猪伪狂犬病病毒北京株的分离鉴定

从北京某猪场疑似猪伪狂犬病发病死亡仔猪脑及内脏中分离到1株病毒并进行了鉴定。该分离毒株接种ST细胞24 h后出现圆缩、聚集、脱落等典型的细胞病变(CPE);分离毒株能够被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;分离病毒接种家兔后,引起家兔出现奇痒等典型的伪狂犬病临床症状;同时根据GenBank公布的PRV的gD基因设计引物并扩增出特异性的目的片段,扩增产物经过测序比较,表明扩增产物序列为猪伪狂犬病病毒基因序列。以上结果证实该病毒为猪伪狂犬病病毒,依据分离地点命名为猪伪狂犬病病毒北京株。     

一例猪伪狂犬病野毒感染的实验室诊断

为确诊衡阳市某猪场育肥猪发生的疑似猪伪狂犬病(PR)疫情,采集发病猪脾脏,运用PCR方法进行猪伪狂犬病病毒(PRV)核酸检测,利用非洲绿猴肾细胞(Vero)进行病毒分离培养,采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法(IPMA)进行病毒血清学鉴定;用分离培养物进行家兔感染试验,观察临床症状和病例剖检变化,采用PCR检测各器官中的病毒分布情况。结果显示:病料接种Vero细胞培养3 d后,出现明显的细胞病变效应(CPE);分离培养的病毒与PRV阳性血清呈阳性反应;家兔感染后出现奇痒等神经症状并死亡,其肝、脾组织均为PRV gE核酸检测阳性。试验结果证实,分离到的病毒为PRV野毒,从而确诊了该疑似疫情。     

一株水貂源伪狂犬病毒株的分离鉴定

从辽宁大连疑似水貂伪狂犬病发病死亡水貂脑、内脏中及饲喂的猪肝中分离到1株病毒并进行了鉴定。该分离毒株接种BHK-21细胞24 h后出现圆缩、聚集、脱落等典型的细胞病变(CPE);分离毒株能够被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和;分离病毒接种家兔后,引起家兔出现奇痒等典型的伪狂犬病临床症状;同时根据Gen Bank公布的PRV的Tg ET基因设计引物并扩增出特异性的目的片段,扩增产物经过测序比较,表明扩增产物序列为猪伪狂犬病毒g E基因序列。以上结果表明,该病毒为伪狂犬病毒,依据来源确定为水貂源性伪狂犬病病毒株。     

一株猪伪狂犬病病毒的分离鉴定

为了确诊山东省利津县某猪场发生的疫情是否由猪伪狂犬病病毒(PRV)感染所致,试验利用BHK-21传代细胞对疑似猪伪狂犬病死亡猪进行病毒分离,并通过PCR方法、间接免疫荧光试验及动物试验对分离病毒进行鉴定。结果表明:接种病料后48小时BHK-21细胞出现明显细胞病变,PRV荧光抗体阳性、PCR扩增片段大小为220 bp,测序结果与NCBI中伪狂犬病病毒基因组同源性为96%~98%,接种家兔后表现出明显的伪狂犬病症状,病毒毒价达到1×107.25TCID50/0.1 m L。说明该猪场的疫情由猪伪狂犬病病毒感染所致。     

一例猪伪狂犬病病毒的分离鉴定

从临床疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织等病料中,经PCR扩增出大小为217 bp的伪狂犬病病毒gp50的基因片段,结果证实为猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)感染。随后采用BHK-21细胞进行猪伪狂犬病病毒的分离培养,该分离株经细胞传代培养5代后,能够产生典型的细胞病变,经PCR鉴定为伪狂犬病病毒,其病毒感染力达10^8.68 TCID₅₀/0.1mL。最后用10^7.0 TCID₅₀/mL病毒培养物接种家兔,48 h后注射部位出现典型瘙痒、皮肤破损等症状,于72 h后全部死亡。结果表明,该伪狂犬病病毒分离株对易感动物具有高致病性,为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫及诊断研究奠定了基础。     

一株伪狂犬病病毒的分离及鉴定

为了从北京市周边郊区某猪场发病仔猪的脑组织中分离到伪狂犬病病毒,试验采用细胞培养、空斑纯化、PCR鉴定、动物感染试验、电镜观察的方法进行分离。结果表明:家兔接种病毒后可引起典型的伪狂犬病症状,继而死亡;PK-15细胞接种病毒出现典型细胞病变,毒价为1×108TCID50/m L;电镜观察可见圆形、有囊膜、直径为150~180 nm大小的病毒颗粒;PCR反应可扩增出特异性长为1 783 bp的DNA片段。说明该分离株为猪伪狂犬病病毒野毒株。     

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及其gE基因序列分析

从福建省某猪场疑似伪狂犬病的发病3日龄仔猪的脑、肺脏中分离到1株病毒.该病毒接种家兔出现了典型的伪狂犬病症状,接种PK-15细胞36 h后出现了圆缩、集聚、脱落等典型的细胞病变,猪伪狂犬病病毒阳性血清能特异性中和该分离病毒.根据已发表的伪狂犬病病毒(PRV)gE基因的序列,设计并合成了一对引物,采用PCR方法可扩增特异性298 bp的DNA片段.测序结果与GenBank中有代表性的6株参考毒株相应基因序列比较,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.5%~99%和91.8%~98%.系统进化树结果表明分离株与湖北分离株Ea株亲缘关系最近.     

猪伪狂犬病病毒LA株的分离鉴定

从辽宁省某猪场大批死亡的新生仔猪脑及内脏中分离到多株病毒 ,通过初步验证后选择其中一代表毒株进行了鉴定。该病毒株在PK -1 5细胞上连续传 1 2代均出现典型的细胞病变 ,用适应PK -1 5细胞的病毒接种Vero细胞、猪肾传代细胞IBRS -2及SPF鸡胚成纤维细胞均出现典型的细胞病变。在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子。该病毒对氯仿、乙醚敏感 ,在pH5 0～ 9 0下稳定 ,5 6℃ 3 0分钟即可灭活该病毒。该病毒能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和。取处理后的病料上清液和传代病毒接种家兔均出现典型的伪狂犬病症状。用所分离病毒提取的DNA及培养病毒液经简单的预处理后作为模板 ,应用特异性引物进行PCR能扩增出伪狂犬病病毒 1 2 40bp的gD基因的特异性片段。结果表明 ,所分离病毒为伪狂犬病病毒 ,并将该毒株命名为猪伪狂犬病病毒LA株。     

猪伪狂犬病病毒变异毒株HeNZK-2014的分离鉴定及gE基因序列分析

为了解猪伪狂犬病病毒（PRV）变异毒株的特点,本研究采集临床疑似PRV感染发病猪的淋巴结等组织样品进行PCR鉴定,选取仅PRV阳性的组织样品经研磨除菌后取上清接种于PK-15细胞进行病毒分离培养、蚀斑纯化、PCR和间接免疫荧光法（IFA）鉴定,采用Reed-Muench法测定PRV的TCID₅₀,接种小鼠并观察临床症状,对纯化的PRV和死亡小鼠脑组织样品进行gE基因PCR扩增及测序分析。结果显示,PRV阳性病料接种于PK-15细胞24 h后出现典型细胞病变（CPE）,经3轮蚀斑纯化后PCR和IFA鉴定结果均为阳性,分离株命名为HeNZK-2014,其TCID₅₀为10^-9.77/0.1 mL;以1×10⁸个TCID₅₀病毒悬液接种小鼠22 h后可引起小鼠出现奇痒、撕咬、死亡等典型猪伪狂犬病症状,死亡小鼠脑组织样品PRV PCR检测结果为阳性;纯化病毒和死亡小鼠脑组织样品gE基因核苷酸序列同源性为100.0%,与GenBank中2011年以前登录的经典毒株位于不同分支,与2011年之后中国流行毒株位于同一分支,在第48和496位各有1个天冬氨酸（D）的插入,具有变异毒株的典型特征。本研究成功分离了1株PRV变异毒株,为进一步开展针对PRV变异毒株的疫苗及其防控研究奠定了基础。     

猪伪狂犬病病毒鲁A株的分离鉴定

从山东省某些猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑及内脏中分离到多株病毒，对其中一代表毒株进行了全面鉴定。该分离毒株在兔肾原代细胞(RK)上和鸡胚成纤维细胞(CEF)上连传5代．均出现典型细胞病变．再接种于RK-13细胞、BHK-21细胞、Vero细胞、PK15细胞和143TK细胞，均出现典型细胞病变；在RK-13细胞上的TCID50为10^-0.52/0．1mL；在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子；对氯仿、乙醚敏感，56℃30min灭活；能被伪狂犬病病毒标准阳性血清中和；病毒接种于家兔和小鼠，均出现典型伪狂犬病症状与病变；提取所分离病毒的DNA作为模板。应用特异性引物，以PCR方法可扩增出伪狂犬病病毒gD基因中272～534nt之间262bp长的特异性片段。上述结果证明，所分离病毒为猪伪狂犬病病毒，并将其命名为猪伪狂犬病病毒鲁A株。     

一例猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及综合防治措施

无菌采集疑似猪伪狂犬病病猪脑组织,进行病毒的分离鉴定。经PCR检测为阳性的病料接种PK-15细胞进行病毒分离,将所分病毒暂命名为SC株。蚀斑实验测定病毒滴度,并采用PCR和琼扩实验对其进行进一步鉴定。结果:PRV阳性病料接种PK-15细胞,传至第5代后产生稳定细胞病变,主要表现为细胞变圆、变亮、聚堆且可见典型的空斑,而对照组细胞贴壁生长良好;基于PRV gE基因的PCR检测,扩增产物为378 bp,与预期目的条带一致;用病毒蚀斑技术测定该分离株的滴度为2.65×104 PFU/mL;琼扩实验显示病毒原液至32倍稀释后均能与PRV阳性血清形成可见沉淀线。以上结果均表明所送检病猪为PRV阳性,据此为猪场提出综合防治措施。     

山东省一例山羊伪狂犬病的病原分离鉴定

2017年4月,山东省某羊场饲养的山羊发生疑似伪狂犬病疫情。为确诊引发疫情的病原,采集死亡山羊组织样品,匀浆处理后接种家兔,并进行病原分离、PCR鉴定、效价测定、电镜观察及主要毒力基因测序分析。结果显示:家兔接种病料上清液后出现奇痒、麻痹,最后死亡;Marc145细胞接种病例样品后,产生变亮、变大、破裂,呈"包涵体"样等PRV特征性细胞病变,细胞分离物伪狂犬病病毒(PRV)g E PCR检测结果为阳性,病毒效价可达10-7.50 TCID50/0.1 m L,电镜观察可见病毒粒子呈圆形,有囊膜,直径约150 nm,将其命名为SDPD-17株。测序发现该毒株g E糖蛋白48、497位各插入了1个天冬氨酸,有12个氨基酸位点发生点突变;g C蛋白氨基酸序列64～70位出现了7个氨基酸(AASTPAA)插入;TK基因无碱基插入或缺失。分离鉴定结果证实,该病例由PRV野毒感染所致。     

山羊源伪狂犬病病毒的分离与鉴定

为确诊一例发病山羊是否感染伪狂犬病病毒,采集发病羊体的肺脏和脑组织进行伪狂犬病病毒gE基因PCR检测,并将病料接种至PK-15细胞分离病毒,以及进行小鼠感染试验和gD基因分析。结果表明,PCR检测结果 PRV阳性,病料接种PK-15细胞24h后,细胞开始出现细胞病变;将病毒感染小鼠,36h后小鼠出现局部奇痒、死亡;gD基因序列分析发现,分离毒株与GenBank中的PRV gD基因序列同源性均在98%以上,氨基酸同源性在99%以上;在分离毒株gD基因的808bp~837bp位置上存在缺失与变异、高变重复区。本研究成功分离获得一株羊源伪狂犬病毒,为云南省羊伪狂犬病防控和基础研究提供资料。     

福建省猪伪狂犬病病毒新流行株gD、gE基因遗传变异分析

为了解福建地区猪伪狂犬病病毒(PRV)流行毒株的分子生物学特性与变异规律。本试验分离了2011-2013年福建省不同地区的11株PRV,并对其gD、gE基因进行遗传变异分析。结果表明,福建地区被检测的规模化猪场均存在野毒感染,病料接种PK-15细胞均能出现典型的细胞病变,分离的毒株接种家兔能出现典型的伪狂犬病症状。PRVgD、gE基因序列分析表明,自2011年福建地区PRV同源性较高且处于一个独立的分支,表明福建地区流行的PRV可能存在一定的抗原变异。     

一例猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及综合防治措施

无菌采集疑似猪伪狂犬病病猪脑组织,进行病毒的分离鉴定。经PCR检测为阳性的病料接种PK-15细胞进行病毒分离,将所分病毒暂命名为SC株。蚀斑实验测定病毒滴度,并采用PCR和琼扩实验对其进行进一步鉴定。结果:PRV阳性病料接种PK-15细胞,传至第5代后产生稳定细胞病变,主要表现为细胞变圆、变亮、聚堆且可见典型的空斑,而对照组细胞贴壁生长良好;基于PRV gE基因的PCR检测,扩增产物为378 bp,与预期目的条带一致;用病毒蚀斑技术测定该分离株的滴度为2.65×10~4PFU/mL;琼扩实验显示病毒原液至32倍稀释后均能与PRV阳性血清形成可见沉淀线。以上结果均表明所送检病猪为PRV阳性,据此为猪场提出综合防治措施。     

猪伪狂犬病的诊断

本文通过荧光抗体组织切片、细胞接种、兔子致病性等方法对临床怀疑为猪伪狂犬病的病猪进行了实验室诊断。结果如下:病猪脾脏和淋巴结制备的冰冻切片经PRV荧光抗体染色后,在荧光显微镜下见到特异性荧光;病料经处理后接种Vero细胞可致细胞圆缩和形成合胞体,具有疱疹病毒的培养特征;将病料上清和细胞培养毒分别皮下接种家兔均可引起奇痒、麻痹死亡,呈现典型的伪狂犬病临床特征,同时病死兔脏器的PRV免疫荧光试验也为阳性。根据上述结果证实了该病为猪伪狂犬病。     

猪伪狂犬病病毒LA株的分离鉴定

从辽宁省某猪场大批死亡的新生仔猪脑及内脏中分离到多株病毒，通过初步验证后选择其中一代表毒株进行了鉴定。该病毒株在PK-15细胞上连续传12代均出现典型的细胞病变，用适应PK-15细胞的病毒接种Veto细胞、猪肾传代细胞IBRS-2及SPF鸡胚成纤维细胞均出现典型的细胞病变。在电镜下可见到典型的伪狂犬病病毒粒子。该病毒对氯仿、乙醚敏感，在pH5．0-9．0下稳定，56℃30分钟即可灭活该病毒。该病毒能被伪狂犬病病毒标准阳性．血清中和。取处理后的病料上清液和传代病毒接种家兔均出现典型的伪狂犬病症状。用所分离病毒提取的DNA及培养病毒液经简单的预处理后作为模板，应用特异性引物进行PCR能扩增出伪狂犬病病毒1240bp的gD基因的特异性片段。结果表明，所分离病毒为伪狂犬病病毒，并将该毒株命名为猪伪狂犬病病毒IA株。     

犬源伪狂犬病毒的分离与鉴定

2012与2013年冬季,本实验室从长春市某宠物诊所连续收到疑似伪狂犬病毒感染的2份犬脑组织病料,接种Vero细胞,分离到2株病毒,经电镜观察、动物回归试验及PCR扩增鉴定为伪狂犬病毒,命名为JLCC-2012和JLCC-2013株。PCR扩增病毒g C基因序列,经遗传进化分析显示,2株PRV g C基因同源性为100%,且与国内犬源分离株BJ/RD、BJ/YT同源性分别为99.93%、100%,与猪源病毒分离株同源性为94.33%~100%,与国外猪源病毒分离株同源性为93.58%~94.81%。结果表明本研究分离株为与最近报道的犬源毒株系相近的流行毒株。     

猪伪狂犬病病毒的分离鉴定及免疫原性初步研究

采集浙江某猪场疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑、脾脏等组织病料,经PCR检测为猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)野毒感染,用BHK-21细胞进行病毒的分离培养,结果显示该病毒能引起典型的细胞病变,第4代病毒液毒价达10^7.0 TCID_50/mL;PCR和动物回归试验结果表明该分离株为PRV,并将其命名为PRV ZJ株。将第4代病毒液制备成油乳剂灭活苗,免疫2 kg左右家兔,免疫后28 d采血并攻毒,测定其免疫原性,结果显示血清中和指数为13490,保护率为100%。本试验结果表明PRV ZJ株有很好的免疫原性,为进一步开展疫苗研究奠定基础。     

猪伪狂犬病病毒新流行株的分离鉴定及抗原差异性分析

我国多个省份的大规模养猪场都出现过新生仔猪神经疾病和死亡的案例,为了确定是否猪伪狂犬病病毒的感染所致,本次研究选取我国多个省份的13个PR免疫猪场送检的156份病毒样品,采用PCR方法对死亡仔猪脑组织中扩增PRV的g E基因,进行PRV病毒的分离鉴定和血清中和实验及g E基因序列分析。将疑似PR病毒发病猪的脑部组织进行匀浆,提取其DNA进行PRV检测,发现各个猪场都存在病毒感染。结论:依据本次实验结果进行推测,当下各个猪场流行的PRV病毒可能存在一定的抗原变异。