花生△12-脂肪酸脱氢酶基因的克隆及序列分析

根据已报道的△12-脂肪酸脱氢酶基因(FAD)的氨基酸保守序列设计引物进行RT-PCR扩增,得到花生△12-脂肪酸脱氢酶基因881bp部分cDNA序列,然后通过快速扩增cDNA末端技术(RACE),向两端延伸得到1410bp的花生△12-脂肪酸脱氢酶基因全长cDNA序列。序列分析表明有一个长1140bp、编码379个氨基酸残基的开放阅读框,所编码蛋白质的大小约为43kDa。推测的氨基酸序列具有膜整合蛋白酶特异性的3个组氨酸保守区;氨基酸疏水性分析结果表明,所编码的氨基酸序列存在2个具有膜固定蛋白(membrance-anchored protein)重要特征的疏水结构,2个疏水区共跨膜4次,这些特性表明所获得的序列为△12-脂肪酸脱氢酶基因。     

根结线虫16D10基因与花生FAD2基因RNAi载体构建

针对根结线虫16D10基因和花生△12脂肪酸脱氢酶(FAD2)基因的核酸序列设计了两条含有GUS内含子的RNA干扰结构序列.以pBS-T质粒为中间载体,将这段序列连接进植物转化载体pRI 101-AN中,获得针对两个基因的RNAi载体.经SalI和KpnI双酶切验证,目的序列已准确插入目标载体.此载体可用以培育抗根结线...     

花生FAD2基因RNAi载体转化及转基因籽粒脂肪酸分析

在构建了以花生△12脂肪酸去饱和酶（FAD2）基因自身启动子驱动、有内含子间隔的该基因编码序列反向重复片段的RNA干扰载体的基础上,对上述干扰载体进行了农杆菌介导的花生胚小叶的遗传转化,以期特异调控花生籽粒中油酸、亚油酸含量。 在2个受体品种中获得105株抗性再生植株,用两对引物对其进行了PCR扩增,其中32株初步证实为转基因植株。采用近红外分析仪对转基因T1籽粒油酸和亚油酸含量的检测表明,转基因株系内油酸/亚油酸比值的变异高于对照,多数转基因株系油酸亚油酸比值平均数也显著高于对照。     

花生Δ12脂肪酸脱氢酶基因FAD2的克隆及反义表达载体的构建

从花生的幼嫩叶片中提取总DNA,应用PCR方法分离到了两个FAD2基因片段,分别命名为FAD2-1和FAD2-2,将反向的FAD2-1和FAD2-2片段分别与所克隆的大豆油体蛋白基因启动子片段oleosin-a与oleosin-b相连,在中间表达载体pSPROK中构建了三个带T-nos的融合基因,进而把融合基因构建到植物表达载体pCAMBIA1300中,酶切鉴定后进行测序,结果表明,所构建的三个植物表达载体均分别带有Oleosin启动子和反义FAD2基因序列,FAD2-2的长度为593bps,与引用序列的同源性达到97%,包含一个起始密码子;FAD2-1的长度为1175bp,与引用序列的同源性达到99%,包含一个起始密码子与一个终止密码子。将构建好的植物表达载体已经转化农杆菌LBA4404并用于侵染花生外植体。     

A Preliminary Study on Transferring △6-Fatty Acid Desaturase Gene from Borago Officinalis into Soybean

采用RT-PCR法扩增出中国境内生长的琉璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因,序列分析表明,该基因全长为1359个核苷酸,与美国德克萨斯州的琉璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因同源性可达到99％.将克隆到的基因连接pRTL2质粒的35S启动子,构建重组载体pPTN-D6D,并通过农杆菌介导的子叶节转化系统,将该基因导人到垦农18和小粒豆2个大豆品种中.经PCR检测分析,初步证明琉璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因已导入并整合到大豆基因组中.     

花生△12脂肪酸脱氢酶基因FAD2的克隆及反义表达载体的构建

从花生的幼嫩叶片中提取总DNA，应用PCR方法分离到了两个FAD2基因片段，分另4命名为FAD2-1和FA192-2，将反向的FAD2-1和FAD2-2片段分别与所克隆的大豆油体蛋白基因启动子片段oleosin-a与oleosin-b相连，在中间表达载体pSPROK中构建了三个带T-nos的融合基因，进而把融合基因构建到植物表达载体pCAMBIA1300中，酶切鉴定后进行测序，结果表明，所构建的三个植物表达载体均分别带有Oleosin启动子和反义FAD2基因序列，FAD2-2的长度为593bps，与引用序列的同源性达到97％，包含一个起始密码子；FAD2—1的长度为1175bp，与引用序列的同源性达到99％，包含一个起始密码子与一个终止密码子。将构建好的植物表达载体已经转化农杆菌LBA4404并用于侵染花生外植体。     

《花生学报》2008年总目录

花生网斑病菌和黄曲霉菌对花生几丁质酶诱导的研究曲明静,黄忠林,鞠倩,等(1)1……………花生FAD2-RNAi载体基因AFLP标记的克隆及序列分析张宁洁,高国庆,熊发前(1)7…………Microsatellite Diversity in Peanut Botanical Variety'Hirsuta'TANG Rong-hua,ZHUANG Wei-jian,HAN Zh     

△^6-脂肪酸脱氢酶基因克隆及其共转化表达载体的构建

采用RT—PCR的方法从海南玻璃苣中克隆了△^6-脂肪酸脱氢酶基因(△^6-dsa)。DNA序列测定结果表明，△^6-dsa全长1347bp编码448个氨基酸。△^6-dsa序列在genbank中采用BLAST程序进行同源序列分析，结果表明，△^6-dsa核苷酸序列与克隆自美国德克萨斯州的玻璃苣△^6-脂肪酸脱氢酶基因的核苷酸序列完全相同。△^6-dsa克隆进T—easy Vector后形成质粒pG△^6-DSA。把质粒pG△^6-DSA上的△^6-脂肪酸脱氢酶基因片段克隆进含有T—DNA和35S启动子的质粒pGIN22中，形成含有目的基因的表达载体pGIN23。把表达载体pGIN23与另一个含有T—DNA、启动子、筛选标记基因的表达载体pLPN28进行亚克隆，使得筛选标记基因和△^6-dsa分别插入到同一质粒的2个相互独立的T—DNA内，构建成共转化表达载体pLIN61。     

RNAi干扰油菜Δ12-脂肪酸脱饱和酶基因的表达效果

为进一步研究RNAi介导的Δ12-脂肪酸脱饱和酶（FAD2）干扰基因对油菜内源FAD2基因表达的影响,以油菜肌动蛋白(β-Actin)基因为内参照基因,提取转基因油菜幼嫩种子总RNA,通过半定量RT-PCR检测内源FAD2基因的相对表达量。结果表明,T1,T3代转基因种子中FAD2基因的相对表达量与对照相比明显降低。对T3代种子的油酸含量的分析表明：转基因油菜种子中油酸的含量比野生型增加了13.90到32.20个百分点,直接说明RNAi干扰体下调了FAD2基因的表达。因此,种子内源表达的FAD2基因被RNAi干扰体有效沉默,并且产生了能够稳定遗传两代的表型变化。     

花生△12脂肪酸脱氢酶基因AhFAD2B在酿酒酵母中的表达及功能分析

花生油中亚油酸(LA,C18:2Δ9,12)含量很高,为了研究花生Δ12脂肪酸脱氢酶(Δ12 FAD)的功能,用RT-PCR方法从花生未成熟种子中扩增出AhFAD2B的cDNA,连接到酵母表达载体p416中,并转化酿酒酵母K601,得到工程菌Kp4AFAD2B。气相色谱分析脂肪酸成分,结果表明该基因能在酵母K601中表达,并使菌株产生了两种新的脂肪酸即棕榈二烯酸(C16∶2Δ9,12)和亚油酸(C18∶2Δ9,12),含量分别占总脂肪酸的2.1%和9.2%,棕榈油酸(C16∶1Δ9)和油酸(C18∶1Δ9)含量与对照相比相应地下降,证明该基因编码的Δ12脂肪酸脱氢酶除能作用于C18∶1Δ9,还具有催化16碳的C16∶1Δ9底物在Δ12位脱氢生成C16∶2Δ9,12的功能,但在两种底物之间可能更偏爱C18∶1Δ9。     

向大豆导入琉璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因的初步研究

采用RT-PCR法扩增出中国境内生长的琉璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因,序列分析表明,该基因全长为1 359个核苷酸,与美国德克萨斯州的琉璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因同源性可达到99%。将克隆到的基因连接pRTL2质粒的35S启动子,构建重组载体pPTN-D6D,并通过农杆菌介导的子叶节转化系统,将该基因导入到垦农18和小粒豆2个大豆品种中。经PCR检测分析,初步证明琉璃苣Δ6-脂肪酸脱氢酶基因已导入并整合到大豆基因组中。     

双T-DNA表达载体转化大豆的研究

利用含有筛选标记基因和目的基因△6-脂肪酸脱氢酶基因的双T-DNA共转化表达载体pLIN61,经农杆菌EHA101介导,采用子叶节转化法转化大豆,使用除草剂Glufosinate作为筛选剂,获得了一批携带有玻璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因的转基因大豆,转化效率为2.0%,共转化频率及实际转化率分别为56.25%、1.12%.PCR检测和Southern杂交结果证明,玻璃苣D6D已经整合到大豆的基因组上.RT-PCR检测结果显示,玻璃苣△6-脂肪酸脱氢酶基因在转基因大豆的转录水平上得到了表达.     

大豆种子脂肪酸含量的遗传分析

利用气相色谱脂肪酸甲酯化法测定了大豆品种绥农10与L-9及其杂交衍生的197个重组自交系种子的棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸的含量,运用主基因+多基因混合遗传模型,对大豆种子的5种脂肪酸进行了遗传分析.结果表明:硬脂酸、油酸和亚油酸均为2对主基因+多基因遗传模型;棕榈酸与亚麻酸均为3对主基因+多基因遗传模型,且五种脂肪酸含量的主基因遗传率大于多基因遗传率,即五种脂肪酸的遗传主要受主基因控制.     

分子标记辅助回交选育高油酸花生新种质

为培育适应山东省以及黄淮海区域生产的高产、高油酸花生新品种,以山东优异花生品种花育23号(HY23)和花育31号(HY31)为母本,以高油酸花生品种Sunoleic95R、DF12和开农176(KN176)为父本,配制了3个杂交组合HY23×DF12(SAAS-01)、HY31×KN176(SAAS-02)以及HY31×Sunoleic95R(SAAS-03),在3年时间内,进行了一次杂交、4次回交和1次自交,利用优化的CAPS和PCR产物测序法,以及新开发的花生FAD2基因KASP检测方法,对自交和回交后代进行检测。SAAS-01、SAAS-02和SAAS-03三个组合分别获得了FAD2A和FAD2B隐性纯合的高油酸基因型BC4F2种子1,18和26粒;另外还获得了一批基因型为Aabb、aa Bb、Aa Bb的BC_4F_2种子,这三种基因型的杂交后代可通过进一步自交获得纯合的高油酸材料。本研究获得了遗传背景为花育23号和花育31号的高油酸花生材料,为培育适合山东省种植的高产、高油酸花生新品种奠定了基础。     

高油酸含量花生品种的多样性分析

以5个高油酸含量花生品种和1个普通油酸含量花生品种为试材,在调查测定农艺性状、种子脂肪酸含量和SSR引物扩增带型的基础上,分析高油酸含量花生品种的多样性.结果表明,5个高油酸含量的花生品种在主茎高、侧枝长、分枝数、饱果数、百果重和百仁重6个性状方面的差异明显;其油酸含量均在80％以上,而其他七种脂肪酸的含量各有差异;利用12对SSR引物进行PCR扩增分析,共扩增出50条带,其中40条呈现多态,供试品种间的遗传相似系数介于0.325～0.750之间,平均为0.655.聚类分析结果表明,同一育种单位品种间的遗传相似系数较高,首先聚类在一起;国内高油酸含量品种间的遗传基础相近,优先聚为一类;高油酸含量品种与普通油酸含量品种间的遗传相似系数低,最后聚在一起.     

芝麻含油量及脂肪酸含量QTL分析

本研究以较高含油量芝麻品种“中芝13”（56.31%）和低含油量芝麻材料ZZM2748（48.75%）为亲本构建包含548个株系的RIL群体,采用近红外法对群体在2个不同环境下的含油量、油酸、亚油酸、棕榈酸和硬脂酸含量进行分析,发现群体含油量及脂肪酸含量存在较大变异,其中含油量变化在42.43%~58.38%,其与油酸和亚油酸含量无显著相关关系,但与棕榈酸显著负相关;应用软件WinQTLCart2.5和ICIMapping3.0基于构建的遗传连锁图共定位到50个相关QTL,分布在芝麻11个连锁群上,贡献率变化在1.59%~40.62%。其中,有21个QTL被两个软件同时检测到,有7个QTL在2个环境下被重复检测到。位于连锁群LG10上的qSOC_10.3和位于连锁群LG11上的qSOC_11.1遗传贡献率较大,分别为34.38%和40.62%,为控制芝麻含油量的主效QTL,其中qSOC_11.1与定位到的油酸、亚油酸、棕榈酸和硬脂酸位点重合,表现一因多效特征。通过基因组注释和差异表达分析,在两个主效位点发掘出24个候选基因。研究发现的芝麻含油量及不同脂肪酸含量遗传变异特征和获得的QTL及候选基因对相关性状的遗传改良具有指导意义和应用价值。     

大豆脂肪酸脱氢酶GmFAD3C-1基因的克隆及功能分析

研究通过对大豆脂肪酸脱氢酶GmFAD3家族中4个关键酶基因序列进行比对,与对照JN18相比,大豆低亚麻酸突变体MT72中GmFAD3C-1基因在起始密码子后+966bp处存在一个碱基位点的缺失（G→?）,产生移码突变,导致氨基酸序列上产生较大变化（该突变基因命名为gmfad3c-1）。构建GmFAD3C-1基因超表达及CRISPR/Cas9编辑载体,利用花粉管通道法获得T₂转化植株。脂肪酸脱氢酶酶活测定结果显示,超表达植株T₂籽粒中,酶活与对照相比上升47.62%~78.85%,编辑载体T₂籽粒中,酶活与对照相比下降25.67%~47.11%。脂肪酸相对含量测定的结果进一步表明,GmFAD3C-1基因的表达与植株亚麻酸含量密切相关。     

花生锈病抗性的AFLP标记

利用抗、感锈病的花生品种为亲本配制杂交组合远杂9102 ×ICGV86699,以其F2分离群体为研究材料, 利用BSA 法和AFLP技术,获得了与锈病抗性连锁的2个分子标记,与抗性基因间的遗传距离分别为10.90cM和7.86cM。利用获得的分子标记对其F3进行了验证，分子标记与抗性鉴定结果具有较高的一致性。     

南美油藤PvFAD7基因的克隆及其表达模式和功能分析

3 FAD基因是α-亚麻酸合成途径中的一个关键限速酶基因，通过调节该基因的过量表达，可提高植物中α-亚麻酸含量。对南美油藤ω-3脂肪酸脱氢酶基因PvFAD7的克隆及其表达模式和功能分析，有利于探明南美油藤种子高含量α-亚麻酸的合成机制，为下一步利用遗传改良生产植物α-亚麻酸奠定理论基础。基于前期南美油藤种子转录组数据，从南美油藤新鲜叶片同源克隆获得南美油藤脂肪酸脱氢酶基因PvFAD7的DNA全长序列，并对其进行生物信息学分析。通过实时荧光定量PCR分析该基因在南美油藤不同器官（成熟叶、新叶、茎、根、果皮、幼嫩种子和成熟种子）中的表达模式，并利用亚细胞定位技术观察该基因的编码蛋白在烟草叶表皮细胞中的定位情况。通过构建过表达载体，介导农杆菌遗传转化获得过表达PvFAD7基因的转基因阳性烟草植株，并对收获的种子利用气相色谱法进行脂肪酸组分的测定。南美油藤PvFAD7基因DNA全长序列为2 222 bp，编码461个氨基酸，包括8个外显子和7个内含子。蛋白多序列比对结果显示南美油藤PvFAD7编码蛋白与同科植物蓖麻和橡胶树同源性最高。生物信息学分析结果表明，PvFAD7蛋白有4个组氨酸保守区，...     

不同O/L值花生品种油酸脱氢酶基因的时空表达特征

本研究以不同油酸/亚油酸比值（O/L比）花生品种为材料,利用实时荧光定量PCR技术,对四个不同O/L花生品种不同组织中油酸脱氢酶基因（FAD2）的表达进行相对定量分析。结果表明：FAD2基因在不同O/L基因型中组成型表达,其在根、茎、叶中表达量低,在花中表达量最高,显著高于荚果等其它组织中的表达量,且品种间差异达显著水平;花U606和花U12在花、幼荚、成熟荚果中的表达量呈依次下降趋势;花育17和狮油红4号在花、幼荚、成熟荚果中的表达量则呈现高-低-次高的表达趋势,差异达显著水平。