苹果组蛋白脱乙酰化酶基因HDA19的生物信息学分析与胁迫响应研究

从‘嘎拉’苹果中克隆了MdHDA19（MDP0000132078）基因。它编码1个脱乙酰化酶,该基因ORF为1 494 bp,编码497个氨基酸,预测其蛋白质分子量为55.73 kD,等电点为4.98。进化树分析表明,HDA19在不同物种间的氨基酸序列保守性较高,其中苹果MdHDA19与可可树TcHDA19亲缘关系最近（87.05%）。MdHDA19表达模式分析显示,其在苹果各个器官中均有表达,尤其在根和花中表达量较高。MdHDA19与苹果中MdSAT18互作,MdHDA19受到盐胁迫诱导,可能参与盐胁迫的调控。MdHDA19表达受低温（4 ℃）和高温（40 ℃）诱导,说明MdHDA19可能参与调控苹果对温度胁迫的响应。并用原核诱导的方法在体外表达了MdHDA19蛋白。     

苹果乙烯响应因子基因MdERF11对脱落酸的敏感性分析

以‘嘎拉’苹果（Malus × domestica Borkh.）为试材，克隆了乙烯响应因子基因MdERF11（序列号 MDP0000756341）。测序发现，该基因包含全长为483 bp的完整开放阅读框，编码161个氨基酸。系统进化树分析表明，这一乙烯响应因子与拟南芥AtERF11蛋白同源序列相似性最高。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测，MdERF11启动子序列中含有与脱落酸（ABA）、乙烯及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明，MdERF11在苹果的各组织中均有表达，在叶柄和果实中表达量相对较高；并且MdERF11的表达明显受到ABA的诱导。在外源ABA的处理下，MdERF11过量表达的苹果愈伤组织的生长势明显比野生型强，表明MdERF11降低了苹果愈伤组织对ABA的敏感性。     

苹果己糖激酶基因MdHXK1的克隆与表达分析

从‘嘎啦’苹果中克隆了己糖激酶基因MdHXK1(基因序列号:MDP0000309677)全长,测序发现其包含长为1 497 bp完整的开放阅读框,编码499个氨基酸,预测其编码蛋白质分子量为54.05k D,等电点为5.76。系统进化树分析表明,HXK1在不同物种间具有高度的序列保守性;其中,苹果MdHXK1与中国白梨Pb HXK1亲缘关系最近。功能域分析表明,MdHXK1蛋白含有两个保守的激酶域。Southern blotting结果表明,MdHXK1在苹果基因组中有一个拷贝。亚细胞定位预测表明,MdHXK1主要定位于细胞质。分析MdHXK1基因启动子序列发现含有与抗逆、糖信号及激素信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdHXK1在苹果的茎和花中表达量较高;在苹果果实发育期间,MdHXK1基因的表达、MdHXK1葡萄糖磷酸化相对酶活性和葡萄糖积累水平都呈现先升高后降低的趋势,MdHXK1基因的表达明显受盐、低温和ABA的诱导。原核诱导并纯化了MdHXK1蛋白,为后续MdHXK1蛋白的功能鉴定奠定基础。     

红肉苹果冷信号基因MdICE1的表达及其蛋白与MdMYB的互作

根据拟南芥AtICE1蛋白序列在苹果基因组中Blast比对得到苹果同源蛋白序列,利用DNAMAN软件设计特异性引物并克隆苹果冷信号基因（MDP0000662999）,暂命名为MdICE1。以从新疆红肉苹果与‘富士’杂交F1代中选出的‘紫红3号’叶片诱导出的红色愈伤组织为试材克隆MdICE1,测序发现该基因的开放阅读框长度为1 626 bp,编码541个氨基酸。进化树分析表明,MdICE1与AtICE1在同一进化支上,推测它们具有相似的功能。氨基酸序列比对发现,MdICE1存在bHLH基序。低温处理有利于苹果愈伤组织花青苷的累积;与培养在24 ℃下的愈伤组织相比,低温（8 ℃）诱导苹果愈伤组织冷信号基因MdICE1以及花青苷合成相关转录因子基因MdMYB10和MdbHLH3的表达。酵母双杂交试验证明MdICE1可以与MdMYB10相互作用;亚细胞定位发现MdICE1蛋白存在于细胞核内;转化大肠杆菌并诱导获得了MdICE1的重组蛋白,为进一步研究MdICE1蛋白在花青苷代谢途径中的功能奠定了基础。     

苹果6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Md6PGDH1的克隆和功能分析

以‘嘎拉’苹果为材料,克隆了6–磷酸葡萄糖酸脱氢酶基因Md6PGDH1(序列号:MDP0000279299)全长。序列分析显示,该基因包含一个长为1 047 bp完整的开放阅读框,编码347个氨基酸,分子量为36.430 k D,预测等电点为9.24。同源性分析表明Md6PGDH1还有另外3个同源基因;功能域分析表明Md6PGDH蛋白含有两个保守的绑定域;亚细胞预测表明Md6PGDH定位存在差异。分析Md6PGDH1启动子发现存在多个响应非生物胁迫的顺式作用元件。定量分析显示,Md6PGDH1在苹果的不同组织中都有表达,且受非生物胁迫诱导。原核诱导Md6PGDH1蛋白并进行蛋白酶活的测定,为后续蛋白功能鉴定奠定了基础。Md6PGDH1在苹果愈伤组织中过量表达,提高其抗盐胁迫的能力。     

月季Rh-ADF1基因在花瓣扩展中响应乙烯的表达特性分析

 为探讨肌动蛋白解聚因子（actin depolymerizing factor,ADF）是否参与乙烯对月季花瓣细胞扩展的调节,以切花月季‘Samantha’为试材,从花瓣中分离到响应乙烯的ADF基因,并将其命名为Rh-ADF1,在GenBank中的登录号为JN048105。推定的氨基酸序列分析表明,Rh-ADF1的开放阅读框长度为423 bp,编码140个氨基酸。半定量RT-PCR分析结果表明,Rh-ADF1在花朵的各个器官中均有表达,在花瓣中略高于其他器官;该基因表达能够被乙烯处理强烈诱导升高,被乙烯作用抑制剂1-MCP（1-Methylcyclopropene）处理明显降低。在洋葱表皮细胞中进行的瞬时表达分析表明,Rh-ADF1蛋白分布在整个细胞中,主要与actin组成的微丝网络结合。据此推测,Rh-ADF1基因在转录水平上参与乙烯对花瓣扩展的调节,乙烯可能通过Rh-ADF1基因调控了花瓣细胞骨架的动态变化,进而影响花瓣细胞扩展和形态变化。     

葡萄VvACO1的表达及在拟南芥和番茄中的遗传转化

采用RT-PCR方法从葡萄（Vitis vinifera）叶片中克隆到1个ACC氧化酶（ACC Oxidase,ACO）基因,命名为VvACO1。序列分析表明,VvACO1的开放阅读框长度为957 bp,编码318个氨基酸,具有亮氨酸拉链、Fe²⁺结合基序和抗坏血酸结合位点等ACO蛋白的典型结构域;与烟草和番茄的ACO蛋白的相似度分别为87%和84%。组织特异性及乙烯诱导表达结果表明,VvACO1在葡萄叶片、卷须、幼茎、果实、花序、须根以及腋芽等组织中差异表达,并受到乙烯利的诱导上调表达。过表达VvACO1的番茄开花期及果实成熟期提前,过表达VvACO1的拟南芥叶片光合效率和叶绿素a的荧光强度明显下降。     

蜡梅胚胎晚期丰富蛋白基因CpLEA的克隆及表达分析

从蜡梅 （Chimonanthus praecox）花cDNA文库中获得了1个胚胎晚期丰富蛋白（LEA）基因的cDNA全长序列,命名为CpLEA（GenBank登录号：JF412788）,该基因cDNA含有一个273 bp编码91个氨基酸的开放阅读框,从蜡梅基因组DNA中扩增该基因发现,该基因含有两个大小分别为35 bp和707 bp的内含子。生物信息学分析显示,CpLEA的编码蛋白含有4个胚胎晚期丰富蛋白第3族LEA蛋白特有的11个氨基酸的基元重复序列,进化树分析表明该编码蛋白与榛子的LEA蛋白亲缘关系最近。通过原核表达获得了与预期大小一致的融合蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在蜡梅成熟种子中表达量最高,在根中几乎不表达;在盛开期花的各个部位中又以雌蕊中的表达量最高;在花发育早期表达量较高,随后下降并保持相对稳定,在衰败期突增并达到最高;检测该基因在脱落酸（ABA 50 μmol · L^-1）、低温（4 ℃）、高温（42 ℃）、干旱（30% PEG6000）和高盐（NaCl 1 mol · L^-1）5种外源非生物胁迫因子作用下的表达特性。结果表明,该基因能够被ABA、低温、高温、PEG 和NaCl诱导表达,并在随后的时间内呈现出不同的表达模式。表明CpLEA可能在蜡梅花发育和多种非生物胁迫响应中发挥作用。     

苹果铁结合蛋白基因的克隆及表达特性

 根据已报道的植物铁结合蛋白基因( ferritin) 的保守区域设计引物, 用RT2PCR 的方法从‘嘎拉’苹果叶片中获得铁结合蛋白基因的全长序列。该基因cDNA共有1 043个碱基, 其中编码区834bp, 编码277个氨基酸残基的蛋白质, 终止密码子后有209 bp左右的3’端尾随序列区。Southern杂交结果显示ferritin基因在‘嘎拉’苹果基因组中至少有7个拷贝存在。0.5 mmol·L ^{- 1}的柠檬酸铁处理‘嘎拉’苹果试管苗不同时间后的定量RT-PCR分析表明, ‘嘎拉’苹果的铁结合蛋白基因随着诱导时间的延长表达量增加, 说明该基因可能在转录水平上受铁诱导表达。     

苹果乙烯响应因子基因MdERF11对脱落酸的敏感性分析

以‘嘎拉’苹果(Malus×domestica Borkh.)为试材,克隆了乙烯响应因子基因MdERF11(序列号MDP0000756341)。测序发现,该基因包含全长为483 bp的完整开放阅读框,编码161个氨基酸。系统进化树分析表明,这一乙烯响应因子与拟南芥AtERF11蛋白同源序列相似性最高。利用PlantCare数据库进行基因启动子顺式作用元件预测,MdERF11启动子序列中含有与脱落酸(ABA)、乙烯及干旱信号相关的顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,MdERF11在苹果的各组织中均有表达,在叶柄和果实中表达量相对较高;并且MdERF11的表达明显受到ABA的诱导。在外源ABA的处理下,MdERF11过量表达的苹果愈伤组织的生长势明显比野生型强,表明MdERF11降低了苹果愈伤组织对ABA的敏感性。     

柑橘响应溃疡病菌转录因子基因CsAP2-09的克隆与功能分析

对柑橘中AP2转录因子进行注释,并克隆柑橘溃疡病相关的Cs AP2-09,研究外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利、机械损伤以及溃疡病菌对该基因的诱导表达,确定其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库一共注释出12个AP2成员,据系统发育和结构可以将其分为4个亚类;可能与抗、感溃疡病相关的Cs AP2-09基因全长4 159 bp,开放阅读框1 467 bp,编码488个氨基酸,具有典型的AP2结构,同时也具有一些结构特殊性;该基因在细胞核中优势表达,与定位信号预测结果吻合;上游启动子元件含多个与植物逆境或激素应答相关的顺式作用元件,如BOX-W1、CGTCA-motif、TCA-element、WUN-motif等;诱导结果表明Cs AP2-09对外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利及机械损伤均有响应;柑橘溃疡病菌侵染可诱导抗病品种四季橘中此基因明显上调表达,而在感病品种纽荷尔中变化趋势不显著。上述研究表明Cs AP2-09是一个响应溃疡病菌侵染的,可作为研究柑橘抗溃疡病的候选基因。目前已将其在锦橙中超表达,共筛选出8个转基因植株,后期将对其进行抗病性评价以确定其分子育种价值。     

苹果MdNAC143的克隆及其在苹果愈伤组织的抗盐功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个NAC转录因子基因MdNAC143(序列号:MDP0000334047),其开放阅读框为924 bp,编码308个氨基酸,预测蛋白质的分子量为35.59 k D,等电点为6.32。结构域分析表明,MdNAC143蛋白N端含有保守的NAC结构域。酵母双杂交结果表明MdNAC143的全长及C端具有转录激活活性。荧光定量PCR分析表明,MdNAC143在苹果的各个组织均有表达,其中在叶片和花中表达相对较高;MdNAC143的表达明显受盐胁迫的诱导。将MdNAC143遗传转化‘王林’苹果愈伤组织,进行抗盐表型鉴定后发现,MdNAC143在愈伤组织中过量表达后能明显提高对盐胁迫的抗性。     

MdMYB73的分子克隆及其在苹果愈伤组织和拟南芥幼苗中的盐抗性功能鉴定

从‘嘎拉’苹果中克隆了一个MYB转录因子基因(序列号:MDP0000894463)。该基因包含长为729 bp完整的开放阅读框,编码243个氨基酸,预测其蛋白质分子量为26.34 kD,等电点为9.29。系统进化树分析表明,这一MYB转录因子与拟南芥AtMYB73同源序列相似性最高,因此将其命名为MdMYB73。功能域分析表明,MdMYB73蛋白含有保守的R2R3-typeMYB绑定域。荧光定量PCR分析表明,MdMYB73在苹果的各个组织均有表达,在叶片和花中表达相对较高;MdMYB73的表达明显受盐胁迫的诱导。将异位表达MdMYB73的拟南芥幼苗进行抗盐鉴定,结果表明MdMYB73负调控拟南芥盐胁迫抗性;同时,AtSOS1,AtSOS3和AtNHX1抗盐相关基因的表达水平显著降低,表明MdMYB73可能负调控SOS反应,影响拟南芥抵抗高盐胁迫过程。将MdMYB73基因遗传转化苹果愈伤组织,抗盐表型分析表明,MdMYB73过量表达也明显降低了转基因愈伤组织对盐胁迫的抗性。     

芹菜AgERF4转录因子基因的克隆与表达分析

以‘六合黄心芹’芹菜为材料,克隆出编码乙烯反应元件结合蛋白基因AgERF4。序列分析表明,AgERF4含有1个长度为597 bp的开放阅读框,编码198个氨基酸,预测其蛋白质相对分子质量为21.43 kD,等电点为8.51。进化分析表明,ERF4转录因子在植物中高度保守。AgERF4属于亲水性蛋白。酵母单杂交和β–半乳糖苷酶活性测定结果确定AgERF4转录因子和乙烯应答元件GCC Box具有较高的结合活性。RT-qPCR分析表明,AgERF4在芹菜叶片中的表达水平较高,在根和叶柄中表达水平较低;高温和干旱条件下AgERF4的表达呈先上升后下降的趋势,在盐处理的24 h内AgERF4的表达始终高于对照。AgERF4转录因子在芹菜非生物逆境胁迫调控过程中起着重要作用。     

甘蓝自交不亲和相关转录因子BosiPA1 蛋白基因的克隆与表达分析

 通过自交不亲和甘蓝‘A1’自花授粉1 h 和未授粉柱头蛋白质表达谱的对比,鉴定出1 个受 自花授粉诱导上调表达的蛋白,通过PCR 技术获取了其编码序列,命名为BosiPA1 蛋白,其基因全长为 3 730 bp,具有1 个1 092 bp 的完整编码框（KF314579）。BosiPA1 由6 个外显子、5 个内含子组成,编码 363 个氨基酸。序列分析表明BosiPA1 蛋白具有典型的basic helix-loop-helix（bHLH）功能域,在SCR、SRK、 Exo70A1 基因的ATG 上游启动子序列中存在可以被bHLH 功能区识别并结合的E-box（CANNTG）序列。 在分子进化上甘蓝BosiPA1与AtbHLH128 距离最近,与AtHEC1/2/3 和TgGBOF-1 处在同一个分支。RT-PCR 检测表明甘蓝BosiPA1 基因在花瓣、萼片、花粉、柱头和叶片中均有表达;荧光定量PCR 分析表明BosiPA1 基因在自花授粉10 min、30 min、1 h 的柱头中呈逐渐上升趋势。上述结果说明BosiPA1 与bHLH 的进化 分支较早,可能是一个参与甘蓝多器官发育的自交不亲和相关的转录因子。     

黄瓜扩张素蛋白基因CsEXPb1的克隆及表达分析

基于黄瓜果实转录组学研究,筛选并克隆了一个扩张素蛋白（β-expansin）基因CsEXPb1。蛋白序列同源比对发现CsEXPb1蛋白是一类钙调素类似蛋白（Calmodulin-like Protein,CML）,与甜瓜、草莓及番茄扩张素蛋白基因具有较高的相似性;ExPasy分析发现CsEXPb1为亲水性蛋白,亚细胞定位分析证明该蛋白广泛分布在细胞质以及细胞核结构中;qRT-PCR分析发现CsEXPb1无论是在授粉坐果还是单性结实坐果过程中皆上调表达,而在不授粉败育的果实中下调表达;qRT-PCR也表明CsEXPb1的表达受到生长素、细胞分裂素和赤霉素等单性结实诱导激素的正向调控,推测CsEXPb1与黄瓜坐果有关,可能参与了激素诱导的单性结实过程。     

苹果花芽和种子休眠过程中MdCIbHLH1基因的表达分析

对前期在苹果（Malus × domestica Borkh.）中发现的受低温诱导的bHLH转录因子进行了生物信息学分析,并以层积苹果种子和苹果芽为试材,用半定量和实时定量PCR技术分析其花芽休眠不同阶段的表达变化。蛋白质二级结构预测结果表明,MdCIbHLH1蛋白中以α螺旋和无规则卷曲为主,β折叠和延伸链较少,其中α螺旋145个（27.31%）、β折叠19个（3.58%）、无规则卷曲310个（58.38%）、延伸链57个（10.73%）。半定量和定量结果显示,在层积的苹果种子和休眠的花芽中MdCIbHLH1有相同的表达模式,在休眠解除之前表达较高,随着休眠的解除其表达量下调。因此推测MdCIbHLH1的表达对层积的苹果种子或者花芽休眠及解除具有调控作用。     

苋菜中甜菜红素代谢相关基因AmMYB2的表达与功能分析

为了研究AmMYB2基因在苋菜(Amaranthus tricolor)甜菜红素合成中的作用,对红色苋菜品种‘大红’AmMYB2(登录号为KY814751.1)进行生物信息、基因表达及功能分析。结果表明:AmMYB2的开放阅读框(ORF)全长为678 bp,编码蛋白分子质量为25.96 kD,该蛋白具有R2R3型MYB结构域,属于R2R3型MYB转录因子。核酸序列分析结果显示,AmMYB2与甜菜红素合成相关的甜菜BvMYB1和苋菜AmMYB1的相似度分别达到62.11%和49.93%。亚细胞观察显示,AmMYB2蛋白定位于细胞核。实时荧光定量(qPCR)分析发现,AmMYB2在红色苋菜品种的表达量高于绿色苋菜品种;在‘大红’苋菜中,不同组织以及叶片不同部位中AmMYB2的表达量与甜菜红素含量成正比。构建AmMYB2过表达载体,将其转入烟草和拟南芥中,发现该基因能够在这两种植物中高水平表达,但不会引起颜色变化,揭示AmMYB2可能是苋菜中甜菜红素合成的正调控因子,可能不参与花青素的合成。     

‘秦冠’苹果MdWRKY基因亚细胞定位及原核表达

 以‘秦冠’苹果为试材,采用RT-PCR方法获得了一个WRKY基因,全长1 224 bp,推断其编码331个氨基酸,命名为MdWRKY。亚细胞定位分析MdWRKY蛋白分布在细胞核内,属于核蛋白。实时定量分析结果显示,MdWRKY基因受苹果斑点落叶病菌的诱导,表明其可能参与植物与病原菌的互作。随后进行原核表达分析,SDS/PAGE电泳结果表明表达蛋白与其蛋白大小一致。     

香蕉GLP基因家族全基因组鉴定及表达分析

为揭示香蕉类萌发素蛋白（GLP）功能，对香蕉GLP基因家族（MaGLP）进行了全基因组鉴定，分析了基因结构、染色体分布和启动子顺式作用元件和转录因子结合位点（TFBS）分布情况以及编码蛋白的理化性质、保守基序、进化关系，同时基于转录组的结果研究它们在4 ℃和45 ℃处理的叶片、枯萎病菌FocTR4处理的根系以及自然成熟和乙烯催熟的不同成熟阶段的果实中的表达情况。结果显示：MaGLP家族共有44个成员，编码区CDS序列长度为567 ~ 2 103 bp，分布于除10号染色体外的所有染色体上。大部分GLP基因包含1 ~ 2个外显子，多数GLP具有信号肽且主要定位在胞外。进化树分析发现，MaGLP可分为8个亚家族，其中亚家族M为香蕉特有。顺式作用元件和TFBS预测结果显示，MaGLP启动子区存在多种植物激素和逆境胁迫相关响应元件以及7种TFBS。MaGLP成员在香蕉不同组织部位中的表达水平差异较大且受多种胁迫调控。其中MaGLP5-1和MaGLP9-8对各种处理均有响应，MaGLP1-2和MaGLP9-4受高温、低温胁迫抑制，而MaGLP9-6受高温、低温胁迫诱导，MaGLP5-4受高温和FocTR4调控，MaGLP4-4仅响应高温胁迫。研究结果表明MaGLP在香蕉抵御逆境过程中发挥重要作用。