联合肌注猪IL2真核质粒对PPV VP2-PCV2 ORF2核酸疫苗免疫效果的影响

将猪IL2基因和PPV VP2基因、PCV2 ORF2截短基因克隆至真核表达载体pCI-neo,构建了重组质粒pCI-ORF2-VP2和pCI-IL2,用脂质体介导法将pCI-ORF2-VP2质粒转染PK15细胞,采用间接免疫荧光法检测在体外的表达情况。并以小鼠为动物模型,将pCI-IL2和pCI-ORF2-VP2质粒联合肌注免疫小鼠,相同剂量免疫2次,间隔2周,同时设立pCI-ORF2-VP2、pCI空载体、猪细小灭活苗、圆环亚单位苗对照,检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞的转化功能,外周血T淋巴细胞亚群的动态变化及血清抗体的滴度。结果显示,pCI-ORF2-VP2在PK15细胞中能正常表达,联合免疫组在第28天能够检测到PPV和PCV2抗体,第21~42天诱导淋巴细胞转化和CD4+、CD8+细胞的数量高于或显著高于pCI-ORF2-VP2质粒组。结果表明,猪IL2质粒联合肌注可以提高VP2/ORF2核酸疫苗的免疫效果。     

鸡IL-1β、IL-16基因真核表达质粒对IBV DNA疫苗的免疫增强效应研究

为研究鸡IL-1β、IL-16基因真核表达质粒对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)DNA疫苗免疫效果的影响,根据GenBank登录的鸡IL-1β和IL-16序列设计两对引物,采用RT-PCR方法从四川山地乌骨鸡外周血淋巴细胞RNA中克隆IL-1β和IL-16基因,与真核表达质粒pcDNA3.1(+)连接构建了pDNAIL-1β和pDNAIL-16。分别将两种重组质粒与IBVDNA联合免疫SPF雏鸡并进行攻毒试验。结果表明,pDNAIL-1β和pDNAIL-16均能促进血清中特异性抗体水平和外周血T淋巴细胞亚群数量的增加(p<0.05),增强IBV DNA疫苗对同型强毒的保护率15%～25%,pDNAIL-1β提升DNA疫苗的抗体水平的时间比pDNAIL-16多7d。试验表明,鸡IL-1β、IL-16基因真核表达质粒对IBV DNA疫苗的免疫具有增强作用。     

CpG寡核苷酸对IBDV VP2基因真核表达质粒免疫增效作用

以传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2蛋白基因表达质粒DNA为免疫原，以CpG的寡核苷酸(CpG-0DN)为免疫佐剂，肌肉注射于14日龄SPF鸡，1周后加强免疫1次，2次免疫后15d和21d分别测定血清ELISA抗体效价，并于免疫后21d用IBDV99儿强毒株攻毒和进行病理学观察。结果显示，(1)VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组的ELISA抗体水平明显高于VP2重组质粒免疫组；(2)IBD弱毒苗与VP2重组质粒免疫组抗体水平明显高于VP2重组质粒免疫组，且比VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组略高；(3)VP2基因重组质粒DNA与CpG共同免疫组及IBD弱毒苗与VP2重组质粒免疫组可明显降低IBDV强毒攻击后引起的急性发病率和死亡率。由此表明，CpG寡核苷酸对IBDV VP2蛋白基因真核表达质粒免疫具有明显增强作用，有很大的应用前景。     

禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因重组质粒在鸡体内免疫效果的研究

为检测禽多杀性巴氏杆菌(P.multocida)外膜蛋白H基因的免疫效果,本研究利用PCR技术扩增禽P.multocida的omph基因片段,并克隆于pcDNA3.1(+)中构建重组质粒pOMPH,经体外表达检测后进行动物免疫,实验动物共分4组:pOMPH组、弱毒疫苗组、pcDNA3.1(+)空载体组和PBS对照组。免疫后对各组鸡进行免疫指标检测,并于三免后两周进行攻毒。结果显示,pOMPH免疫组和弱毒疫苗免疫组血清抗体水平持续上升,与两对照组相比差异极显著(p<0.01),并且pOMPH免疫组血清抗体水平明显高于弱毒疫苗组(p<0.05)。淋巴细胞增殖试验结果也表明,pOMPH和弱毒疫苗组的刺激值(SI值)极显著高于两对照组(p<0.01),并且重组质粒组高于弱毒疫苗组。免疫鸡外周血淋巴细胞产生的IFN-γ极显著高于两对照组(p<0.01),并且pOMPH组高于弱毒疫苗组(p<0.05)。攻毒后pOMPH组和弱毒疫苗组的保护率分别为66.7%和73.3%,表明pOMPH虽然可以为免疫鸡提供一定的保护,但效果不如商品化的弱毒活疫苗,还需采取措施进一步增强其免疫原性。     

共表达猪IFN-γ基因对PPV VP 2-PCV ORF2真核质粒的分子免疫佐剂效应研究

将干扰素-γ、猪圆环病毒Ⅱ型ORF2主要抗原表位(47-85位AA)和猪细小病毒VP2基因克隆至pCI-neo真核载体中,构建重组质粒pCI-IFN-γ.ORF2.VP2.用脂质体介导法将其转染到MDBK细胞中,利用RT-PCR和间接免疫荧光法检测产物的表达情况.将重组质粒pCI-IFN-γ.ORF2.VP2、pCI-ORF2.VP2、对照质粒pCI-neo、PBS、猪细小病毒火活苗和猪圆环病毒亚单位疫苗通过肌肉注射免疫小鼠,检测小鼠不同时期的淋巴细胞转化功能、T淋巴细胞亚群动态变化情况以及PPV、PCV2抗体水平.试验结果显示,在转染重组质粒的MDBK细胞中能扩增到ORF2-VP2和IFN-γ基因;转染后48 h用间接免疫荧光法能在荧光显微镜下观察到绿色荧光,检测到特异性蛋白的表达.pCI-IFN-γ.ORF2.VP2免疫组从第7天开始脾淋巴细胞对ConA有明显反应,显著高于对照组和PCI-ORF2.VP2免疫组;CD3+CD4+、CD3+CD8+T淋巴细胞的数量高于或显著高于对照组和pCI-ORF2.VP2免疫组;在免疫后第14天检测到PPV PCV抗体.结果表明,pCI-IFN-γ.ORF2.VP2能够有效诱导机体产生细胞免疫和体液免疫.     

猪A组轮状病毒主要蛋白的编码基因DNA疫苗联合免疫的研究

为研究猪A组轮状病毒(PRV-A)血凝蛋白(VP4)、群抗原蛋白(VP6)和中和抗原蛋白(VP7)编码基因疫苗联合免疫的效力,本研究将表达PRV-AVP4、VP6、VP7蛋白基因的真核表达质粒pVAX1-VP4、pVAX1-VP6、pVAX1-VP7以pVAX1-VP4+pVAX1-VP7(B组)和pVAX1-VP4+p VAX1-VP6+pVAX1-VP7(A组)设计试验组,分别以100μg/只经肌肉注射途径免疫BLAL/c小鼠,间隔2周以相同剂量、途径加强免疫,共免疫3次,免疫后不同时间采血,采用ELISA检测血清抗体。结果显示,B组在免疫后14 d和42 d检测到RV抗体阳性(P/N≥2),A组在免疫后14 d、28 d、42 d均检测到RV抗体阳性(P/N≥2);脾脏免疫相关细胞测定结果表明,A组的CD4~+/CD8~+T淋巴细胞比值和CD19~+B细胞数量均高于B组,两组与对照组相比差异显著(p0.05);淋巴细胞转化试验显示A组的SI值均高于B组,并且42 d时A、B两组差异显著(p0.05)。上述结果表明,3组分联合免疫的DNA疫苗可以诱导小鼠产生较强的体液和细胞免疫应答,为PRV-A的核酸疫苗研究奠定了基础。     

猪IL2基因重组对PPV VP2-PCV2ORF2真核质粒免疫原性增强的研究

将猪IL2成熟肽基因、PPV VP2基因和PCV2 ORF2抗原多肤基因定向克隆至真核表达载体pCI-neo,构建重组质粒pCI-ORF2-VP2和pCI-IL2-ORV2-VP2,用脂质体介导法将其转染PK15细胞,采用RT-PCR法和间接免疫荧光法检测重组质粒在体外的表达情况.并以小鼠为动物模型,分别将pCI-IL2-ORF2-VP2质粒、pCI-ORF2-VP2质粒、pCI空载体、猪细小灭活苗和圆环亚单位苗通过肌注进行免疫,检测免疫小鼠脾脏淋巴细胞转化功能,外周血T淋巴细胞亚群的动态变化及血清抗体效价.结果表明,重组质粒在体外能正常表达,pCI-IL2-ORF2-VP2免疫小鼠脾脏淋巴细胞转化功能,CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量和血清PPV/PCV2抗体的OD值在二免后均高于或显著高于pCi-ORF2-VP2对照组.结果表明,猪IL2基因重组能显著增强VP2/ORF2核酸疫苗诱导的免疫应答.     

猪IL-2对pcDNA-E39.VP2真核共表达质粒免疫原性的影响

为了研究猪IL-2基因的真核质粒和融合基因形式对pcDNA-E39.VP2真核共表达质粒的免疫增强作用,分别将IL-2基因插入pcDNA3.1(+)和pcDNA-E39.VP2(已构建)中构建重组质粒pcDNA-IL2和pcDNA-IL2-E39.VP2。将真核质粒pcDNA-IL2-E39.VP2免疫小鼠,另外,将pcDNA-IL2分别先于和后于pcDNA-E39.VP2 3d免疫小鼠,同时设pcDNA-E39.VP2对照组。对免疫小鼠进行PPV(JEV)抗体水平、脾脏淋巴细胞增殖功能和外周血T淋巴细胞亚群变化的检测。结果显示,1周后,pcDNA-IL2-E39.VP2免疫组和pcDNA-IL2后于pcDNA-E39.VP注射的免疫组JEV/PPV抗体水平和脾脏淋巴细胞增殖活性显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)高于对照组,pcDNA-IL2先于pcDNA-E39.VP注射的免疫组仅在第5周显著(P<0.05)高于对照组;各组(除对照组外)CD8+值差异不显著(P>0.05),CD4+、CD4/CD8值都高于对照组,其中pcDNA-IL2-E39.VP2免疫组与对照组差异极显著(P<0.01)。结果...     

重组鸡白细胞介素-2对禽流感灭活疫苗免疫增强作用的研究

为研究重组鸡白细胞介素-2(IL-2)对H5N1亚型禽流感灭活苗的免疫效果,将重组IL-2蛋白和禽流感灭活疫苗联合免疫14日龄SPF鸡,免疫后每周测定一次血清抗体效价﹑脾脏T淋巴细胞亚群,最后计算攻毒保护率。试验结果表明:重组IL-2蛋白具有增强禽流感疫苗免疫效果的作用,提高了血清中的抗体水平﹑增加了脾脏T淋巴细胞CD4+﹑CD8+亚群数量。     

重组鸡白细胞介素-6/2融合蛋白对新城疫(LaSota株)活疫苗免疫增强作用研究

为探究重组鸡白细胞介素-6/2融合蛋白(rChIL-6-Linker-ChIL-2,重组融合蛋白)对新城疫病毒(NDV)活疫苗(LaSota株)的免疫增强作用,本研究将90只SPF鸡随机分为6组,分别为PBS对照组、NDV弱毒苗对照组、rChIL-6-Linker-ChIL-2免疫增强组、rChIL-6蛋白免疫增强组、rChIL-2蛋白免疫增强组及rChIL-6+rChIL-2混合蛋白免疫增强组,将鸡白细胞介素重组融合蛋白水剂与LaSota株联合接种于SPF鸡,分别采用MTS法、流式细胞术、ELISA和HA/HI法检测接种前后不同时间各组鸡外周血及脾淋巴细胞增殖活性、鸡外周血中CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞的百分含量、血清中Th1/Th2型细胞因子表达水平及免疫抗体水平等指标。结果显示,接种后7～21d时,与NDV弱毒苗对照组相比,同时接种重组融合蛋白组鸡淋巴细胞增殖活性、外周血CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞的百分含量比值及血清中重组鸡IL-4蛋白(rChIL-4)、ChIL-6、ChIL-2、重组鸡IFN-α蛋白(ChIFN-α)、ChIFN-γTh1/Th2型细胞因子表达水平明显提升;HI免疫抗体较NDV弱毒苗对照组提高了1.0～1.9个滴度,较单一rChIL-6、rChIL-2对照组分别提高了0.2～0.7、0.2～1.1个抗体滴度。综上所述,rChIL-6-Lin-ker-ChIL-2融合蛋白对NDV(LaSota株)活疫苗在鸡体内具有明显的免疫增强效果。     

乙型脑炎病毒NS1和NS1-2A蛋白的真核表达及其差异性研究

为深入研究乙型脑炎病毒（JEV）NS1和NS1-2A蛋白的表达和免疫效果差异,本试验构建并扩增C-端含Flag标签的NS1和NS1-2A基因,利用T4 DNA连接酶分别连接到质粒pcDNA3.1（+）上,构建重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag。将这两种真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,利用RT-PCR、IFA和Western blotting检测NS1和NS1-2A蛋白在体外的表达情况,用pcDNA3.1-NS1-Flag、pcDNA3.1-NS1-2A-Flag和pcDNA3.1（+）免疫BALB/c小鼠,检测这两种蛋白在体内的表达差异。结果显示,试验成功构建了NS1和NS1-2A基因的真核表达载体pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag,IFA和Western blotting鉴定NS1和NS1-2A蛋白成功表达,重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠后可诱发机体产生特异性体液免疫,pcDNA3.1-NS1-2A-Flag联合免疫组小鼠血清抗体效价和INF-γ细胞因子分泌水平比pcDNA3.1-NS1-Flag免疫组高,且与pcDNA3.1（+）空载体免疫组差异极显著（P<0.01）;pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫组小鼠体内的INF-γ分泌量会增多,免疫第4周达到最高后逐渐降低。pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠能够刺激JEV特异性抗体的分泌和增强机体的细胞免疫功能,且NS1-2A联合基因的免疫效果优于NS1单一基因,为进一步研究JEV的非结构蛋白功能、研发NS1和NS1-2A基因疫苗奠定基础。     

传染性法氏囊病病毒主要结构蛋白VP2、VP1和VP2-VP1串联基因的原核表达及其初步应用

为获得传染性法氏囊病病毒(IBDV)特异性抗体检测用抗原VP2、VP1及VP2-VP1蛋白,分别设计引物扩增IBDV野毒株NN1172的VP2和VP1基因,并扩增VP2和VP1基因中抗原性和亲水性较好的重要区域,通过PCR扩增基因串联方法对截短的VP2和截短的VP1基因进行串联,首次获得VP2-VP1串联基因,并对VP2、VP1和VP2-VP1串联基因进行了原核表达和鉴定。结果成功构建了原核表达载体pET-VP2、pET-VP1和pET-VP2-VP1;诱导表达条件显示,3个重组质粒分别转入BL21菌株后经0.05 mmol/L IPTG诱导表达,分别得到分子量为69、114和63 kDa的VP2、VP1和VP2-VP1重组蛋白,且均以包涵体形式表达,3个重组蛋白分别于诱导后5、3和6 h时表达量最多。Western blot结果显示,表达的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白与鸡抗IBDV阳性血清均具有良好的反应原性。以纯化的VP2、VP1和VP2-VP1蛋白作为包被抗原对传染性支气管炎病毒(IBV)、呼肠孤病毒(ReoV)、禽白血病病毒(ALV)和新城疫病毒(NDV)4种阳性血清检测均为阴性,表明所获得的纯化蛋白具有高度的特异性;对免疫了IBD灭活疫苗,IBD基因工程疫苗和IBD弱毒疫苗的商业鸡群进行抗体检测,结果均能显示疫苗免疫后机体抗体水平的变化趋势。本研究表明利用该原核表达系统所表达的3个蛋白均具有良好的免疫反应活性,为IBDV特异性抗体的检测和新型亚单位疫苗的研发奠定基础。     

鸡IFN-γ重组鸡痘病毒对鸡传染性腔上囊炎MB43弱毒疫苗免疫鸡免疫应答的影响

将重组鸡痘病毒（rFPV—IFN-γ）与IBDMB43弱毒疫苗联合接种SPF鸡，研究重组鸡IFN-γ对IBD疫苗免疫效果的影响。结果显示，rFPV—IFN-γ和MB43弱毒疫苗联合免疫组（MB43＋rFPV-IFN-）＂）及rlFN-γ和MB43弱毒疫苗联合免疫组（MB43＋rIFN-γ）在免疫后第2周即可检出ELISA抗体，比MB43疫苗单独免疫组早1周。用IBDVGx株攻击后，MB43＋rFPV-IFN-γ组和MB43＋rIFN-γ组免疫鸡的脾只有个别淋巴细胞核浓缩、核崩解，少数滤泡萎缩变性坏死；胸腺损伤程度轻于MB43疫苗单独免疫组和非免疫对照组。免疫后1周，3个免疫组外周血CD8^＋T淋巴细胞含量均显著高于非免疫对照组，CD4^＋T淋巴细胞含量变化不明显；攻毒后第2周，3个疫苗免疫组CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞含量均显著升高，各组之间CD4^＋、CD8^＋T淋巴细胞含量无明显差异。证实，rFPV—IFN-γ和rIFN-γ可加强疫苗的细胞免疫和体液免疫应答。     

乙型脑炎病毒NS1和NS1-2A蛋白的真核表达及其差异性研究

为深入研究乙型脑炎病毒(JEV)NS1和NS1-2A蛋白的表达和免疫效果差异,本试验构建并扩增C-端含Flag标签的NS1和NS1-2A基因,利用T4 DNA连接酶分别连接到质粒pcDNA3.1(+)上,构建重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag。将这两种真核表达质粒分别转染BHK-21细胞,利用RT-PCR、IFA和Western blotting检测NS1和NS1-2A蛋白在体外的表达情况,用pcDNA3.1-NS1-Flag、pcDNA3.1-NS1-2A-Flag和pcDNA3.1(+)免疫BALB/c小鼠,检测这两种蛋白在体内的表达差异。结果显示,试验成功构建了NS1和NS1-2A基因的真核表达载体pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag,IFA和Western blotting鉴定NS1和NS1-2A蛋白成功表达,重组质粒pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠后可诱发机体产生特异性体液免疫,pcDNA3.1-NS1-2A-Flag联合免疫组小鼠血清抗体效价和INF-γ细胞因子分泌水平比pcDNA3.1-NS1-Flag免疫组高,且与pcDNA3.1(+)空载体免疫组差异极显著(P0.01);pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫组小鼠体内的INF-γ分泌量会增多,免疫第4周达到最高后逐渐降低。pcDNA3.1-NS1-Flag和pcDNA3.1-NS1-2A-Flag免疫小鼠能够刺激JEV特异性抗体的分泌和增强机体的细胞免疫功能,且NS1-2A联合基因的免疫效果优于NS1单一基因,为进一步研究JEV的非结构蛋白功能、研发NS1和NS1-2A基因疫苗奠定基础。     

兔瘟病毒VP60基因重组真核表达质粒的构建及其免疫原性

采用RT-PCR方法扩增兔病毒性出血症病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)衣壳蛋白VP60基因,PCR产物纯化后克隆到pMD19-T载体,获得重组质粒pMD19-T-VP60,并进行序列测定。测序正确的pMD19-T-VP60经EcoRⅠ与XhoⅠ双酶切后,将目的片段VP60插入真核表达载体pVAX-1,构建真核表达质粒pVAX1-VP60。将构建好的重组质粒pVAX1-VP60按500μg/只腿部肌肉注射25日龄家兔,同时设pVAX-1组、兔瘟组织灭活苗组和PBS组。分别于免疫后7,14,21,28,35,42 d对各组兔静脉采血,间接ELISA法检测血清中特异性抗体水平,结果显示PBS组和pVAX-1组未检测到特异性抗体,pVAX1-VP60组和兔瘟组织灭活苗组家兔都能产生高水平的特异性抗体,在特异性抗体水平高峰期,2组数据差异不显著(P0.05)。于免疫后3,7,14,21,28,35,42 d随机剖杀pVAX1-VP60组试验兔3只,取心、肝、脾、肺、肾、腿部肌肉,提取组织DNA,进行PCR检测,结果均检测到目的基因VP60的存在。免疫后28 d以滴度10~8的RHDV 0.5 m L/只腿部肌肉注射攻毒,pVAX-1组、PBS组、兔瘟组织灭活苗组、pVAX1-VP60组的相对保护率分别为0%,0%,90%,85%,表明pVAX1-VP60具有良好的免疫效果。     

重组鸡白细胞介素-6/2融合蛋白对新城疫(LaSota株)活疫苗免疫增强作用研究

为探究重组鸡白细胞介素-6/2融合蛋白(rChIL-6-Linker-ChIL-2,重组融合蛋白)对新城疫病毒(NDV)活疫苗(LaSota株)的免疫增强作用,本研究将90只SPF鸡随机分为6组,分别为PBS对照组、NDV弱毒苗对照组、rChIL-6-Linker-ChIL-2免疫增强组、rChIL-6蛋白免疫增强组、rChIL-2蛋白免疫增强组及rChIL-6+rChIL-2混合蛋白免疫增强组,将鸡白细胞介素重组融合蛋白水剂与LaSota株联合接种于SPF鸡,分别采用MTS法、流式细胞术、ELISA和HA/HI法检测接种前后不同时间各组鸡外周血及脾淋巴细胞增殖活性、鸡外周血中CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞的百分含量、血清中Th1/Th2型细胞因子表达水平及免疫抗体水平等指标。结果显示,接种后7～21d时,与NDV弱毒苗对照组相比,同时接种重组融合蛋白组鸡淋巴细胞增殖活性、外周血CD3+CD4+/CD3+CD8+T淋巴细胞的百分含量比值及血清中重组鸡IL-4蛋白(rChIL-4)、ChIL-6、ChIL-2、重组鸡IFN-α蛋白(ChIFN-α)、ChIFN-γTh1/Th2型细胞因子表达水平明显提升;HI免疫抗体较NDV弱毒苗对照组提高了1.0～1.9个滴度,较单一rChIL-6、rChIL-2对照组分别提高了0.2～0.7、0.2～1.1个抗体滴度。综上所述,rChIL-6-Lin-ker-ChIL-2融合蛋白对NDV(LaSota株)活疫苗在鸡体内具有明显的免疫增强效果。     

鸡传染性喉气管炎病毒gB基因重组DNA疫苗的构建与鸡IL-18联合免疫试验

本研究构建了编码ILTV糖蛋白gB基因的重组DNA疫苗pgB,为测定该DNA疫苗与鸡IL-18联合免疫的试验效果,将pgB、pIL-18分别以单独和联合的方式免疫21日龄SPF雏鸡,免疫后每周抽取外周血及外周抗凝血,应用ELISA和流式细胞仪分别检测免疫鸡的体液免疫及细胞免疫水平。二免疫后第3周用100 ELD50ILTV强毒进行攻击。结果显示,pgB和pgB与pIL-18联合免疫组均能诱导鸡产生特异性的体液免疫及细胞免疫应答,其中以pgB与pIL-18联合免疫组的T淋巴细胞亚群CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+明显高于单独pgB免疫组(P0.01),87%抵抗ILTV强毒的致死性攻击。     

堆型艾美耳球虫重组DNA质粒pcDNA3-3-1E的免疫原性

用E.acervulina重组质粒pcDNA3-3-1E免疫雏鸡,观察其对雏鸡细胞免疫和体液免疫功能的影响。将7日龄雏鸡随机分为4组,即空白对照组、pcDNA3.1空质粒组、重组质粒免疫组和卵囊免疫组,每组30只。pcDNA3-3-1E经肌肉注射途径免疫雏鸡,剂量为50μL/只（含质粒1g/L）。7日龄免疫1次,14日龄加强免疫1次。检测雏鸡血液T淋巴细胞增殖率,测定血清抗体水平。结果显示,与空质粒组和健康对照组相比,重组质粒组淋巴细胞的增殖能力明显增强（P〈0.05）,外周血中IgG的含量均显著升高（P〈0.05）,表明pcDNA3-3-1E裸质粒DNA能有效的提高雏鸡的细胞免疫和体液免疫水平。     

禽流感病毒HA基因DNA疫苗诱导鸡CD8+T细胞的动态变化

用表达禽流感病毒血凝素HA抗原的重组质粒pCAGGoptiHA5 100μg免疫SPF鸡,用流式细胞仪检测鸡体内CD8 T细胞的动态变化。一次免疫后,免疫组外周血中CD8 T淋巴细胞数目逐渐上升,并于第3周达到峰值,在二次免疫后,SPF鸡体内CD8 T细胞数量上升速率明显高于初免时上升速率,并于第二次免疫后2周达到一个峰值,攻毒后,二次免疫的SPF鸡外周血中CD8 T淋巴细胞数量略有上升,但上升幅度不大,2周时检测发现其下降幅度明显低于一次免疫组。而阴性对照组SPF鸡外周血中CD8 T淋巴细胞的数目则无明显变化,但在攻毒后其外周血中CD8 T淋巴细胞数量也呈上升趋势,但未达到免疫组的水平,并且在1周内全部死亡。结果表明,pCAGGopti-HA5 DNA疫苗质粒可诱导有效的细胞免疫应答。     

禽多杀性巴氏杆菌基因组表达文库的构建及其免疫效果

以限制性内切酶Sau3A I酶切禽多杀性巴氏杆菌基因组DNA,回收500～3 000 bp的DNA片段,连接真核表达裁体pcDNA3.1(+),电转化于大肠杆菌感受态细胞TG1中,构建禽多杀性巴氏杆菌的基因组表达文库.将文库随机分为5个子文库(子文库Ⅰ-子文库Ⅴ),分别提取各子文库重组质粒,以pcDNA3.1(+)和PBS为对照进行动物试验,每组16只BALB/c小鼠,各子文库组和pcDNA3.1(+)组以100 μg/只的剂量肌注免疫,PBS组每只小鼠肌注100μL 1×PBS,各组均免疫3次,每次间隔2周.间接ELISA检测免疫小鼠的血清抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况,三免2周后检测脾淋巴细胞IFN-γ的分泌情况.强毒攻击,计算小鼠的相对保护率.结果显示,动物免疫后子文库Ⅰ组质粒免疫的小鼠血清抗体水平及淋巴细胞增殖水平和IFN-γ分泌水平均持续上升,明显高于其他各组(P＜0.05).动物攻毒试验表明,各子文库组的重组质粒均可为免疫小鼠提供一定的保护,其中第Ⅰ组的保护效果最好,说明子文库Ⅰ组中含有较好的保护性抗原基因,这为进一步筛选相关的免疫原基因和研制新型疫苗奠定了的基础.