NaCl培养液对植物根尖有丝分裂的影响

以洋葱根尖、大蒜根尖、蚕豆根尖为材料,分别用50、150、250mmol/L的NaCl培养液对分生区细胞进行72h培养,分析NaCl培养液对植物根尖细胞有丝分裂指数及微核的影响。结果表明,不同浓度的NaCl培养液对植物根尖作用72h后,植物根尖细胞中期分裂指数和中期染染色体形态均有不同程度的影响,有丝分裂指数随着NaCl处理剂量的增加而下降,微核率随着NaCl处理剂量的增加而升高,且一定浓度的NaCl影响植物细胞有丝分裂的速度,当浓度较低时促进分裂,浓度较高时则抑制分裂。     

胡杨NAC转录因子PeNAC045基因的克隆及功能分析

NAC(NAM、ATAF1/2和CUC2)域蛋白是植物特有的最大的转录因子家族之一,在调节衰老,细胞分裂,木质形成,生物和非生物胁迫等方面发挥重要作用。本研究从胡杨中成功克隆出与胁迫相关的基因,并命名为PeNAC045。测序结果表明,PeNAC045基因编码区长度为915 bp,编码304个氨基酸,与毛果杨PtrNAC045的氨基酸一致性为96.05%。对PeNAC045基因在NaCl和干旱胁迫下的表达情况进行了分析,PeNAC045基因的表达受高盐和干旱的强烈诱导。利用PeNAC045的cDNA全长构建表达载体pBI121-PeNAC045-GFP,测序确认后,将重组结构和阳性对照(空载体)分别转化野生型拟南芥(Col-0),进行亚细胞定位观察,结果显示PeNAC045-GFP融合蛋白定位于细胞核上,并由DAPI进行核染色标定。利用农杆菌花序侵染法将构建的表达载体pCAMBIA1301-PeNAC045转化野生型拟南芥和突变体(ataf2),通过PCR鉴定,获得过表达植株及ataf2/PeNAC045回补株系。对各株系进行NaCl胁迫处理,分析PeNAC045基因的生物学功能。在150 mmol/L NaCl胁迫下,相比于拟南芥突变体和野生型植株,拟南芥PeNAC045过表达株系的萌发率降低,根长变短。此外,拟南芥PeNAC045过表达株系的株高明显低于其他株系,其在苗期对盐胁迫的敏感性增加。研究结果表明,在盐胁迫下,PeNAC045作为转录调节因子,负调控胁迫相关基因的表达。      

玉米转录因子ZmEREB93负调控籽粒发育

【目的】玉米作为重要的粮、经、饲多用作物,其产量的稳定对经济发展和粮食安全意义重大。AP2/EREBP（APETALA2/ ethylene response element binding protein,AP2/EREBP）转录因子在植物生长发育及逆境应答中发挥重要作用。前期研究发现,玉米ZmBES1/BZR1-5转录因子靶基因ZmEREB93可能参与调控种子大小。克隆ZmEREB93,并对其表达特性及功能进行分析,为深入解析其调控玉米籽粒发育的功能与机制奠定基础。【方法】从玉米自交系B73中克隆ZmEREB93的全长序列,对其基因序列和编码氨基酸序列特征进行生物信息学分析。随后,通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）分析其组织表达模式,分别构建植物和酵母表达载体,进行亚细胞定位和转录激活活性分析。经农杆菌介导法将ZmEREB93转入拟南芥,对转基因株系的种子表型进行分析。最后,通过体外染色质免疫共沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing,Chip-seq）和共表达分析筛选ZmEREB93可能调控的候选靶基因,并通过酵母单杂交（yeast one hybrid,Y1H）验证。【结果】成功克隆获得ZmEREB93,序列分析结果表明,ZmEREB93无内含子,开放阅读框长618 bp,编码205个氨基酸,有一个高度保守的AP2结构域,属于AP2家族的ERF亚类。qRT-PCR结果表明,ZmEREB93在授粉后15和25 d的种子中表达量较高,其中,在25 d种子中表达量最高,约为15 d种子中表达量的11倍,在茎和根中有微量表达,在雄穗、花丝及苞叶中无表达。转录激活试验结果表明,ZmEREB93蛋白在酵母细胞中不具有转录激活活性。亚细胞定位结果显示,ZmEREB93蛋白定位于细胞核。与野生型株系相比,转基因拟南芥株系种子的长和宽显著变小且千粒重显著降低。体外Chip-seq与共表达分析结果表明,Zm00001d013611、Zm00001d006016、Zm00001d027448及Zm00001d039991为ZmEREB93转录因子的候选靶基因。Y1H试验表明,ZmEREB93蛋白可直接结合Zm00001d013611启动子。【结论】玉米ZmEREB93作为转录因子在种子中特异性表达,负调控种子大小。     

过表达ZmIBH1-1提高玉米苗期抗旱性

【目的】干旱是严重影响玉米生长发育进程的一个重要因素。挖掘玉米抗旱相关基因,通过转基因功能验证和转录组分析,解析关键基因在响应干旱胁迫过程中的分子调控机制,为抗旱分子育种和遗传改良提供理论依据。【方法】以玉米自交系B104（WT）为背景材料,利用农杆菌介导方法构建过表达ZmIBH1-1转基因株系（ZmIBH1-1-OE）;通过对转基因植株进行草铵膦抗性筛选、标记基因和目的基因PCR检测,以及运用实时荧光定量PCR检测目的基因的表达情况,鉴定阳性植株和株系;以WT和ZmIBH1-1-OE转基因株系为材料,通过干旱处理（20% PEG6000）,进行表型鉴定和耐旱生理生化指标测定,验证ZmIBH1-1的抗旱功能;通过对干旱胁迫下玉米4叶期转录组的比较分析,鉴定出差异表达的基因（differentially expressed genes,DEGs）;结合DAP-seq（DNA affinity purification sequencing）分析,初步确定ZmIBH1-1蛋白直接调控与抗旱相关的下游靶基因,利用基因组可视化软件IGV（integrative genomics viewer）分析ZmIBH1-1蛋白结合候选靶基因的位置,然后通过Dual-Luciferase试验验证ZmIBH1-1蛋白与靶基因的调控关系。【结果】通过玉米遗传转化获得12个转化事件;T₃代中,能同时检测到标记基因Bar和目的基因ZmIBH1-1的植株有458个,实时荧光定量PCR检测结果表明,ZmIBH1-1-OE中ZmIBH1-1的表达量显著高于WT,株系3和株系8表达量最高,将其自交获得T₄代转基因株系用于后续试验。在干旱胁迫条件下,ZmIBH1-1-OE株系存活率、叶片相对含水量、叶绿素含量、可溶性蛋白含量及其生理生化指标（超氧化物歧化酶、过氧化物酶、过氧化氢酶活性）均显著高于WT,说明玉米中过量表达ZmIBH1-1赋予玉米更高的耐旱性。转录组分析结果表明,WT与ZmIBH1-1-OE株系在干旱胁迫下有1 214个差异表达基因;Gene Ontology（GO）功能富集分析结果表明,差异表达基因主要涉及生物过程、细胞组分和分子功能,如在生物过程中主要涉及到光合作用、应激响应、脱水响应等;KEGG富集分析表明,差异表达基因主要参与植物激素信号传导、新陈代谢等过程。结合转录组显著差异表达基因和DAP-Seq分析所得到ZmIBH1-1蛋白的靶基因,初步确定ZmIBH1-1蛋白直接调控与抗旱相关的11个候选靶基因,包括2个钙信号相关基因、3个半胱氨酸代谢相关基因、1个bHLH转录因子、1个应激响应蛋白、1个谷胱甘肽转移酶、1个氧化还原过程蛋白和2个乙烯响应因子;基因组可视化结果显示ZmIBH1-1蛋白可以结合靶基因启动子区;随后通过Dual-Luciferase试验进一步表明,ZmIBH1-1蛋白可以直接作用于11个候选靶基因,其中,ZmIBH1-1蛋白可以促进ZmCa-M、ZmSYCO、ZmbHLH54、ZmGlu-r1、ZmCLPB3和ZmP450-99A2的表达,抑制ZmAGD12、ZmCYS、ZmCYSB、ZmERF-107和ZmEIN3的表达。此外,在干旱胁迫下NAC、WRKY、MYB等转录因子在ZmIBH1-1-OE和WT株系中也存在差异表达。【结论】ZmIBH1-1的过表达可以增强玉米苗期的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白通过直接调控乙烯信号通路中的ZmERF-107和ZmEIN3的表达提高玉米的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白通过直接调控钙信号相关基因ZmCa-M和ZmAGD12增强玉米的耐旱性;ZmIBH1-1蛋白可能通过间接调控NAC、WRKY、MYB等转录因子响应干旱胁迫。     

蔗糖转运蛋白OsSUT5在水稻花粉发育及结实中的作用

【目的】蔗糖是植物体内光合产物运输的主要形式。蔗糖-质子同向运输蛋白（sucrose transporter/sucrose carrier,SUT/SUC）在植物细胞之间的蔗糖跨膜运输以及植物组织和器官之间的蔗糖分配中具有重要作用。水稻SUT家族共有5个成员。已有研究表明,敲除OsSUT1、OsSUT2、OsSUT3、OsSUT4对水稻的生长发育产生显著影响,说明这些基因不可替代。然而,OsSUT5的功能还未见报道。阐明OsSUT5在水稻生长发育中的作用,将为全面了解SUT蛋白在模式植物水稻中的生理功能提供新的依据。【方法】通过对水稻OsSUT5的时空表达特性进行实时荧光定量PCR分析,同时利用OsSUT5的推测启动子驱动GUS在水稻体内表达,获得其基因编码蛋白的组织定位信息,以及在烟草叶片表皮细胞内进行OsSUT5-GFP融合蛋白瞬时表达,对蛋白进行亚细胞定位,比较基因编辑技术（CRISPR-Cas9）创制的OsSUT5不同纯合突变株系与野生型对照水稻的形态和生理特征,获得OsSUT5的功能信息。【结果】转录水平上,OsSUT5在水稻茎、叶、花序和颖果中均有表达,并且该基因编码蛋白在营养器官中的表达集中于维管组织。在生殖器官中,OsSUT5的表达主要位于花药及发育的颖果内。该基因编码蛋白在水稻发育的颖果特别是盾片和胚根鞘中高表达。烟草叶片表皮细胞内的瞬时表达显示OsSUT5-GFP融合蛋白定位于细胞质膜。与野生型水稻相比,3个OsSUT5纯合突变株系均表现为花粉活性以及离体萌发率明显降低。与此相吻合的是,OsSUT5突变株系未授粉的小穗比例相对于野生型显著增加,同时突变株系结实率显著下降。通过对OsSUT5突变株系颖果的观察和比较显示,OsSUT5突变体水稻颖果的垩白相对于野生型明显增多,其颖果长度相对于野生型对照也有一定程度的增加,但统计结果表明OsSUT5突变体水稻的千粒重与野生型无显著区别。【结论】OsSUT5在水稻花粉发育甚至受精过程中可能发挥重要作用;敲除OsSUT5对水稻的结实率、籽粒的形态和品质有明显影响。推断OsSUT5在水稻开花结实中的作用（包括对花粉活性和颖果内胚乳发育的影响）与其蔗糖运输功能密切相关。     

GTPase RABE1b参与拟南芥胚胎发育的研究

[目的]研究影响拟南芥早期胚胎发育分裂模式的基因。[方法]从拟南芥T-DNA插入的突变体库中分离到2个T-DNA插入突变体,通过表型观察胚胎发育情况。[结果]PCR-WALKING表明T-DNA插入位点分别位于基因At4g20360的5＇非编码区和启动子区,基因编码的GTPase RABE1b蛋白为Rab蛋白家族的成员,将这2个突变体分别命名为Atrabe1 b-1和Atrabe1b-2。透明分析发现此突变体在胚胎发育早期球形胚时期分裂模式出现异常,RT-PCR分析发现此基因在拟南芥中以组成型表达。[结论]基因At4g20360影响拟南芥早期胚胎发育的分裂模式,推测其编码的蛋白GTPaseRABE1b可能对控制拟南芥胚胎发育过程中的细胞分裂起重要作用。     

GTPase RABE1b参与拟南芥胚胎发育的研究

[目的]研究影响拟南芥早期胚胎发育分裂模式的基因。[方法]从拟南芥T-DNA插入的突变体库中分离到2个T-DNA插入突变体,通过表型观察胚胎发育情况。[结果]PCR-WALKING表明,T-DNA插入位点分别位于基因At4g20360的5′非编码区和启动子区,基因编码的GTPase RABE1b蛋白为Rab蛋白家族的成员,将这2个突变体分别命名为Atrabe1b-1和Atrabe1b-2。透明分析发现此突变体在胚胎发育早期球形胚时期分裂模式出现异常,RT-PCR分析发现此基因在拟南芥中以组成型表达。[结论]基因At4g20360影响拟南芥早期胚胎发育的分裂模式,推测其编码的蛋白GTPase RABE1b可能对控制拟南芥胚胎发育过程中的细胞分裂起重要作用。     

拟南芥AKIN11基因的过表达及其功能分析

将蔗糖非发酵基因相关蛋白激酶AKIN11克隆到植物表达载体pEGAD的35S启动子下游与GFP融合,基因枪法导入洋葱表皮细胞进行瞬时表达,发现集中在细胞核内表达.农杆菌介导花序浸泡法转化拟南芥,Basta筛选和RT-PCR鉴定得到两个遗传稳定的T3代转基因株系.突变体和野生型的表型没有明显差异,但突变体叶片中淀粉含量较野生型增加.RT-PCR分析淀粉合成途径关键酶的mRNA水平,发现突变体中腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶表达量增加,而α-淀粉酶却没有变化.表明AKIN11基因可能在拟南芥淀粉积累途径中起着重要的调节作用.     

细胞分裂素与细胞的分裂增殖

细胞分裂素对细胞的分裂增殖起着重要的调节作用,在细胞周期中的G1/S期,细胞分裂素促进D型细胞周期蛋白CycD的表达;在G2/M期,其作用与CDK的磷酸化有关。植物通过体内细胞分裂素的代谢影响细胞分裂素水平,调节植物生长发育调控基因,影响植物的根尖、茎尖等器官的生长发育。     

番茄SlNAM1参与调节植物花青素累积

[目的]探究番茄SlNAM1参与调节花青素累积的分子机理,深入理解植物花青素积累的调控机制。[方法]通过酵母双杂交实验,检测番茄SlNAM1和SlMYB75、拟南芥NAC32与MYB75/PAP1蛋白相互作用;构建系统发育树,进行SlNAM1序列分析;通过烟草叶片瞬时表达分析,初步探明SlNAM1在调节植物花青素积累中的作用;在拟南芥pap1-D突变体中过表达SlNAM1,研究SlNAM1在调节植物花青素积累中的作用;通过对拟南芥pap1-D NAC32OX(OX32)双突变体表型分析,进一步证明SlNAM1的拟南芥同源基因NAC32参与调控花青素积累。[结果]酵母双杂交结果显示,SlNAM1与SlMYB75蛋白存在相互作用,其在拟南芥中的同源基因NAC32与MYB75/PAP1也存在相互作用;瞬时表达分析表明,SlNAM1通过与SlMYB75的相互作用,抑制了花青素积累;在拟南芥pap1-D突变体中过表达SlNAM1可抑制花青素累积;拟南芥pap1-D OX32双突变体表型分析结果表明,NAC32过表达抑制了花青素积累。[结论]综上所述,SlNAM1是花青素合成的负调节因子。     

简易压片法观察水稻有丝分裂和减数分裂行为

[目的]建立一套简单易行的染色体压片技术,获得水稻染色体资料。[方法]以水稻根尖和花药为材料,采用改进后的压片法进行制片,对水稻有丝分裂和减数分裂过程进行显微观察取像。[结果]水稻有丝分裂包括间期、前期、中期、后期、末期5个时期,中期的染色体缩至最短,是观察与研究染色体的好时期。水稻减数分裂包括减数分裂Ⅰ、减数分裂Ⅱ 2个过程,其中在减数分裂I 过程中发生了染色体复制,减数分裂Ⅱ过程中仅发生了细胞分裂。[结论]改进后的水稻染色体压片技术能够获得准确的染色体资料,可为育种和遗传操作提供依据。     

新型除草剂丙酯草醚对油菜幼苗生长与根尖细胞活性的影响

 【目的】研究新型油菜田除草剂丙酯草醚（ZJ0273）对甘蓝型油菜发芽期幼苗在生长发育及根尖细胞活性等方面的安全性影响,为进一步明确其作用机理奠定理论基础。【方法】利用生理生化方法探讨了ZJ0273处理对发芽期油菜茎根长、干物质积累、根系活力和根细胞膜透性等的影响,并运用FDA-PI荧光对染法及根尖压片法研究了该除草剂对油菜根尖细胞活性及有丝分裂的影响。【结果】ZJ0273处理对油菜幼苗干物质和苗高等性状的抑制作用随着处理浓度的升高和处理时间的延长而显著增强;10与100 mg?L-1处理显著抑制了油菜幼苗根的生长且两处理间抑制效果无明显差异;1 mg?L-1以下浓度的ZJ0273对油菜幼苗根系活力、细胞膜完整性几乎无显著影响,而10 mg?L-1以上浓度处理则明显抑制根系活力且破坏细胞膜完整性;100 mg?L-1ZJ0273处理抑制油菜根尖分生区细胞有丝分裂并使多数细胞停滞于分裂中期。【结论】发芽期是油菜对ZJ0273处理的敏感时期;10 mg?L-1 ZJ0273处理即抑制油菜幼苗的生长发育及影响根尖细胞活性,且抑制效果随处理浓度的升高和处理时间的延长而增大;对油菜幼苗较为安全的ZJ0273临界浓度为1 mg?L-1。     

丙酯草醚对植物细胞有丝分裂的影响

[目的]探讨丙酯草醚的除草机理。[方法]以洋葱根尖为试材,探讨不同时间和不同浓度丙酯草醚对根尖分生细胞有丝分裂的影响。[结果]随着丙酯草醚处理浓度的增加,洋葱根尖有丝分裂指数逐渐下降;在同一浓度下,随着处理时间的延长,有丝分裂指数也呈下降趋势。对不同处理下的洋葱根尖细胞形态观察发现,在低浓度(0.012 5%)丙酯草醚短时间(2 h)处理下,洋葱根尖分生区中仍可见中、后、末期3种分裂状态的细胞。但在超过8 h的高浓度(0.100 0%)丙酯草醚处理下,分裂态细胞明显减少,分生区有明显较多分裂中期的细胞。[结论]丙酯草醚对根尖细胞的分裂有明显抑制作用,并使根尖细胞停滞于有丝分裂中期。     

简易压片法观察水稻有丝分裂和减数分裂行为

[目的]建立一套简单易行的染色体压片技术,获得水稻染色体资料。[方法]采用朱微的植物染色体及染色体技术中的压片法,并在此基础上作了进一步改进。细胞有丝分裂观察：①材料准备。种子浸泡24h后。置于培养皿中,于25℃暗培养箱中生根培养。②固定。当嫩根长至1～2cm时,于9：00～11：00用卡诺固定液（酒精：醋酸=3：1）固定2～24h。再用70％酒精清洗后置于70％酒精中保存备用。③解离。将固定好的材料取出放人解离液（无水乙醇：37％的浓盐酸=1：1）中室温下解离5～10min。解离时间根据温度的不同而不同,在试验中做好调整。④染色。彻底洗去解离液的根尖置于解剖镜下,找出分生区（一个解离良好的材料分生区在解剖镜下是不透明的,而成熟区和根冠部分则是透明的）,用刀片将分生区切为2～3部分,使其细胞更易着色。然后在载玻片上滴卡宝品红染色液染色10rain。⑤压片。⑥镜检取像。细胞减数分裂观察：①取材。幼穗当剑叶的叶枕距为0左右时,处于减数分裂期。于8：00～11：00采集水稻幼穗,用卡诺氏固定液固定24h（置于4℃冰箱内）,再用70％酒精清洗2—3次后,保存于70％酒精中备用。②制片。取1朵颖花的3～6枚花药置于洁净载玻片上,用刀片或解剖针将花药横向切断,用镊子挤压花药,使花粉母细胞从花药中逸出,再用镊子清除药壁等残渣。滴1滴卡宝品红染液于花药上,染色5min。之后压片。③观察取像。先在低倍镜下寻找具有分裂相的花粉母细胞,然后依次转换到高倍镜观察减数分裂各时期染色体的行为和形态特征。最后用油镜观察染色体分裂行为并取像。[结果]水稻有丝分裂包括间期、前期、中期、后期、末期5个时期,中期的染色体缩至最短,是观察与研究染色体的好时期。水稻减数分裂包括减数分裂Ⅰ、减数分裂Ⅱ2个过程,其中在减数分裂Ⅰ过程中发生了染色体复制,减数分裂Ⅱ过程中仅发生了细胞分裂。[结论]改进后的水稻染色体压片技术能够获得准确的染色体资料,可为育种和遗传操作提供依据。     

汞对蚕豆根尖细胞的诱变效应

利用蚕豆根尖微核及染色体畸变技术研究了汞对植物遗传和变异的影响。试验设计了不同浓度的汞处理蚕豆根尖 ,分别统计其细胞有丝分裂情况及染色体行为。结果表明 :不同浓度汞处理对根尖细胞分裂、微核率及染色体畸变有不同程度的影响 :汞对细胞分裂影响表现为低浓度促进细胞分裂 ,高浓度抑制 ;对植物诱变性能表现为 ,较低浓度时对蚕豆根尖的毒害作用相对较弱 ,但随着浓度的增加诱变效应增强 ,毒性亦增强。     

铬（Cr6+ ）胁迫对蚕豆幼苗根生长和细胞分裂的影响

为了阐明Cr6+胁迫对蚕豆根尖分生组织细胞的遗传毒害效应,研究Cr6+胁迫对蚕豆种子萌发、幼苗根生长、根尖细胞分裂及染色体畸变的影响。结果表明,低质量浓度Cr6+促进蚕豆种子萌发,而高质量浓度Cr6+有抑制作用,并且随着处理时间的延长,其最适质量浓度降低。当Cr6+质量浓度超过10mg/L时,蚕豆幼苗根的生长明显受到抑制,并且呈现时间效应关系。外部形态上,高质量浓度Cr6+导致蚕豆根明显弯曲,根尖呈现褐色、深褐色,甚至黑色,部分开始硬化。当Cr6+质量浓度≥5mg/L时,随着Cr6+质量浓度的增加,处理时间的延长,蚕豆根尖细胞有丝分裂指数下降,且表现明显的剂量效应和时间效应关系,进入细胞分裂前期、后期和末期的细胞明显减少,而中期细胞所占的比例上升。同时染色体产生染色体断片、染色体桥、落后染色体、染色体粘连及多极分裂等各种类型的畸变,但以染色体断片为主,其次是微核。当Cr6+质量浓度≤100mg/L时,随着Cr6+质量浓度的增加和处理时间的延长,蚕豆根尖细胞微核率增加;但当Cr6+质量浓度为200mg/L,处理超过48h后,随着处理时间的延长,其微核率反而下降。     

Nacl 和pH胁迫对大蒜根、芽生长及细胞分裂的影响

以永年大蒜为材料,采用生长量测定和根尖细胞有丝分裂观察等方法,初步研究了pH和NaCl胁迫对大蒜根、芽生长和细胞分裂的影响,旨在为选育耐盐碱的大蒜新品种奠定细胞学基础。结果表明,0.3%NaCl对大蒜根、芽的萌发和生长有一定的促进作用;0.7%和1.0%的NaCl胁迫对大蒜根、芽的生长表现明显的抑制作用,根部伸长区的细胞长度较对照的明显缩短,根尖细胞有丝分裂出现异常行为,如出现染色体桥、三极分裂和染色体解体等,1.5%NaCl完全抑制大蒜根、芽的生长;大蒜根、芽萌发和生长适合在pH6.5～7.5,低于pH6.5或高于pH8.5对大蒜根、芽萌发生长和根尖细胞分裂有一定影响。     

多裂蒲公英(T.dissectu Ledeb)染色体的核型分析

利用根尖压片法对多裂蒲公英进行有丝分裂观察及核型分析,统计观察了50个准确计数染色体的根尖有丝分裂中期细胞。实验结果表明:多裂蒲公英的染色体数为2n=32,其核型公式为2n=32=28m+2sm+2T。利用有丝分裂过程当中的染色体核型,可以明确区分蒲公英属植物在表现型上难以区别的类型,染色体的数目、相对长度、着丝粒位置和随体有无等都可以作为蒲公英属植物的分类指标而被利用。     

禾谷镰孢核孔蛋白基因FgNup42的功能分析

【目的】核孔蛋白Nup42在真核生物基因表达调控以及mRNA加工运输等生物学过程中发挥着重要作用,本研究旨在分析禾谷镰孢（Fusarium graminearum）中核孔蛋白基因FgNup42在病原菌生长发育、逆境胁迫、致病和产毒等生物学过程中的功能。【方法】通过融合PCR（double-joint PCR）和酵母空隙修复（gap repair）技术分别构建FgNup42基因敲除和回补载体,再利用PEG介导的原生质体转化的方法获得基因敲除突变体ΔFgNup42和回补体ΔFgNup42-C。观察测定基因敲除突变体ΔFgNup42在营养生长、无性繁殖和有性生殖过程中的变化,同时测定突变体ΔFgNup42对渗透、杀菌剂以及细胞壁胁迫因子的敏感性。将突变体ΔFgNup42进行田间麦穗和室内玉米花丝接种试验明确其致病力情况。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）检测ΔFgNup42的产毒能力,同时利用qRT-PCR比较分析参与单端孢霉烯族毒素生物合成的7个TRI在野生型PH-1和基因敲除突变体ΔFgNup42中的相对表达量。【结果】表型测定发现,基因敲除突变体ΔFgNup42的生长速率只有野生型PH-1的50%,菌落边缘菌丝分枝变多且致密。显微观察分生孢子形成情况,发现敲除突变体ΔFgNup42相较野生型PH-1分生孢子产量降低了85.45%,并且隔膜数在0—2的分生孢子比例明显增多。有性生殖诱导结果显示ΔFgNup42的有性生殖能力增强,较野生型产生了更多的子囊壳。突变体ΔFgNup42对渗透胁迫因子NaCl和KCl,细胞壁胁迫因子刚果红,以及杀菌剂戊唑醇和氰烯菌酯的敏感性减弱。致病力分析发现敲除基因FgNup42后菌体在麦穗和玉米花丝上的致病力严重降低。此外,与野生型相比,ΔFgNup42中毒素DON、3ADON和15ADON的合成量明显减少。【结论】核孔蛋白基因FgNup42在禾谷镰孢生长发育、抵御逆境以及致病和产毒过程中发挥着重要作用。     

水稻根系发育基因OsKSR7 的克隆与功能分析

【目的】 水稻根系是与地上部性状和产量密切相关的重要农艺性状。通过鉴定新的水稻根系发育相关基因,为深入解析水稻根系发育遗传机理奠定基础。【方法】 从甲基磺酸乙酯（ethyl methane sulfonate,EMS）诱变的水稻Kasalath突变体库中筛选到1个根系发育缺陷的突变体Osksr7 （Oryza sativa kasalath short root 7 ）。通过溶液培养和田间种植,对该突变体进行苗期表型鉴定及成熟期主要农艺性状考察。将Osksr7 分别与野生型籼稻Kasalath和粳稻Nipponbare杂交,F₂群体进行遗传分析和突变基因的图位克隆,对预测的候选基因进行测序验证。构建由35S启动子驱动OsKSR7 的回复载体,通过农杆菌介导转入突变体成熟胚诱导的愈伤组织进行转基因互补验证。【结果】 与野生型相比,Osksr7 幼苗期的主根、不定根、侧根和根毛的伸长都受到抑制,主根、不定根和侧根的长度分别只有野生型的33%、38.9%和35.3%,但不定根数有显著增加。农艺性状调查发现,Osksr7 的株高、穗数、茎秆粗细、结实率、千粒重和剑叶长宽等性状都受到显著影响,其中,穗数和结实率的差异极显著,分别只有野生型的56.3%和37.3%。遗传分析表明,突变体Osksr7 和籼稻Kasalath杂交的F₁表型正常,F₂群体中正常植株与短根突变植株的分离比符合3﹕1,表明突变体Osksr7 的突变性状受1对隐性核基因控制;利用SSR和InDel分子标记将突变基因定位在水稻第11染色体上IND1与IND2之间,物理距离约为143 kb的区间。在该区间有25个预测注释基因,候选基因测序比对发现,突变体Osksr7 中的一个编码转运蛋白的基因LOC_Os11g24560 第一个外显子上ATG后73 bp处的T突变为A,导致编码的第25位氨基酸由色氨酸突变为精氨酸。生物信息学分析表明LOC_Os11g24560 是介导蛋白质从内质网（ER）运向高尔基体（Golgi）的COPII有被小泡的SEC23亚基在水稻中的同源基因。RT-PCR表明LOC_Os11g24560 的表达水平在野生型和Osksr7 突变体中无显著差异,35S启动子驱动的LOC_Os11g24560 的回复载体能够使Osksr7 突变体的表型回复成野生型,证实Osksr7 的表型是由LOC_Os11g24560 突变引起。【结论】 Osksr7 是一个水稻短根突变体,其产量相关的几个重要农艺性状显著受抑制,突变基因为LOC_Os11g24560 ,编码COPII有被小泡的SEC23亚基,与已报道的水稻根系基因都不等位,是一个新的水稻根系发育调控基因。