玳玳花瓣脂氢过氧化物裂解酶基因cDNA的克隆及原核表达

以玳玳花瓣为材料,采用RT-PCR和RACE技术,克隆了玳玳HPL基因cDNA全长,全长为1 776 bp,其中包含52 bp的5′非编码区,224 bp的3′非编码区,1 500 bp的编码区(编码499个氨基酸,分子量为55.7 ku)。将该HPL基因cDNA编码区的核苷酸序列及所推导的氨基酸序列与其他植物的HPL基因cDNA序列进行比较,推断玳玳花瓣HPL属于13-HPL类。通过PCR扩增得到了玳玳HPL基因组全长。测序结果显示玳玳HPL基因中包含1个长2 374 bp的内含子。将分离出来的玳玳HPL基因cDNA的编码区序列插入pET-15b载体上构建原核表达载体,在细菌BL21细胞中进行原核表达。结果表明:该编码区片段可在原核细胞中大量表达,其表达产物分子量大小约为55 ku,与13-HPL蛋白的分子量55.7 ku相符。本研究为下一步利用HPL基因cDNA进行遗传转化研究奠定基础,将为花卉香味的遗传改良提供一条新途径。     

麝香百合液泡膜水孔蛋白基因LlTIP2的克隆及生物信息学分析

水孔蛋白是位于质膜和液泡膜等生物膜上主要负责水分跨膜运输的通道蛋白,属于膜主要内在蛋白(major intrinsic proteins,MIP)超家族.采用RT-PCR和RACE法从麝香百合(Lilium longiflorum)叶片克隆得到1个液泡膜内在蛋白(tonoplast intrinsic proteins,TIPs)基因的全长cDNA序列,命名为LTIP2(GenBank登录号:JN085950).该基因cDNA全长986 bp,包括208bp的3’-非翻译区,744 bp开放阅读框以及34 bp的5’-非翻译区,共编码247个氨基酸.由L1TI P2推导的氨基酸序列具有2个高度保守的水孔蛋白NPA (Asn-Pro-Ala)基序以及MIP的特征序列SGGHVNPAVTFG.同源性分析表明,LITIP2氨基酸序列与陆地棉(Gossypium hirsutum)、大麦(Hordeum vulgare)、黑麦草(Lolium perenne)和小麦(Triticum aestivum)等植物TIP2的同源性分别达77％、74％、73％和72％.系统进化树分析表明LlTIP2属于液泡膜水孔蛋白TIP2亚类新成员.     

花生(Arachis hypogaea L.)CaM cDNA基因的克隆

提取花生幼嫩叶片总RNA,以逆转录cDNA第一链为模板,合成5'端和3'端引物,PCR扩增并克隆得到花生钙调蛋白基因的2个异型基因.序列分析表明,PCaM-1和PCaM-2均由447个核苷酸组成,共编码148个氨基酸.2个cDNA的核苷酸序列同源性为84%,编码区的氨基酸序列同源性为96%,仅有5处替换:F-L、T-A、M-T、M-T和L-F.     

花生白藜芦醇合成酶基因家族序列克隆及分析

本研究以花生H2007为材料,从花生基因组中扩增出约500bp的白藜芦醇合成酶基因（Resveratrol synthase,RS）的保守序列,该序列与已发表的来源于花生的RS推导的蛋白序列相似性为91%。根据获得序列设计巢式基因特异性引物,以紫外辐射后花生叶片总RNA反转录成的cDNA作为模板,通过3’-RACE （Rapid Amplification of cDNA Ends）,获得15个不同RS基因的片段,序列分析结果表明, 扩增得到的15个白藜芦醇合成酶基因片段与已报道的基因的序列相似性为86%-98%。RS的部分编码区聚类分析的结果表明这15个序列遗传距离在0.05之内(图5)。15个RS基因的3’-UTR碱基长度不等,最短的有69bp,最长的有244bp,两两比较相似性为23%～100%。四组RS基因的部分编码区聚类分析结果与3’-UTR 区相同。     

巴西橡胶树β-木糖苷酶基因的克隆与生物信息学分析

以巴西橡胶树根为材料，利用RT-PCR技术从总RNA中捕获到一个β-木糖苷酶家族基因(β-xylosidase 或β-D-xyloside xylohydrolase，EC 3.2.1.37)，cDNA长度2 880 bp，开放阅读框2 319 bp，编码773个氨基酸，命名为HbEC32。在HbEC32氨基酸序列中具有一个较强的跨膜区，二级结构分析表明其属于混合型蛋白。HbEC32在N端前8～20氨基酸区域内为较强的疏水区，但整条多肽链表现为亲水性。对15个β-木糖苷酶蛋白进行系统进化分析发现，巴西橡胶树的HbEC32基因与蓖麻亲缘关系最近。     

△^6-脂肪酸脱氢酶基因克隆及其共转化表达载体的构建

采用RT—PCR的方法从海南玻璃苣中克隆了△^6-脂肪酸脱氢酶基因(△^6-dsa)。DNA序列测定结果表明，△^6-dsa全长1347bp编码448个氨基酸。△^6-dsa序列在genbank中采用BLAST程序进行同源序列分析，结果表明，△^6-dsa核苷酸序列与克隆自美国德克萨斯州的玻璃苣△^6-脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列完全相同。△^6-dsa克隆进T—easy Vector后形成质粒pG△^6-DSA。把质粒pG△^6-DSA上的△^6-脂肪酸脱氢酶基因片段克隆进含有T—DNA和35S启动子的质粒pGIN22中，形成含有目的基因的表达载体pGIN23。把表达载体pGIN23与另一个含有T—DNA、启动子、筛选标记基因的表达载体pLPN28进行亚克隆，使得筛选标记基因和△^6-dsa分别插入到同一质粒的2个相互独立的T—DNA内，构建成共转化表达载体pLIN61。     

2个番木瓜多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因的克隆与分析

采用RT-PCR扩增获得了2个番木瓜果实多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白(PGIP)基因cDNA和DNA全长序列,将其命名为CpPGIP1和CpPGIP2.CpPGIP1基因全长为984 bp,编码325个氨基酸；CpPGIP2基因全长为1 025 bp,编码326个氨基酸.2基因均没有内含子序列,核苷酸序列有66.54％的相...     

木豆贮藏蛋白基因的克隆及其序列分析

根据几种豆科植物贮藏蛋白基因序列同源性设计简并引物,通过反转录扩增,经琼脂糖凝胶电泳检测和测序,并利用NCBI数据库及Blast工具进行分析,从木豆中克隆得到1个贮藏蛋白基因的cDNA片断,长度为833 bp.采用RACE、RT-PCR技术扩增得到该基因的全长cDNA,含1 595 bp,推测编码区为1551 bp(16-1566bp),编码516个氨基酸,分子量为57.718 ku,等电点为4.68.该基因推导的氨基酸与大豆(1303273A)、野生大豆(CAA55977.1)、羽扇豆(AEB33710.1)、花生(AAU21493.1)、菜豆(ADR30064.1)、野豌豆(CAA83674.1)为、截形苜蓿(XP_003590690.1)的贮藏蛋白同源性分别达到83％、79％、77％、73％、67％、65％、65％.     

花生FAD2-RNAi载体基因AFLP标记的克隆及序列分析

以花生高油酸品种Sunolic95R和低油酸品种汕油162杂交组合的F1为试验材料,采用AFLP分子标记,用 100 对AFLP引物筛选出20个与△12-脂肪酸脱氢酶-RNAi载体基因遗传连锁距离为3. 87～8.91cm的差异片段,并回收纯化、克隆测序及NCBI上进行序列比对,最终获得了5个FAD2-RNAi载体基因的全序列(长度为589～763bp),通过分析得出:所获得的5个FAD2-RNAi载体基因的遗传连锁距离为3.87～6.59cm,序列间同源性达到88%～97%,与GenBank中已知的FAD2-RNAi载体基因序列相似性均达到85%以上,分别包含一个起始密码子与一个终止密码子,结果表明本试验采用AFLP技术获得的5个序列均为△12-脂肪酸脱氢酶-RNAi载体基因.     

花生肌动蛋白基因的克隆及序列分析

以花生(Arachis hypogaeaL.)为材料,研究肌动蛋白(actin)基因序列。分离了高纯度RNA。以RNA为模板,以RT-PCR方法,克隆了花生actin基因cDNA序列,长度为384 bp,编码128个氨基酸残基。此cDNA序列(命名为Ahactin)与几种高等植物actin氨基酸序列相似性大于80%。     

青稞新光合作用相关基因的克隆和序列分析

根据鉴定得到的青稞4个光合作用相关基因的序列设计引物,从青稞叶片的c DNA中扩增得到目的片段,并对目的基因序列进行测序鉴定和序列分析。结果成功扩增出4个基因的序列,大小分别为513、822、1023和579 bp。生物信息学分析表明,02833基因可能编码一个核糖-5-磷酸异构酶3;03360基因可能编码一个273个氨基酸的核酮糖-磷酸-3-异构酶,该蛋白属于ICL_KPHMT superfamily之一,推测其CDS全长为822 bp;45441基因可能编码一个340个氨基酸的苹果酸脱氢酶,该蛋白属于Ldh_1_C superfamily之一,推测其CDS全长为1 023 bp;45453基因可能编码一个果糖-1,6-二磷酸激酶。这些基因的克隆为研究青稞的光合机制奠定了基础。     

ω-3脂肪酸脱氢酶在高、低油大豆品种中的克隆与序列分析

α-亚麻酸（ALA）被称为必需脂肪酸,对人体有一系列的保健作用。ω-3脂肪酸脱氢酶（FAD）催化亚油酸（LA）生成ALA。大豆种子中ALA含量较高,为了比较高、低油大豆ω-3FAD的序列差异,用RT—PCR方法从大豆品种鲁豆11和郑9525的未成熟种子中扩增GmFAD3C的cDNA,获得的cDNA长度为1174bp,编码380个氨基酸。在推测的氨基酸序列中发现19处差异,为研究GmFAD3C基因在高、低油大豆种质中的差异表达奠定了基础。     

巴西橡胶树HbMYC1基因的克隆及序列分析

从GenBank中搜索到1条来自橡胶树的MYC(Myelocytomatosis)家族基因EST序列,以该序列为保守区,通过RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,共1817bp。通过BLAST工具搜索GenBank数据库,结果表明,该cDNA序列同其他植物的MYC家族基因高度同源,认为该cDNA序列为橡胶树MYC家族成员。利用GenScan和Clastal X对该序列进行分析,推测其编码区长度为1428bp,编码476个氨基酸。生物信息学分析结果表明,巴西橡胶树的MYC基因编码的氨基酸序列与其他物种的相似性很高,同时推导的蛋白质序列中还存在着1个螺旋-环-螺旋的DNA结合区域和1个核定位信号,表明克隆到的基因是1个MYC家族成员的转录因子。     

甘蔗铁氧还蛋白基因cDNA的克隆及序列分析

以甘蔗叶片总RNA为模板,通过RT-PCR扩增铁氧还蛋白(ferredoxin,Fd)基因的cDNA,构建到pMD18-T载体后进行序列测定和序列分析.结果表明:①克隆得到的cDNA片段长度为688 bp,包含甘蔗Fd基因完整的开放读码框,编码151个氨基酸,其中酸性氨基酸残基较多,76～101的氨基酸序列高度保守;②...     

巴西橡胶树HbRPS6-2基因的克隆与生物信息学分析

从巴西橡胶树甲基化过滤文库中筛选到一个与RPS6同源性较高的基因片段,根据该基因片段序列信息,设计特异引物,利用RACE进行特异片段的5’和3’扩增,获得长度为1 327 bp的HbRPS6-2基因克隆。生物信息学分析表明,该基因包含483 bp的开放阅读框,5’非翻译区为357 bp,3’非翻译区为475 bp,编码161个氨基酸。在HbRPS6-2氨基酸序列中没有预测到信号肽和跨膜区,二级结构分析表明其属于混合型蛋白。HbRPS6-2在N端前18个氨基酸区域内有一个较强的疏水区,但整条多肽链表现为亲水性。对15个RPS6系统进化分析发现,巴西橡胶树的RPS6-2基因与多杀性巴氏杆菌的RPS6基因亲缘关系最近,而与拟南芥和玉米等亲缘关系相对较远。     

木榄质膜型Na+/H+逆向转运蛋白的基因克隆与序列分析

根据已发表的胡杨、毛白杨、蓖麻、番杏、番茄、盐角草等逆向转运蛋白基因的保守区设计兼并引物,通过RT-PCR和RACE技术,从木榄(Bruguiera gymnorrhiza)中克隆出Na+/H+逆转运蛋白的cDNA全长序列,长度为3 703 bp,其中,开放阅读框3 462 bp,编码1 154个氨基酸,含12个跨膜区。序列同源性分析表明,该氨基酸序列与毛果杨、蓖麻、胡杨、葡萄等Na+/H+逆向转运蛋白氨基酸序列具有很高的同源性(70%以上),表明该序列确属Na+/H+质膜型逆向转运蛋白的家族基因。     

甘蔗△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因（P5CS）的克隆及其表达分析

△~1-吡咯琳-5-羧酸合成酶是植物脯氨酸合成过程的关键酶.应用同源性克隆结合RACE技术获得甘蔗PSCS基因cDNA全长序列2714bp,其中5'端非编码区为226bp,3'端非编码区340bp,poly(A)上游有1个聚腺苷酸五碱基AATAAA;开放读码框为2 148 bp编码715个氨基酸,含双功能域;其编码的蛋白分子量为77.7 ku,等电点为6.47.序列比对分析结果表明,P5CS基因的4个主要功能区(domain)中亮氨酸功能区(Leucine domain)相对不保守,其它功能区均较为保守.对17个物种的P5CS基因进行聚类分析,结果与公认的生物学分类及进化关系吻合.对甘蔗P5CS在根、茎、叶的表达进行实时PCR分析,结果表明,该基因在茎、叶表达量相近,但在根的表达量极低.     

龙眼胚性愈伤组织fw2.2家族2个基因的克隆与分析

fruit weight 2.2(fw2.2)是植物中控制果实重量的重要数量性状的主效基因。以龙眼转录组数据库为基础,采用同源克隆法及RACE技术,从龙眼的胚性愈伤组织中获得fw2.2家族的2个cDNA全长序列,命名为Dlfw2.2-1与Dlfw2.2-1,并对其核甘酸序列及推导的氨基酸序列进行生物信息学分析。结果表明:Dlfw2.2-1基因的cDNA全长为970 bp,编码184个氨基酸;Dlfw2.2-2基因的cDNA全长为941 bp,编码175个氨基酸。Dlfw2.2-1与Dlfw2.2-2的核甘酸序列及其推导的氨基酸序列与其它植物的fw2.2具有较高的同源性,亚细胞定位于细胞质膜,不含信号肽,具有跨膜结构与典型的与PLAC8同源的富半胱氨酸蛋白(Cysteine-rich Protein)的保守结构域。植物中fw2.2系统进化树分析结果表明,Dlfw2.2-1和Dlfw2.2-2为同一分枝,与番茄和油梨的fw2.2的距离最近。因此,推测Dlfw2.2-1与Dlfw2.2-2属于fw2.2基因家族的2个成员。     

橡胶树HbDHN1基因克隆及表达分析

采用Macroarray印迹杂交技术从本实验室构建的橡胶树机械伤害诱导的树皮抑制性差减杂交(SSH)cDNA文库中检测到1个差异表达EST.采用RT-PCR和RACE技术获得了该基因全长cDNA序列,包括124 bp的5'端非编码区,337 bp的3'端非编码区和1个编码224个氨基酸的开放阅读框.该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SK2类脱水素蛋白.命名为H6DDHN1,与其它植物的SK2类脱水素蛋白具有49.0%～68.2%的氨基酸序列同源性.RT-PCR分析表明,机械伤害对HbDHN1基因的表达没有明显影响,受伤组织的脱水显著上调该基因的表达.     

胶孢炭疽病菌环境pH应答转录调控因子基因的克隆与分析

参照油梨炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)的环境pH应答转录因子基因Pacl设计l对特异性引物,以芒果炭疽病菌(C.gloeosporioides)基因组DNA为模板,扩增获得大小为2 625 bp的目的基因片段.序列分析结果表明,目的片断包含完整的阅读框,与油梨炭疽病菌C.gloeosporioides pac1基因相应片段长度相同,二者碱基序列同源性达97%.用RT-PCR技术获得pacl基因cDNA片段,证实目的基因片段中存在3个大小分别为59,50,71 bp的内含子.拼接的全长cDNA长1 755 bp,推测编码的氨基酸序列长584个氨基酸残基,与推测的油梨炭疽病菌pacl基因所编码的蛋白质同样大小,二者氨基酸序列相似性达99%,只有1个氨基酸的差异,可以肯定克隆的目的片段为C.gloeosporioides pac1基因,为进一步研究C.gloeosporioides侵染芒果时的pH调控奠定了基础.