紫山药黄酮醇合成酶DaFLS1基因的克隆和表达分析

为了解黄酮醇在紫山药中的合成特点,利用3'-和5'-RACE技术从紫山药中分离到黄酮醇合成酶Da FLS1基因编码序列(Gen Bank登录号:KJ022640)。Da FLS1基因编码序列全长为1 113 bp,其开放阅读框长度为1 005 bp,编码334个氨基酸。Da FLS1蛋白质属于水溶性胞质不稳定蛋白质,无跨膜区和信号肽结构。保守区域分析结果显示,Da FLS1蛋白质属于α-酮戊二酸和二价铁离子依赖型的加氧酶家族[2OG-Fe(II)Oxygenase superfamily];Da FLS1氨基酸序列与水仙(AFS63900)同源性最近(75%),其次是洋葱(AAT68476,74%),与金鱼草(ABB53382)的同源性仅为66%。系统进化分析结果显示,紫山药与其他作物亲缘关系较远。Da FLS1在紫山药幼嫩叶片中表达水平最高,并且在紫山药幼叶中的表达有2个高峰期,而在其他组织中的表达量极低或不表达,即Da FLS1在紫山药中的表达情况符合黄酮醇合成酶基因(FLS)的特征。上述结果说明,得到的基因为紫山药黄酮醇合成酶基因Da FLS1,具有FLS基因的生物信息学特征和表达特征。     

葡萄风信子黄酮醇合酶基因克隆和表达分析

以葡萄风信子‘亚美尼亚’的根、茎、叶、花为材料,采用RT-PCR技术克隆得到一条FLS基因,命名为MaFLS2。生物信息学分析表明,该基因cDNA全长为1 152 bp,含有完整的开放读码框1 056 bp,编码353个氨基酸,MaFLS2蛋白是一种亲水性蛋白,氨基酸序列含有典型的DIOX_N结构域(2-酮戊二酸-双加氧酶活性的N端区域)和2OG-FeII_Oxy超家族结构域,属于2-酮戊二酸-双加氧酶(2-ODDs)蛋白家族。实时定量PCR结果显示,MaFLS2基因在蓝白葡萄风信子中的表达存在组织特异性,蓝色品种‘亚美尼亚’中在花蕾未着色时表达量最高,而白色品种‘白丽人’在根中表达量最高, 在花发育的不同阶段,MaFLS2基因在‘亚美尼亚’中的表达峰值出现在花蕾未着色时期,基因表达总体呈现出先降低后升高再降低的趋势,而在‘白丽人’中的表达峰值出现在转色中期,总体呈现出先升后降的趋势。研究结果为开展单子叶植物花色育种提供了理论依据。     

葡萄风信子FLS1基因克隆及其表达与花色性状之间的关联性分析

黄酮醇合成酶(flavonol synthase,FLS)是类黄酮合成分支路口重要的节点酶。FLS基因的表达不仅影响着黄酮醇合成,也影响着花青素苷积累和花色呈现。本研究采用PCR技术从葡萄风信子‘白丽人’中克隆到一条FLS基因(MaFLS1)。序列分析表明,MaFLS1cDNA全长1 152bp,编码383个氨基酸。同源比对及进化分析表明,MaFLS1属于2-酮戊二酸与Fe+2依赖型双加氧酶蛋白,具有典型的FLS蛋白功能域、DHQ底物特异结合位点、Fe2+和2-酮戊二酸绑定位点;MaFLS1与海枣、油棕的FLS同源性最高,可达74%~75%,与拟南芥、矮牵牛等模式植物亲缘关系较远。荧光定量PCR分析发现,MaFLS1基因在葡萄风信子中为非组织特异性表达模式,其根中表达量最高,鳞茎及花中的表达量其次,叶片中表达量最低;MaFLS1在3个不同花色的葡萄风信子品种5个不同花发育时期表达差异显著,在白色品种‘白丽人’花发育的早期(S1和S2)时期表达较高,粉色品种‘粉日出’和蓝色品种‘亚美尼亚’晚期(S3和S4)表达量最高。本研究为进一步探讨葡萄风信子FLS基因在花色呈现中的功能及黄酮醇支路的分流竞争对花色的影响提供基因资源和依据。     

甜樱桃黄酮醇合酶基因的克隆及其表达分析

为了解黄酮醇合酶在甜樱桃类黄酮生物合成途径中的作用,根据其他物种已知的FLS cDNA保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE的技术,从甜樱桃(Prunus avium.L)嫩叶中扩增获得FLS cDNA全长,命名为PaFLS(GenBank登录号:JQ289290).该基因cDNA全长为1 077 bp,开放阅读框为1 014 bp,编码337个氨基酸,分子质量为38 ku,等电点pI为5.58.生物信息学分析表明PaFLS属于依赖2-酮戊二酸的双加氧酶家族(2OG-FeII_Oxy),该基因所编码的氨基酸序列与苹果、梨和草莓的同源性分别为99％、97％和77％.将该基因重组到表达载体pGEX4T-1中进行原核表达,电泳检测到一条约为65 ku的融合蛋白(含27 ku的GST标签).组织时空表达分析表明,PaFLS在甜樱桃的花中表达量最高,这可能和黄酮醇参与花粉萌发及利于授粉有关.     

不同植物黄酮醇合成酶FLS的生物信息学分析

采用生物信息学方法和工具分析19种不同植物中的黄酮醇合成酶基因的核苷酸序列及编码氨基酸序列,对其理化特性、功能结构域、亲/疏水性、二级结构、信号肽、跨膜结构域以及分子系统进化关系等进行预测和推断,并构建分子进化树。结果表明,不同植物FLS基因的开放阅读框全长在1.0 kb左右,编码蛋白含330余个氨基酸,呈酸性,是一个没有任何信号肽、转运肽和跨膜结构域的亲水性蛋白。不同植物FLS氨基酸序列包含有黄酮醇合成酶功能域,而且琢-螺旋和不规则盘绕是其蛋白质二级结构的最大量结构元件。19个植物FLS在分子进化树中主要聚成3小支,来源于同科植物的FLS首先聚在一起,再与其他物种FLS聚在一起,进化分析在一定程度上反映了这些物种FLS的进化关系。     

东方百合查尔酮异构酶基因LhCHI的克隆及表达

利用RT-PCR结合RACE的方法从东方百合‘索邦’花被片中克隆了查尔酮异构酶(CHI)基因,命名为Lh CHI(Gen Bank登录号为KJ784468)。该基因开放阅读框702 bp,编码233个氨基酸,预测该蛋白相对分子质量25 KD,等电点(p I)为4.7。同源比对和系统进化分析表明,Lh CHI基因编码的氨基酸序列具有查尔酮异构酶典型的催化活性保守位点,与百合科郁金香(Tulipa fosteriana)查尔酮异构酶序列一致性为83.3%。半定量PCR和荧光实时定量PCR分析结果表明,Lh CHI基因在百合的根、茎、叶片、鳞茎、开放花被片、花药以及柱头中均有表达,花器官中相对表达量较高,花发育后期的柱头、花柱、花被片等组织中Lh CHI基因表达水平普遍高于花发育早期。     

长筒石蒜花青素合成酶基因LlANS的克隆与表达分析

以粉色系长筒石蒜(Lycoris longituba)花瓣为材料,基于前期获得的长筒石蒜转录组数据,通过序列分析结合聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法,成功克隆得到长筒石蒜Ll ANS基因的全长编码序列,并对其进行了生物信息学分析及亚细胞定位观察。结果表明,该基因开放阅读框(Open reading frame,ORF)全长为1 068 bp,编码355个氨基酸,蛋白质相对分子质量约为40.08 k D,理论等电点为5.58,属于酸性不稳定的亲水性蛋白;Ll ANS蛋白属于α-酮戊二酸依赖性双加酶家族,具有典型的花青素合成酶(Anthocyanidin synthase,ANS)蛋白功能结构域2OG-Fell-Oxy;系统进化树分析表明该基因与同属的石蒜和中国石蒜中ANS基因具有较高同源性,最高达97%;亚细胞定位观察显示Ll ANS蛋白定位于细胞核、细胞质及细胞膜中。此外,实时荧光定量分析证实Ll ANS基因在长筒石蒜粉色花花蕾期表达量较低,在盛花期的表达量最高。以上结论表明,Ll ANS作为长筒石蒜花色苷合成途径中的一个关键节点基因,对于长筒石蒜粉色花花色的形成起着极为重要的作用。     

百合S-RNase基因cDNA全长克隆及表达分析

[目的]克隆百合S-RNase基因cDNA全长序列并进行表达信息分析,为百合不亲和机制的研究奠定基础。[方法]以东方百合(Lilium oriental)品种‘Justina’为材料,通过RACE技术克隆百合S-RNase基因的cDNA全长序列;采用半定量RT-PCR技术对百合同一时期不同器官的S-RNase基因的表达量进行定性分析;并通过NCBI在线工具以及ProtParam、SignalP、MEGA5对其序列进行生物信息学分析。[结果]克隆基因全长为766bp,开放阅读框为672bp,推导编码223个氨基酸;其半定量分析显示表达量由高到低的器官依次为花瓣、叶、茎、大量分泌液时的花柱、无分泌液时的花柱、鳞茎。通过生物信息学分析发现,该蛋白为一个不稳定的亲水蛋白、存在信号肽序列,属于分泌型蛋白。具有典型的RNase T2家族蛋白保守结构域特征,二级结构富含环形结构。在已知的S-RNase基因中,与野茶树的亲缘关系最近。[结论]获得百合S-RNase基因cDNA全长序列及在同一时期不同器官的S-RNase基因的表达量。     

浓香型和淡香型百合单萜合酶基因差异表达

[目的]东方百合香味浓,亚洲百合香味淡,花香差异明显.选取白色的东方百合‘西伯利亚’(Lilium ‘Siberia’)和亚洲百合‘罗马广场’(Lilium‘ NOVANO’)为材料,拟通过分析单萜合成酶基因差异表达,揭示花香差异原因.[方法]采用RT-PCR方法克隆百合单萜合酶基因,并通过Realtime-PCR分析两种百合不同花期的单萜合酶基因表达.[结果]从Lilium ‘Siberia’和Lilium‘ NOVANO’花瓣中克隆得到芳樟醇合酶基因Li-LiS和月桂烯合酶基因Li-MyS.Li-LiS的核苷酸序列与油棕的序列与油棕、海枣相似度分别达到66％、67％,蛋白的氨基酸序列与油棕、可可相似度分别为48％、44％.Li-MyS的核苷酸序列与六出花、烟草相似度分别达到为69％、42％,蛋白的氨基酸序列与六出花、葡萄同源性分别为51％、49％.在花蕾、半开、盛开、衰败四个花期中,Lilium‘ Siberia’花瓣两个单萜合成酶基因表达水平均高于Lilium‘ NOVANO’,并且除了Li-MyS在盛开期和衰败期外,均表现出显著差异.[结论]单萜合成酶基因的差异表达是导致东方百合和亚洲百合香味差异的一个重要原因.     

甘薯花青素合成酶(ANS)基因的克隆及其组织表达模式分析

从NCBI数据库中检索得到甘薯ANS序列,利用同源比对在前期转录组数据库中筛选获得同源序列,通过PCR反应克隆出甘薯ANS基因(IbANS)的c DNA全长序列,进而预测和分析IbANS基因的蛋白质序列,同时对其在不同甘薯品种的不同组织进行了实时定量PCR分析。结果表明,该c DNA具有最大开放阅读框(ORF),共1 086个碱基,编码362个氨基酸残基;ANS蛋白为亲水性蛋白质,不存在信号肽;保守结构域预测分析表明,该基因编码的蛋白具有典型的ANS蛋白功能结构域,属于2OG-Fe II_Oxy双加氧酶超家族;系统进化树分析显示,甘薯ANS与三浅裂野牵牛亲缘关系最近;荧光定量PCR结果表明,IbANS在紫心甘薯块根中高表达。研究结果可为进一步阐明IbANS基因在紫心甘薯块根中的形成及累积机制提供理论基础。     

叶子花花色DOD基因全长cDNA克隆与序列分析

以叶子花花苞为材料,运用RACE技术克隆出了叶子花苞片中的多巴双加氧酶基因cDNA全长,探讨叶子花花色变化机理和甜菜色素代谢途径。该序列长度为1 059 bp,开放阅读框位于56-802 bp之间,共编码249个氨基酸残基。对该氨基酸序列进行生物信息学分析,结果表明该氨基酸序列具有多巴双加氧酶保守结构域,所组成的蛋白分子量为27.94 kD,等电点为5.48,是稳定蛋白。对其二级结构进行预测:该序列具有8个α螺旋、8个β转角、20个β折叠,其序列大多是由亲水性氨基酸残基组成,不具有跨膜结构和信号肽。对该氨基酸序列进一步的Blast比对,发现组成多巴双加氧酶的氨基酸序列因植物种类而异,且亲缘关系越远,差异越大,结合花青素与甜菜色素代谢途径的不同和在自然界中不能共存的现象,表明多巴双加氧酶基因在生成甜菜色素植物中具有独特的保守性。     

小体鲟卵透明带家族ZP3亚型和ZPAX基因cDNAs克隆及其组织表达分析

为研究透明带ZP家族在小体鲟Acipenser ruthenus性腺发育、卵子发生等过程中所发挥的作用,采用PCR技术克隆获得小体鲟卵透明带家族ZP3 3种亚型(ArZP3-1、ArZP3-4、ArZP3-5)及ZPAX基因(ArZPAX)cDNA部分序列。结果表明:ArZP3-1部分cDNA序列长度为1029 bp,对应编码342个氨基酸;ArZP3-4部分cDNA序列长度为1191 bp,对应编码397个氨基酸;ArZP3-5部分cDNA序列长度为717 bp,对应编码238个氨基酸;ArZPAX部分cDNA序列长度为733 bp,对应编码243个氨基酸;ArZP3蛋白3种亚型及ArZPAX蛋白氨基酸序列中均含有一个保守的ZP结构域;基于ZP氨基酸序列的系统发育树显示,小体鲟ArZP3蛋白3种亚型与高等鱼类ZP3亲缘关系较近,而ArZPAX蛋白则与哺乳类、鸟类、高等鱼类和爬行类ZPAX亲缘关系均较远;通过半定量RT-PCR进行组织表达特异性分析表明,ArZP3-1基因在小体鲟卵巢、精巢、肝、脑、肾、心、肌肉、鳃中表达,ArZP3-4基因仅在小体鲟卵巢和精巢中表达,而ArZPAX基因在小体鲟卵巢、精巢、肝、肠、肾、脾、心、鳃、脑中均有表达,3个基因在性腺中的表达量均最高,且均具有雌、雄差异性表达特点。     

万寿菊类胡萝卜素裂解双加氧酶基因CCD1克隆与表达分析

【目的】克隆万寿菊(Tagetes erecta L.‘Scarletade’)类胡萝卜素裂解双加氧酶基因CCD1(TeCCD1),分析其序列特征和表达特性,为阐明其在类胡萝卜素降解途径中生物学功能及进一步探讨万寿菊花色形成机理提供理论基础。【方法】依据万寿菊花蕾转录组数据,利用同源序列比对结果设计引物,结合RT-PCR技术克隆获得万寿菊CCD1 cDNA全长,分析其序列特征;利用Real-time PCR分析舌状花未开花蕾、半开花蕾、开放的头状花序和完全开放的头状花序4个不同发育时期的基因表达特性。【结果】克隆获得万寿菊CCD1(Gen Bank登录号:KX557488)的cDNA全长序列为1 746 bp,编码区长度1 626 bp,编码541个氨基酸。蛋白质分析表明TeCCD1为不稳定蛋白,不含信号肽,属RPE65超家族(登录号:PF03055),包含CCD家族保守结构域,主要定位于细胞质。万寿菊CCD1核酸序列与除虫菊CCD1同源性最高,为89%;氨基酸序列分析表明万寿菊CCD1与除虫菊CCD1同源性高达93%,与其他19个不同种属的CCD1同源性在75%—83%,说明TeCCD1是高度保守的基因;系统进化树分析显示TeCCD1的进化基本符合植物分类学的进化规律,并具有明显的种属特征,万寿菊与菊科同源基因亲缘关系最近。Real-time PCR分析表明TeCCD1在舌状花发育过程中均有表达,随舌状花的开放逐渐升高,S4期达到最大值。【结论】克隆获得万寿菊舌状花的CCD1,是典型的CCD家族成员,为高度保守的基因,主要定位于细胞质,万寿菊舌状花颜色变浅可能与CCD1表达量增加导致类胡萝卜素降解有关。     

紫苏β-酮脂酰ACP合成酶基因家族生物信息学分析

紫苏作为一种新型油料作物,富含多种不饱和脂肪酸,其中,α-亚麻酸含量高达61.2%。β-酮脂酰ACP合成酶在植物脂肪酸合成中起着关键性作用。对紫苏β-酮脂酰ACP合成酶(KAS)基因家族及其编码蛋白进行了详细的生物信息学分析。结果表明,紫苏KAS家族蛋白中,KASⅡ基因编码的氨基酸数最多,KASⅢB最少,均为疏水性脂溶蛋白,无信号肽,推测该家族蛋白为非分泌型蛋白;家族蛋白都含有KAS保守结构域,属于cond-enzymes超蛋白家族,二级结构组成基本相同。系统进化树分析结果表明,紫苏KASⅠ与拟南芥KASⅠ、紫苏KASⅡ与油茶KASⅡ、紫苏KASⅢ与油茶KASⅢ亲缘关系最近,紫苏与油棕、油棕榈KAS酶家族亲缘关系较远。研究结果可为深入探究紫苏脂肪酸合成机制奠定理论基础。     

胡萝卜类黄酮含量的测定及DcCHS基因家族的鉴定分析

查尔酮合成酶(chalcone synthase, CHS)是类黄酮合成过程中的第一个关键酶,具有重要的生理功能。测定胡萝卜不同发育时期、不同组织部位的类黄酮含量,并在全基因组水平上对胡萝卜CHS基因家族进行鉴定和分析。结果表明,无论在苗期还是收获期,胡萝卜叶中的类黄酮含量均极显著地高于根中的含量。叶中的类黄酮含量在不同发育时期无显著差异,而根中的类黄酮含量在不同发育时期却差异显著。胡萝卜基因组中共有12个DcCHS基因,分布于5条染色体上,氨基酸序列长度为253～398 aa,外显子1～3个。经预测,DcCHS蛋白均定位于细胞质,二级结构以α-螺旋和无规卷曲为主。DcCHS蛋白可分为ClassⅠ和ClassⅡ两类,含有10种保守基序,motif1、4、6、7为CHS蛋白N端结构域,motif2、3、8为CHS蛋白C端结构域。这些研究结果可为胡萝卜CHS基因的功能研究提供参考。     

芍药PlFLS基因生物信息学分析及对拟南芥的遗传转化

【目的】探讨类黄酮合成途径关键基因黄酮醇合酶基因(FLS)在芍药Paeonia lactiflora花色调控中的作用。【方法】克隆获得芍药Pl FLS基因,对其进行生物信息学分析,构建Pl FLS基因的过表达载体,通过农杆菌介导的Floral-dip法进行拟南芥遗传转化研究。【结果】生物信息学分析表明,芍药Pl FLS基因氨基酸序列与茶树相似性较高,存在2个功能结构域,但不存在信号肽位点。芍药Pl FLS蛋白预测模型揭示了其蛋白三级结构中存在1个2–氧代戊二酸配体,并与多条肽链相连接。试验成功获得了转Pl FLS基因纯合拟南芥植株,GUS染色和PCR鉴定证实了目的基因已经整合转基因植株基因组,q RT-PCR分析显示,相对于野生型,Pl FLS基因在遗传转化植株中显著高表达(P0.05)。色谱分析结果显示,转Pl FLS基因拟南芥植株叶片中花黄素含量显著增加(P0.05)。【结论】成功构建转Pl FLS基因拟南芥,并证明Pl FLS基因可以显著影响拟南芥类黄酮合成途径。     

细叶百合LpWRKY20基因的克隆和表达分析

从细叶百合(Lilium pumilum)中克隆得到LpWRKY20基因,该基因ORF全长为1899bp,编码632个氨基酸,属于WRKY家族Group1;蛋白相对分子量约为68.36ku,理论等电点为5.45,为亲水性蛋白没有跨膜结构;同源氨基酸序列分析显示与海枣(Phoenix dactylifera)同源性达到62%;亚细胞定位显示其在细胞核内表达,具有一般转录因子特性。qRT-PCR分析显示随着鳞茎低温(4℃)储藏时间的增加,该基因的表达量逐渐升高并且在S4时期达到最大,表明其参与调控百合鳞茎休眠解除进程,为进一步了解该基因功能奠定基础。     

芸薹属作物花粉发育相关基因MS1的生物信息学分析

[目的]利用生物信息学分析芸薹属作物MS1基因的结构功能,为作物杂种优势利用提供理论参考.[方法]以拟南芥花粉发育关键基因AtMS1为参考序列,通过BLAST比对获得同源基因序列,运用生物信息学方法对其编码氨基酸序列进行预测分析.[结果]从甘蓝型油菜、白菜、甘蓝等芸薹属作物基因组中获得4条同源序列,与AtMS1基因的相似性在88.0%以上,均含有3个外显子,其CDS序列长度均为2004 bp,编码667个氨基酸.4个芸薹属作物MS1蛋白均含有1个植物同源结构域(Plant homeodomain,PHD),属于亲水性不稳定蛋白,定位于细胞核,磷酸化以丝氨酸(Ser)为主,以苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)为辅;二级结构均由α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲组成,其中α-螺旋所占比例最高,在40.00%以上,β-转角所占比例最低,仅为10.00%左右;其三级结构大致相同,均为球状的功能结构域.4个芸薹属作物MS1蛋白和AtMS1蛋白序列的相似性为95.69%.4个芸薹属作物MS1蛋白的PHD结构域序列高度保守,仅有3个位点氨基酸残基存在差异.19个不同植物的MS1同源蛋白聚为两大类,其中琴叶拟南芥、亚麻荠、萝卜的MS1蛋白与4个芸薹属作物MS1蛋白及拟南芥AtMS1蛋白聚为一类,均属于十字花科植物,即MS1蛋白的聚类结果与植物系统分类结果相吻合.[结论]芸薹属作物MS1基因属于PHD-finger基因家族,其序列高度保守,参与调控花粉发育成熟过程.     

茶树花蕾14-3-3蛋白基因的分子克隆及差异表达分析

【目的】从分子水平研究茶树花蕾发育阶段的相关基因表达,了解茶树花蕾的发育机理,利用分子生物学技术抑制茶树的生殖生长、促进营养生长。【方法】利用cDNA-AFLP技术对茶树花蕾发育早期和晚期的差异表达进行分析。采用RACE技术克隆到花蕾发育晚期阶段特异表达的、在花蕾发育中可能起重要作用的14-3-3基因,通过RT-PCR和Western-blot方法研究该基因转录水平和蛋白质表达水平的特点。【结果】在测定的大约1 110个茶树花蕾cDNA片段中,122个（10.9%）是差异性表达的,其中87个在发育晚期特异表达,包括茶树14-3-3蛋白基因（GenBank登录号：DQ444463）,其全长为1 072 bp,包含1个由783个核苷酸组成的ORF,编码260个氨基酸,5′非翻译区和3′非翻译区分别有67和222个核苷酸,该基因与其它植物的14-3-3蛋白基因在核苷酸序列和推导的氨基酸序列方面均有着比较高的相似性。RT-PCR和Western-blot分析表明该基因在茶树的晚期发育花蕾中特异表达。【结论】14-3-3蛋白仅存在于茶树发育晚期的花蕾中。cDNA-AFLP技术能用于茶树花蕾不同发育时期的基因分离研究。     

高羊茅光敏色素A基因FaPHYA的克隆与分析（英文）

以高羊茅转录组学测序获得的PHYA序列为模板,同时结合3’RACE和5’RACE方法从高羊茅中扩增出PHYA基因的全长c DNA序列,命名为Fa PHYA。该序列c DNA全长3 983 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,293~3 682 bp),编码蛋白为1 129个氨基酸,Fa PHYA的N端由GAF和Phytochrome结构域组成;C端包括2个重复的PAS结构域,1个组氨酸激酶A结构域,1个类似组氨酸激酶的ATP酶结构域。对编码蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,Fa PHYA与单子叶植物PHYA蛋白的氨基酸序列一致性较高,同源一致性水平达85%以上,亲缘关系较近。与双子叶植物的PHYA蛋白的氨基酸序列一致性较低,亲缘关系相对较远。