茶树八氢番茄红素脱氢酶cDNA全长克隆与表达分析

八氢番茄红素脱氢酶是类胡萝卜素生物合成途径的关键酶之一。本实验采用3’/5’RACE和RTPCR技术成功扩增出茶树八氢番茄红素脱氢酶基因（PDS）的3’端和5’端序列,序列拼接获得全长cDNA序列,命名为CsPDS,并将其登录至GenBank,登录号KF646537。经生物信息学分析,所得基因cDNA序列全长为2295 bp,开放阅读框（ORF）1749 bp,编码582个氨基酸,预测分子量约为64.86 kDa,理论等电点（PI）为6.77,属于亲水性蛋白。该基因编码的氨基酸序列与柿树PDS序列的同源性达到87%,多序列比对表明茶树PDS具有高度保守区域,基于邻接法的进化树显示与柿树、葡萄的亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析结果显示,CsPDS在‘黄金芽’体内表达没有受抑制,表明‘黄金芽’黄色白化可能不是在CsPDS基因转录水平异常而引起。     

巴西橡胶树CBF1基因的克隆和序列分析

通过RT-PCR技术从橡胶树中克隆了CBF基因家族的保守区,并通过5＇端RACE和3＇端RACE技术克隆了全长为1121 bp的cDNA序列,通过BLAST工具搜索Genbank数据库.结果表明,该cDNA序列同其他植物中的CBF家族基因高度同源,认为该cDNA序列就是橡胶树中的CBF基因.利用genescan和ClastalX工具对该序列进行分析,推测其编码区为693bp,编码231 Aa,并包含一个AP2 DNA结合域.氨基酸同源性分析结果表明,来自橡胶树的CBF基因氨基酸序列与热带起源的作物同源性较高,而与北方种植作物相似性较低.     

花生△12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

根据已报道的△12-脂肪酸脱氢酶基因(FAD)的氨基酸保守序列设计引物进行RT-PCR扩增,得到花生△12-脂肪酸脱氢酶基因881bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术(RACE),向两端延伸得到1410bp的花生△12-脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个长1140bp、编码379个氨基酸残基的开放阅读框,所编码蛋白质的大小约为43kDa。推测的氨基酸序列具有膜整合蛋白酶特异性的3个组氨酸保守区;氨基酸疏水性分析结果表明,所编码的氨基酸序列存在2个具有膜固定蛋白(membrance-anchored protein)重要特征的疏水结构,2个疏水区共跨膜4次,这些特性表明所获得的序列为△12-脂肪酸脱氢酶基因。     

茶树S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的克隆和序列分析

从茶树叶片中提取总RNA ,经反转录合成cDNA第一链。以cDNA第一链为模板 ,分别用三对PCR引物扩增SAM合成酶基因的中间主片段、 3 端和 5 端片段 ,最后经BLAST比较及重叠区域拼接得到完整的SAM基因序列。所得序列长 130 3bp ,编码 394个氨基酸。与中华猕猴桃、番茄、长春花SAM合成酶基因的核苷酸序列的同源性分别为 87% ,83 %和 83%。氨基酸序列与三角杨、猕猴桃、番茄、长春花等的SAM氨基酸序列的同源性为 92 %～ 90 %。证实所获得的基因序列为茶树SAM合成酶基因     

橡胶树AtCAB1同源基因的克隆及其在稳定与衰老期叶片中的差异分析

以一编码蛋白与拟南芥的CAB1高度相似的EST序列作为探针,通过同源搜索从橡胶树的转录组数据中电子克隆到一条长1 415 bp的cDNA,该序列包含一798 bp的ORF及47 bp的5′UTR和570 bp的3′UTR,命名为HbCAB1;在此基础上,采用PCR技术成功扩增了包括该ORF在内的915 bp的cDNA序列。序列分析表明,该基因预测编码265个氨基酸,理论分子量为28.15 ku,等电点为5.25;蛋白含有1个保守的捕光叶绿素a/b结合蛋白结构域,3个跨膜螺旋和1个C端螺旋,1个三聚化基序,     

辣椒MADS-box基因CaMADS的及表达分析

根据植物MADS-box基因的保守区设计简并引物,进行PCR扩增获得一个辣椒MADS-box基因片段,在此基础上通过RACE方法获得了辣椒编码MADS-box基因的cDNA序列(命名为CaMADS).序列分析结果表明,CaMA DS基因全长943 bp,含有744 bp的阅读框,25bp的5'-UTR和174 bp的3...     

茶树MADS-box转录因子基因的克隆与非生物胁迫响应分析

本研究基于茶树转录组数据库,以茶树龙井43为试验材料,通过RT-PCR方法从该茶树的cDNA中克隆得到1个CsMADS1基因。序列分析表明:茶树CsMADS1基因开放阅读框长度为657 bp,编码218个氨基酸,是典型的植物MADS-box家族转录因子。序列多重比对显示,该序列与多个相关物种的MADS-box序列一致性为65.65%,含有高度保守的MADS结构域和半保守的K结构域。氨基酸理化性质、亲疏水性、亚细胞定位预测、无序化分析,以及二级和三级结构分析显示,CsMADS1转录因子是亲水性蛋白,可能定位于细胞核中,无序化程度明显,以α-螺旋结构为主,并与人MEF2蛋白具有相似的三级结构。利用实时荧光定量PCR方法分析了茶树龙井43中CsMADS1基因在非生物胁迫下的表达。结果表明,茶树中CsMADS1基因对高温、低温、干旱和高盐等不同非生物胁迫有响应,且表达存在差异。     

巴西橡胶树HbMYC1基因的克隆及序列分析

从GenBank中搜索到1条来自橡胶树的MYC(Myelocytomatosis)家族基因EST序列,以该序列为保守区,通过RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,共1817bp。通过BLAST工具搜索GenBank数据库,结果表明,该cDNA序列同其他植物的MYC家族基因高度同源,认为该cDNA序列为橡胶树MYC家族成员。利用GenScan和Clastal X对该序列进行分析,推测其编码区长度为1428bp,编码476个氨基酸。生物信息学分析结果表明,巴西橡胶树的MYC基因编码的氨基酸序列与其他物种的相似性很高,同时推导的蛋白质序列中还存在着1个螺旋-环-螺旋的DNA结合区域和1个核定位信号,表明克隆到的基因是1个MYC家族成员的转录因子。     

甘蔗铁氧还蛋白基因cDNA的克隆及序列分析

以甘蔗叶片总RNA为模板,通过RT-PCR扩增铁氧还蛋白(ferredoxin,Fd)基因的cDNA,构建到pMD18-T载体后进行序列测定和序列分析.结果表明:①克隆得到的cDNA片段长度为688 bp,包含甘蔗Fd基因完整的开放读码框,编码151个氨基酸,其中酸性氨基酸残基较多,76～101的氨基酸序列高度保守;②...     

茶树亲环素基因cDNA全长的分析鉴定与原核表达

通过对茶树新梢cDNA文库大量随机测序,获得了一个编码亲环素的全长基因,在GenBank登录,登录号为DQ904327。茶树亲环素基因cDNA全长949 bp,其中开放阅读框全长495 bp,编码蛋白质含有164个氨基酸,分子量约为17.47 kD,等电点约为8.54,它具备5’端非编码区的“CAAT”标志及3’端非编码区的”AATAAA”poly-A加尾信号。其推测的氨基酸序列经与26条其他生物亲环素蛋白氨基酸序列进行CLUSTAL W多序列联配并以Neighbor-Joining法进行进化树构建后,发现与水稻和小麦的相似性较高,达到85%以上。根据亲环素基因开放阅读框序列设计引物,构建了原核表达载体pET/Csin-Cyp,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导出了一个分子量为23 kD的亲环素融合蛋白。     

橡胶树cystatin基因HbCYS1的克隆及割胶应答

在植物中,半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Cystatin)广泛参与逆境胁迫应答和发育调控。在已建立的胶乳EST序列数据库中,鉴定了一个注释为cystatin的序列重叠群(Contig)。利用RACE和RT-PCR进一步获得1个长度为947 bp、包含完整读码框(741 bp)的cDNA,命名为HbCYS1;去除N端27个aa的信号肽后,HbCYS1蛋白生成1个包含219个aa的成熟蛋白(24.2 ku),具有cystatin反应位点的保守序列基序GG、QXVXG和A/PW,同时具有植物cystatin所特有的LARFAV基序;推测HbCYS1是一种分泌性蛋白,与同样来自大戟科的1个蓖麻cystatin蛋白(CAA89697)的亲缘关系最近,氨基酸序列的一致性达79%;在胶乳中,割胶明显促进HbCYS1基因的上调表达。割胶是一种典型的非生物胁迫,橡胶树对割胶胁迫的适应能力是决定其持续生产力的一个重要因素,推测HbCYS1基因可能参与橡胶树的胁迫应答与胶乳再生。     

茶树甜菜碱醛脱氢酶基因(CsBADH1)的全长cDNA克隆与表达分析

甜菜碱是一种能在逆境下大量积累的无毒性渗透相溶物质,而甜菜碱醛脱氢酶(BADH)是甜菜碱合成途径中的关键酶之一。本实验采用SMART-RACE技术获得了茶树甜菜碱醛脱氢酶基因的全长cDNA序列,命名为CsBADH1(GenBank登陆号:JX050145),并对其进行相关的生物信息学分析。结果表明:CsBADH1的cDNA序列全长1 972 bp,其开放阅读框(ORF)为1 518 bp,编码505个氨基酸,预测分子量为54.8 kD,理论等电点(PI)为5.652,是疏水性很强的蛋白,且具有BADH基因典型的高度保守十肽基序(VTLELGGKSP)和与醛脱氢酶(ALDHs)功能有关的半胱氨酸残基(C)。系统进化树分析表明,茶树BADH氨基酸序列与人参(Panax ginseng)的亲缘关系最近,相似度达87%,其余相似性也大部分在80%以上。实时荧光定量PCR分析结果显示:该基因在经历一定时间的冷驯化后表达量升高,说明CsBADH1基因可能参与茶树的冷驯化作用。     

香蕉ACC合成酶cDNA5‘末端的快速扩增

采用cDNA末端快速扩增（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）的方法对香蕉ACC合成酶的cDNA5'末端进行了扩增，获得677bp的产物，序列测定的结果表明，其中一个连续编码149个氨基酸，其序列含有ACC合成酶的第一和第二保守区和一段长230bp的非翻译区。     

无核荔枝凝集素基因的克隆与表达分析

应用PCR技术克隆了无核荔枝凝集素(LcLec)基因的部分cDNA(JF920723)和gDNA(JF920724)序列,序列分析表明,获得的cDNA序列含有一个468 bp的完整开放读码框结构,编码含155个氨基酸残基的多肽序列,该氨基酸残基序列与木菠萝家族的甘露糖结合凝集素同源。获得的gDNA序列含有3个内含子,长度分别为124、108和119 bp。荧光定量PCR结果表明,LcLec基因的表达量在无核荔枝果皮发育前期上升,之后下降至稳定水平;在采后果皮衰老阶段,随果皮褐变指数上升LcLec基因表达量上升。     

红海榄脱水素基因(RsDHN1)的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术对已获得的红海榄根部其中一个差异表达基因进行克隆,通过Blast分析和序列比对可知,该基因全长cDNA序列包括146bp的5'端非编码区,43bp的3'端非编码区和一个编码241个氨基酸的开放阅读框,命名为RsDHN1基因。该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SKn类脱水素蛋白,与其它植物的SKn类脱水素蛋白具有43%～55%的氨基酸序列同源性。半定量RT-PCR分析表明,盐胁迫对RsDHN1基因的表达有明显上调作用。     

花生查尔酮异构酶基因的克隆及其序列分析

利用RT-PCR及RACE技术从花生种子中克隆得到查尔酮异构酶基因(chi)的cDNA全长序列,命名为Ahchi,NCBI登录号:JN412735,该序列全长共1 061 bp,编码209个氨基酸,其氨基酸组成与其它已知的高等植物具有很高的同源性,与大豆、倒捻子、蓖麻、毛果杨的同源性分别为81%、71%、70%和69%,且含有高度保守的活性位点。     

大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的电子克隆及进化分析

利用生物信息学和实验验证的技术路线,以拟南芥脱氢抗坏血酸还原酶基因cDNA序列为信息探针,对大豆EST数据库进行同源搜索,经同源性比对和序列组装,获得全长为955bp的大豆脱氢抗坏血酸还原酶基因的cDNA序列(GenBank登录号为DQ006810),经RT-PCR扩增,分子克隆和序列分析验证,结果表明与电子克隆完全一致.该cDNA序列具有完整的开放阅读框架(ORF,36bp-815bp),推测编码蛋白为259个氨基酸.通过与几种植物脱氢抗坏血酸还原酶蛋白序列的比较,发现该基因具有较高的保守性.结果表明根据物种问同源基因序列,对跨物种问EST数据库进行同源检索筛选,拼接,是新基因克隆的一条有效途径.