α基因序列设计了1对引物，应用PCR技术直接从3周龄新兴猪肝细胞中扩增出了约500bp的基因片段；将该片段克隆到pMD 18-T载体，经PCR、酶切及序列测定，该克隆片段由501个核苷酸组成，共编码166个氨基酸，与NCBI GenBank上登录的2个猪IFN—α基因序列(登录号为M28623和X57191)比较，核苷酸的同源性分别为99．4％和99．2％。     

柔嫩艾美耳球虫ZJ株5401基因的克隆和序列分析

利用RT—PCR方法扩增出了柔嫩艾美耳球虫(E．tenella)ZJ(浙江)株的子孢子表面抗原5401基因。把这一基因片段克隆到PGEM—T克隆载体上，得到的阳性克隆经PCR鉴定及酶切分析，结果表明重组子(pGEM—T—5401)中含有5401基因，该序列全长为864bp，序列本身是一个开放阅读框，将克隆得到的基因与国外报道的5401基因比较，有两个碱基发生有义突变，引起两个氨基酸发生突变，核苷酸同源性为99．8％，氨基酸同源性为99．3％。克隆出的5401基因可以用于将来重组疫苗的研究。     

胸膜肺炎放线杆菌APXⅡA基因的克隆及序列测定

用PCR法从胸膜肺炎放线杆菌(APP)7型的DNA提取物中扩增出大小为2873bp的APXⅡA基因片段；将PCR产物重组到质粒载体pMD18-T中，并对重组质粒进行酶切分析及序列测定。结果表明，克隆片段为完整的目的基因，该片段的核苷酸序列与国外分离株M30602的同源性达99．7％。     

猪大肠杆菌水肿毒素SLT-IIeA基因的克隆和序列分析

研究以本地猪水肿病大肠杆分离物ED1株为材料 ,利用 PCR克隆了含猪水肿病大肠杆菌 (VTEC) slt-IIe A基因 987bp的片段 ,并测定了含该克隆片段的 Bam HI、Hind 酶切片段的核苷酸序列。结果表明 ,slt-IIe A基因的编码区全长 960 bp,编码 3 1 9个氨基酸的蛋白质 ,序列与国外报导的 S1 1 79株进行比较发现其核苷酸同源性为 98.9%。经推导的氨基酸序列的同源性为 99.7%。这为进一步研究 slt-IIe A的生物学特性、水肿病的分子诊断及其防制打下基础     

猪伪狂病病毒粤A株gE基因的克隆与序列分析

参考GenBank中伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列设计了1对引物,对PRV粤A株gE基因进行了PCR扩增,PCR产物克隆到PMD18-T载体.对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性,并与2株不同来源的毒株进行了同源性分析和比较.     

伪狂犬病病毒上海株EP0基因的序列分析及其表达载体的构建

以伪狂犬病病毒上海株 (PRV SH)细胞感染物为模板 ,PCR扩增出 1 2 3kb的EP0基因完整编码区片段 ,将该基因片段克隆到pGEM T easy中 ,经过双脱氧末端终止法序列测定 ,并同国内的PRV Ea株进行同源比较 ,发现PRV SH株EP0基因存在多处突变和一处插入。进一步将该片段插入到原核表达载体 pET32a (+)的His Tag下游 ,构建了的原核表达质粒 pETEP0 ,为今后深入研究该基因的表达及其功能奠定了基础。     

鸡传染性贫血病毒VP1基因的克隆表达及抗原性分析

参考已发表的鸡传染性贫血病毒（CIAV）VP1基因序列，设计并合成了2对引物，经PCR扩增获得了2个基因片段。将PCR产物克隆至pGEM—T Easy载体中，成功构建了克隆载体pGEM—CIAVVP1A和pGEM—CIAVVP1B。将上述重组质粒和原核表达载体pMXB10分别用NdPⅠ＋EcoRⅠ、NdeⅠ十X^0I双酶切，并将纯化的2个基因亚克隆至pMXB10中，构建出原核表达载体pMXB10-VP1A和pMXB10-VPIB。在0．3mmol／L IPTG诱导下，目的基因在大肠杆菌ER2566中以分泌型得到了大量表达。Western—blot分析发现，表达蛋白具有CIAV抗原性。表达蛋白经纯化后作为包被抗原，用间接ELISA鉴定，与CIAV阳性血清均能发生特异性反应。2组蛋白免疫SPF鸡后，用全病毒ELISA试剂盒检测血清呈阳性，表明2组蛋白均可诱发机体产生抗CIAV的抗体。