烟草(云烟87)NBS-LRR类同源抗病基因克隆及分析

[目的]克隆并分析烟草NBS-LRR类抗病基因的同源序列(RGAs),为采用同源克隆技术挖掘烟草抗病基因提供理论参考.[方法]从基于NBS-LRR类抗病基因保守序列设计的简并引物中筛选扩增效果较好的引物用于扩增烟草RGAs,采用DNAMAN 6.0翻译成氨基酸序列,并与已知的其他植物抗病基因进行聚类分析.[结果]克隆获得6条与参比抗病基因具有高度同源性的烟草RGAs,大小在500 bp左右,但仅有4条RGAs具有连续的开放阅读框(ORF)及编码NBS功能结构域的核苷酸序列,命名为TRGA-87-1~TRGA-87-4.这4个烟草RGAs编码的氨基酸序列均含有NBS类抗病蛋白的多个典型保守基序,与已知的多种植物抗病基因编码的氨基酸序列均具有较高的相似性,其中,与烟草相关抗病基因编码的氨基酸序列相似性最高,为97.00%~100.00%,与其他植物的抗病基因编码氨基酸序列相似性为29.00%~53.00%,这些序列可分为3个亚类,其中TRGA-87-2与烟草N和亚麻L6聚为一类(TRGAⅠ),属于TIR-NBS-LRR类;TRGA-87-3和TRGA-87-4与水稻Xa-1和番茄Mi聚为一类(TRGAⅡ),属于non-TIR-NBS-LRR类,TRGA-87-1与拟南芥RPM1聚成一类(TRGAⅢ),属于non-TIR-NBS-LRR类.[结论]同源扩增技术可用于烟草中抗病基因的克隆、功能分析及定位等研究.     

水稻PHD锌指蛋白cDNA的克隆及其表达分析

利用cDNA-AFLP分析籼稻明恢86应答稻纵卷叶螟取食基因差异表达,发现1个与植物同源结构域(PHD)锌指蛋白高度同源的TDF,分离获得该TDF对应的粳稻全长cDNA.该全长cDNA与籼稻、玉米、蓖麻、葡萄、拟南芥和大豆等作物PHD锌指蛋白推定氨基酸序列的同源性分别为98.43%、86.01%、54.58%57.02...     

十字花科植物HSP22基因同源序列的克隆与进化分析

采用PCR克隆技术,根据已报道的拟南芥的AtHSP22基因全长及其他物种同源序列设计特异引物,在十字花科植物大白菜、普通白菜、芥菜型油菜、甘蓝型油菜、花椰菜、芥菜、荠菜、萝卜3个属10个物种中成功克隆得到耐热相关基因HSP22的同源序列10条。序列比对分析表明:这些同源序列的相似性达89.3%以上,所推导的氨基酸序列相似性达92.1%以上。由进化树可直观地看出,芸薹属与荠属亲缘关系最近,首先聚为一类;其次与萝卜属、拟南芥属聚为一类。由氨基酸序列预测的高级结构存在明显差异,且无规则卷曲最多,α-螺旋均在30%以上,因而属于α结构蛋白。     

陆地棉GhWOX4转录因子的克隆与生物信息学分析

采用反转录PCR(简称RT-PCR)技术从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)中克隆获得1个WOX基因,命名为Gh WOX4(NCBI登录号:KX900572)。序列分析显示,Gh WOX4的开放阅读框为657 bp,编码含218个氨基酸残基的蛋白,具有典型高度保守的同源异型HD结构域,属于WOX转录因子家族。生物信息学分析表明,该基因蛋白相对分子量为25.19 ku,等电点为10.04,为不稳定蛋白。二级结构以无规则卷曲为蛋白最大量的结构元件。与其他植物同源基因序列比对显示,其同源区域主要集中在同源异型HD结构域。系统进化树分析表明,Gh WOX4属于Ⅰ类家族成员,与陆地棉Gh_D01G1055、拟南芥At WOX4和可可树Tc WOX4等亲缘关系最近,处于同一个进化分支,推测其可能与之前报道的拟南芥WOX基因类似,参与植物维管束及花器官发育。     

芒果乙烯受体ETR1和ERS1基因的克隆及序列分析

[目的]克隆芒果乙烯受体ETR1和ERS1基因(MiETR1和MiERS1),并进行生物信息学分析,为研究乙烯受体在芒果成熟和衰老过程中的调控机制提供理论参考.[方法]以芒果为材料,应用RACE技术扩增MiETR1和MiERS1基因的cDNA序列,并应用生物信息学方法对其编码的氨基酸序列进行预测分析.[结果]克隆获得的MiETR1基因cDNA序列全长2570 bp,开放阅读框(ORF)2220 bp,编码739个氨基酸;MiERS1基因的cDNA序列全长2171 bp,ORF 1890 bp,编码629个氨基酸;GenBank登录号分别为KY002681和KY002682.MiETR1和MiERS1蛋白均为含跨膜结构的非分泌型疏水蛋白,属于乙烯受体ETR1家族成员,以Ser为主、Thr为辅的磷酸化修饰调控乙烯信号转导,均含有3个典型的模块,即GAF结构域、HisKA结构域和HATPase_c结构域,MiERS1蛋白较MiETR1缺少REC结构域.不同物种ETR1和ERS1蛋白的氨基酸序列具有高度保守性,MiETR1和MiERS1均与甜橙(Citrus sinensis)和克莱门柚(Cit-rus clementina)的ETR1和ERS1蛋白亲缘关系较近,但二者分别聚在两个不同的分支上,表明两个蛋白存在一定的遗传分化.[结论]乙烯受体基因在芒果成熟和衰老过程中发挥调控作用.     

大豆再生相关基因GmLEC的克隆及生物信息学分析

利用同源克隆技术,对拟南芥再生相关基因LEC进行同源序列比对,从大豆中克隆LEC基因两个成员的全长CDS序列,得到大豆再生相关基因Gm LEC1-a,Gm LEC1-b及Gm LEC2-a,Gm LEC2-b,用生物信息学方法对大豆Gm LEC1及Gm LEC2基因核苷酸序列以及蛋白质结构、亲水性和疏水性及进化树等进行分析。结果表明,大豆再生相关基因Gm LEC1-a编码区长度为672 bp,编码223个氨基酸,Gm LEC1-b编码区长度为681 bp,编码226个氨基酸,Gm LEC2-a编码区长度为2 205 bp,编码734个氨基酸,Gm LEC2-b编码区长度为2 196 bp,编码731个氨基酸,Gm LEC蛋白为亲水性不稳定蛋白;通过对LEC蛋白功能结构域进行分析发现,Gm LEC1为H4超家族成员,Gm LEC2为B3超家族成员,并均与拟南芥属植物亲缘较近。     

棉花DELLA蛋白GhGAI4b基因的克隆及功能初步分析

[目的]DELLA蛋白已在不同的物种中被广泛鉴定,并且功能区高度保守,是GA信号通路中的负调控因子,在棉花纤维细胞起始和发育中起重要的作用.研究棉花中DELLA基因的功能.[方法]从棉花中克隆DELLA蛋白的同源基因GhGAI4b,构建35S:GhGAI4b植物过量表达载体,通过农杆菌侵染花序的方法转入野生型拟南芥中,观察转基因植株的表型.[结果]序列分析表明GhGAI4b全长开放阅读框1 617 bp,编码538个氨基酸,具有DELLA蛋白的典型结构域.采用Clustal X将GhGAI4b的氨基酸序列与其他已知的DELLA蛋白氨基酸序列进行相似性比对,发现GhGAI4b氨基酸序列与陆地棉、拟南芥的相似性较高,达到47;以上.转基因株系表现出叶片颜色深绿,叶片缩小且肥厚,叶片细长呈锯齿状;有些株系会出现多重莲座叶,雄蕊发育不全,晚花,株高变矮等赤霉素不敏感突变体的表型.[结论]过表达GhGAI4b能够抑制拟南芥莲座叶的生长和发育,影响转基因拟南芥花器官的发育,严重时引起转基因拟南芥的不育.     

铁皮石斛热激转录因子(Hsf)基因家族鉴定及生物信息学分析

[目的]鉴定铁皮石斛热激转录因子(Hsf)基因家族成员,并进行生物信息学分析,为深入研究该家族在铁皮石斛热应激响应中的调控机制提供理论参考.[方法]以拟南芥和水稻Hsf蛋白氨基酸序列为参考序列,在铁皮石斛蛋白数据中搜索其同源蛋白序列,利用SMART和Pfam数据库鉴定出其Hsf基因家族成员.利用生物信息学方法对铁皮石斛Hsf基因家族组成、基因结构、启动子区顺式作用元件及其编码蛋白结构域和进化关系等进行分析.[结果]共鉴定获得23个铁皮石斛Hsf基因家族成员,编码氨基酸数量为132~514个,平均343个,多数属于酸性蛋白和亲水性蛋白,可分为HsfA、HsfB和HsfC组,其中HsfA组成员13个、HsfB组成员9个、HsfC组成员1个.除DoHsfA3仅包含motif 1和motif 2外,其他HsfA组蛋白均含有motif 1~motif 5,HsfB和HsfC组蛋白均缺少motif 5.铁皮石斛Hsf蛋白缺少A9、B3、B5和C1亚类成员,与同属于单子叶兰科植物的小兰屿蝴蝶兰Hsf蛋白亲缘关系最近.HsfA组成员包含完整的HSF功能域和卷曲螺旋(CC)功能域,HsfB和HsfC组成员缺少或含不完整的CC功能域.DoHsfA1A蛋白具有保守的丝氨酸—苯丙氨酸—缬氨酸—精氨酸—谷氨酰胺序列.铁皮石斛Hsf基因启动子区含有大量激素响应、胁迫响应和生长相关元件.[结论]铁皮石斛Hsf基因家族成员进化较保守,其生物学功能存在明显物种特异性,进化关系较复杂,推测其在不同的非生物胁迫和植物激素信号途径中发挥潜在"节点"作用.     

3种芸薹属植物ROH1基因的克隆及分析

[目的]通过PCR和RT-PCR技术从甘蓝、白菜和萝卜中扩增ROH1基因序列,分析该基因的基本特性。[方法]采用生物信息学的相关方法进行分析。[结果]甘蓝、白菜、萝卜ROH1基因没有内含子,甘蓝ROH1基因编码398个氨基酸,白菜和萝卜ROH1基因均编码400个氨基酸,3种植物的ROH1蛋白序列与拟南芥已经公布的ROH1(At1g63930)蛋白氨基酸缺少一段连续的氨基酸序列;ROH1属于DUF793蛋白超家族,它没有跨膜结构域和信号肽,二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成。同源比对及功能联想分析发现植物中ROH1非常保守,系统发育分析表明甘蓝、白菜和萝卜的关系最近;结构功能分析发现ROH1可能与BYPASS蛋白和AT4G11300蛋白的功能相似。[结论]为研究DUF793蛋白超家族功能提供参考。     

甘蓝脂质转运蛋白基因BoLTP的克隆与表达分析

[目的]克隆甘蓝脂质转运蛋白基因(BoLTP)的cDNA及DNA片段,为进一步研究其生物学功能奠定基础.[方法]根据NCBI数据库中脂质转运蛋白基因的信息,克隆甘蓝不同组织BoL TP基因,对其核酸序列及预测蛋白进行生物信息学分析;检测甘蓝多种组织中BoLTP的表达情况.[结果]克隆获得甘蓝BoL TP的cDNA序列为720 bp,无内含子,编码102个氨基酸.生物信息学分析发现,甘蓝BoLTP具有脂质转运蛋白家族共有特征,具有显著的疏水区,并存在信号肽结构域、AAI结构域.RT-PCR检测结果表明,BoL TP主要在甘蓝雄蕊中表达,在雌蕊、萼片、花瓣、花茎及叶片中均无表达.[结论]甘蓝BoLTP基因可能与甘蓝雄蕊中花粉的发育相关.     

甘蓝型油菜ADC基因片段的克隆及序列分析

[目的]克隆甘蓝型油菜精氨酸脱羧酶(ADC)基因的cDNA片段,为进一步获得ADC基因全长及研究其的生物学功能奠定基础.[方法]以甘蓝型油菜(Brassica napus L.)品种中双6号的花蕾为材料,设计简并引物,采用同源克隆法扩增ADC基因的cDNA片段.[结果]成功扩增获得8个不同的ADC基因拷贝,按长度将其分为1011、999、981 bp 3类,8个拷贝核苷酸序列之间的同源性为81%~99%,其推导氨基酸序列之间的同源性为86%~99%.1011 bp片段包含3种不同的序列S1 ~S3,序列间存在9个单核苷酸多态性(SNP)位点.999 bp序列包含S4和S5,具有3个SNP位点,两个区段出现连续碱基缺失.981 bp序列包含S6~S8,发现14个SNP位点,且第67位核苷酸出现无义突变,4个区段发生碱基缺失.序列S4~S8共同缺失第632~634、642~650位的核苷酸小片段.氨基酸同源比对和系统进化分析结果表明,8个不同ADC基因拷贝与芥菜(Brassica juncea L.)、拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)、盐芥(Thellungiella halophila L.)等物种的ADC基因同源性高,亲缘关系近.[结论]所获得的8个基因拷贝即为来自于甘蓝型油菜ADC基因的片段.     

山葡萄北冰红VvCOR413-I1基因克隆及生物信息学分析

[目的]从山葡萄北冰红中克隆耐寒基因COR413,并对其功能进行生物信息学分析。[方法]利用RT-PCR法克隆山葡萄北冰红基因COR413,并利用生物信息学对其进行分析。[结果]它包括630 bp完整的开放阅读框,推测编码210个氨基酸,蛋白的分子量(MW)为59.18 k D,等电点(p I)值为10.74。其蛋白结构以α-螺旋、延伸链为主,其次为无规则卷曲,β-转角所占比例最少,含有4个跨膜结构域。多重序列比对表明VvCOR413-I1与其他植物COR413的氨基酸序列相似性为63.00%~68.33%。[结论]该研究为深入了解VvCOR413-I1功能奠定了基础。     

侧金盏花CBF转录激活因子基因片段的克隆

[目的]探索CBF转录激活因子基因在侧金盏花中是否存在。[方法]以侧金盏花基因组DNA为模板,根据拟南芥CBF基因序列的保守区设计1对特异性引物,通过PCR扩增获得1个DNA片段,将其克隆到pUCm-T载体中,转化大肠杆菌TG1,筛选阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]测序结果显示通过PCR扩增获得的基因片段长448 bp。在GenBank中检索,该序列与从拟南芥和其他作物中克隆的CBF同源基因序列同源性较低,说明是一个新的基因片段,初步认定该片段是侧金盏花CBF基因片段。[结论]该研究为进一步克隆侧金盏花CBF转录激活因子基因全长序列、鉴定其生物学意义奠定了基础。     

甘蓝型油菜生物节律钟输出基因BnGI的克隆和表达分析

利用同源克隆的方法,以拟南芥GIGANTEA基因为种子序列,在甘蓝型油菜中克隆得到GI基因,命名为BnGI。序列分析结果表明:该基因编码区全长为3 516bp,编码1 171个氨基酸,与白菜GI基因序列同源性达99%,与拟南芥GI基因同源性达87%。成熟蛋白的等电点为6.59,分子量为127.15kDa,亚细胞定位预测在细胞核定位。荧光半定量检测结果表明:BnGI基因在根、茎、顶端分生组织、叶、花等中均有表达,但表达水平具有组织特异性。     

大麻CBDA1基因的生物信息学分析

[目的]研究大麻二酚酸合成酶基因(CBDA1)编码的蛋白质序列所包含的生物学信息。[方法]利用生物信息学在线工具及软件分析大麻二酚酸合成酶(CBDAS)的理化性质、亲/疏水性、跨膜结构、信号肽、motif结构域及空间结构等。[结果]CBDAS由544个氨基酸组成,分子量为62 168.42,理论等电点为8.81,是一种稳定的亲水性分泌蛋白,N末端包含1个由28个氨基酸残基组成的信号肽,该蛋白的亚细胞定位在胞外。CBDAS属于氧化还原酶家族,FDA是该酶活性的必需辅因子,CBDAS蛋白中只含有1个低复杂度区域,含有23个磷酸化位点和6个N-糖基化位点,其二级结构主要由α-螺旋、β-转角和无规卷曲组成,三级结构与四氢大麻酚酸合成酶(THCAS)同源性最高。[结论]该研究结果可为今后深入研究CBDAS蛋白的结构特征和功能提供理论参考。     

不同生态型拟南芥FLC基因的序列分析

[目的]对拟南芥春化作用相关基因FLC的序列分析。[方法]先期经过对拟南芥自然群体的春化反应的QTL分析,发现拟南芥5号染色体上有一个与开花有关的QTL,本实验就是运用序列分析确定它与FLC基因是否具有同源性。[结果]意大利拟南芥与瑞典拟南芥在第27位、第461位、第501位、第638位、第738位、第884位碱基上不同。虽然这些碱基有所不同,但是密码子编码出来的第9个氨基酸、第167个氨基酸、第246个氨基酸,由于密码子的简并性,编码的蛋白质均相同。[结论]拟南芥具有丰富的遗传多样性,其FLC基因序列长度高度保守、碱基变异位点丰富密码子的简并性它们均编码同一种氨基酸对拟南芥生长没有影响。这表明拟南芥的基因序列会受到环境的影响。     

蕨麻猪生长激素基因的克隆及多态性分析

[目的]探索蕨麻猪生长激素基因与其生理学和生物学特性的关系。[方法]从蕨麻猪血液细胞中提取基因组DNA,通过PCR技术扩增出蕨麻猪生长激素基因序列,进行碱基组成多态性和突变分析。[结果]蕨麻猪生长激素（pGH）基因序列全长1671bp,有5个外显子和4个内含子。外显子1、2、3、4和5的碱基数依次是10、161、117、162和201bp,内含子1、2、3和4的碱基数分别是244、210、192和277bp。除第1外显子和第1内含子碱基剪切有明显的例外,其余全部符合GT-AG规则;蕨麻猪生长激素基因4种碱基含量依次为G〉C〉T〉A。（G＋C）含量和（A＋T）含量分别在62%和37%以上。蕨麻猪编码区第4外显子在＋1046位处A→G,为错义突变,其余均为同义突变。蕨麻猪生长激素基因编码的前体蛋白含216个氨基酸,成熟蛋白是由190个氨基酸残基组成的一个分泌性蛋白;二级结构中含有6个α螺旋结构,三级结构是结构松散的球状蛋白,含有6个α螺旋前区。[结论]为蕨麻猪生长激素基因序列的研究提供了参考依据和借鉴。     

甘蓝型油菜BnEIN3基因克隆及菌核病诱导表达

[目的]探讨甘蓝型油菜EIN3（BnEIN3）基因与菌核病抗性的关系。[方法]根据GenBank中已公布的拟南芥EIN-3基因的保守区及甘蓝型油菜EST序列,设计特异性引物,分别进行基因组PCR和RT-PCR扩增,克隆BnEIN3基因。对菌核病不同抗性的3个油菜品种中BnEIN3的表达进行荧光定量PCR检测分析。[结果]克隆得到1947bp的基因片段,与拟南芥EIN3一致性高达82%,有完整的开放阅码框,编码614个氨基酸,其中包含1个EIN3结构域,初步认定该片段为油菜BnEIN3基因。在高抗品种（D083）中,菌核病在侵染后期快速诱导BnEIN3上调表达,且显著高于中抗（中双9号）及高感品种（84039）中该基因的表达水平。在中抗及高感品种中,菌核病均抑制BnEIN3的表达,且中抗品种BnEIN3表达量一直大于高感品种。[结论]BnEIN3可能与油菜对菌核病抗性相关。     

蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段序列的测定及其系统发育分析

【目的】克隆蓝叶虫微孢子虫RPB1（RNA聚合酶II大亚基）基因片段,对其基因及编码的蛋白序列特征进行生物信息学分析,进一步明确蓝叶虫微孢子虫的分类学地位,为深入探究RPB1基因编码蛋白的具体生物学功能奠定基础。【方法】根据家蚕微孢子虫RPB1基因序列,采用Primer Premier 5.0软件设计6对同源引物,利用PCR技术克隆蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段;通过 GSDS、SMART、DNAstar、MEGA4.1等生物信息学分析软件对蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段进行系统发育分析。【结果】克隆得到了蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段序列,在GenBank登录号为KJ728831。该基因片段的长度为2 933 bp,包含一个长为2 922 bp的开放读码框,预测编码的蛋白质由974个氨基酸组成,蛋白分子量为109.38 kD,等电点为7.087。蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段结构为单外显子结构,编码的蛋白含有4个结构域：RPOLA_N、RNA_pol_Rpb1_4、RNA_pol_Rpb1_5和RNA_pol_Rpb1_6。其中,RPOLA_N结构域在原核和真核生物中都是非常重要的结构域。该蛋白质的二级结构主要由4种形式组成：α螺旋、无规则卷曲、延伸链和β转角。α-螺旋和无规则卷曲所占比例相当高,延伸链主要位于α-螺旋和无规则卷曲之间。N-末端以α-螺旋的形式存在。多序列比对与系统进化分析发现,蓝叶虫微孢子虫和Nosema bombycis、N. trichoplusiae、Nosema sp. CPP、N. fumiferanae、N. disstriae、N. tyriae、N. granulosis 7种Nosema属微孢子虫聚类在同一进化支。蓝叶虫微孢子虫RPB1基因编码的蛋白与同一进化支上的其他7种微孢子虫RPB1基因编码的蛋白相似度在81.9%-99.6%,分化度在0.004-0.049。蓝叶虫微孢子虫与N. bombycis的RPB1基因序列相似性高达99.6%,并与N. bombycis具有非常近的亲缘关系。【结论】成功克隆了蓝叶虫微孢子虫RPB1基因片段,对其系统进化分析进一步证实了蓝叶虫微孢子虫确实属于Nosema属。