巴什拜羊SPLUNC1基因的克隆与真核表达

为了克隆巴什拜羊SPLUNC1基因并表达该蛋白,本试验从巴什拜羊肺脏组织中提取总RNA,利用RTPCR方法扩增出SPLUNC1基因开放阅读框序列,将该基因片段插入到真核表达质粒pPIC9K中构建pPIC9K-SPLUNC1重组质粒,然后将pPIC9K-SPLUNC1重组质粒线性化并电击转化入毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导蛋白表达后用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定目的蛋白。结果表明,经RT-PCR扩增成功获得大小为748bp的SPLUNC1基因;构建的pPIC9K-SPLUNC1重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE及Western blotting检测鉴定结果表明获得大小为25.53ku的SPLUNC1蛋白。本试验结果为进一步研究巴什拜羊SPLUNC1蛋白的生物学活性奠定基础。     

巴什拜羊SPLUNC1基因的克隆与真核表达

为了克隆巴什拜羊SPLUNC1基因并表达该蛋白,本试验从巴什拜羊肺脏组织中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增出SPLUNC1基因开放阅读框序列,将该基因片段插入到真核表达质粒pPIC9K中构建pPIC9K-SPLUNC1重组质粒,然后将pPIC9K-SPLUNC1重组质粒线性化并电击转化入毕赤酵母GS115中,经甲醇诱导蛋白表达后用SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定目的蛋白。结果表明,经RT-PCR扩增成功获得大小为748 bp的SPLUNC1基因;构建的pPIC9K-SPLUNC1重组质粒经PCR、酶切及测序鉴定与预期结果一致;SDS-PAGE及Western blotting检测鉴定结果表明获得大小为25.53 ku的SPLUNC1蛋白。本试验结果为进一步研究巴什拜羊SPLUNC1蛋白的生物学活性奠定基础。     

禽传染性支气管炎病毒M基因在毕赤酵母中表达与蛋白反应活性检测

将禽传染性支气管炎病毒(IBV)M基因克隆到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K中,构建了重组表达载体pPIC9K-M,电击转化毕赤巴斯德酵母GS115,经MD和MM平板筛选和PCR鉴定后,采用G418抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株GS115/pPIC9K-M His~+Mut~+,重组菌株用1%的甲醇诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析.结果表明,IBV M基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的相对分子质量约为33 000,能与IBV阳性血清特异性结合.将表达蛋白初步纯化后作为包被抗原,ELISA检测结果显示表达蛋白与特异性抗体反应良好,表明表达的M蛋白生物学活性良好.本研究表达的IBV M蛋白可作为制备IB诊断抗原的基础材料,对IB的防治有重要理论和实用价值.     

猪髓样分化因子88在毕赤酵母中的表达和纯化

为了在毕赤酵母中表达猪髓样分化因子88因子．我们采用RT—PCR从猪肠系膜淋巴结组织中扩增MyD88全基因,并将其克隆到T载体中,测序验证。将目的基因编码序列插入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,构建重组质粒,并转化毕赤酵母。重组酵母以PCR验证,表达的重组蛋白用HisTrapTMHP柱纯化后用SDS—PAGE进行分析。结果：构建了重组表达质粒pPIC9K—pMyD88,诱导表达蛋白经纯化后SDS—PAGE分析显示,在相对分子质量（M）约34kD处出现1条特异性蛋白带．说明MyD88在毕赤酵母中获得表达。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在毕赤酵母中的分泌表达

为获得J亚群禽白血病病毒gp85蛋白,将gp85基因克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9K,构建了pPIC9K-gp85表达载体。将鉴定正确的表达载体经Sal Ⅰ酶切线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,经MD及G418抗性平板筛选后挑取阳性克隆进行PCR鉴定,获得重组酵母菌株GS115/pPIC9K-gp85。对阳性重组菌进行诱导表达,表达产物经SDS-PAGE、Western blotting和Dot-ELISA分析,结果表明,gp85基因在毕赤酵母中获得分泌表达,表达产物与J亚群禽白血病病毒多克隆抗体有良好的反应活性,分泌表达量达40 mg/L。本研究为J亚群禽白血病病毒诊断方法的建立及gp85蛋白的深入研究奠定了基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因的克隆及其在毕赤酵母中表达

用RT-PCR扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重庆分离株C14-2的ORF7基因(384 bp),构建克隆质粒pMD19-T-ORF7,经EcoR Ⅰ /Not Ⅰ双酶切回收ORF7基因插入酵母表达载体pPIC9K,构建了重组表达质粒pPIC9K-ORF7,进行PCR鉴定和双酶切鉴定.鉴定的pPIC9K-ORF7经Sac Ⅰ线性化后电转化毕赤酵母宿主菌GS115,筛选获得阳性重组菌GS115(pPIC9K-ORF7),再经G-418/YPD筛选获得高拷贝重组菌,重组子经表型鉴定为Mut.重组菌GS115(pPIC9K-ORF7)经甲醇诱导表达,在96 h表达的N蛋白量最大,N蛋白经SDS-PAGE鉴定大小约为15 000;Western blot表明N蛋白能与美洲型PRRSV阳性血清发生特异性反应,具有良好的反应活性.本研究为开展PRRSV ORF7基因在毕赤酵母中表达及应用奠定基础.     

鸡抗病毒Mx蛋白基因在毕赤酵母GS115中的表达

为了利用酵母表达技术制备鸡抗病毒Mx蛋白,试验采用基因工程技术,将编码鸡抗病毒Mx蛋白基因亚克隆至含有分泌信号肽序列的毕赤酵母表达载体中,构建成分泌型重组表达载体pPIC9K-Mx;用电转化法将线性化的pPIC9K-Mx转化至毕赤酵母菌株GS115中,G418梯度筛选转化菌;再经MM与MD平板对比生长试验筛选,PCR鉴定目的片段,筛选出高拷贝重组子,该高拷贝菌株分别经0.5%、1%甲醇诱导,表达产物再经SDS-PAGE检测。结果表明:成功构建了鸡抗病毒Mx蛋白基因的毕赤酵母表达载体,经G418抗性筛选得到高拷贝菌株;在甲醇含量维持在1%时,鸡抗病毒Mx蛋白在毕赤酵母GS115中获得良好表达,表达产物大小约为75ku;表达蛋白约占表达上清液的39.2%。     

猪IL-2基因在毕赤酵母中的高效表达及生物活性分析

本研究根据密码子偏爱原则设计猪IL-2引物,克隆其基因后构建pPIC9k-IL-2重组表达载体,线性化后电转化毕赤酵母GS115,获得优化密码子的重组酵母转化子;再用G418抗性梯度法筛选得到多拷贝重组菌株,不同条件下进行甲醇诱导表达。结果表明:经PCR鉴定IL-2基因已整合到酵母基因组中。表达产物经SDS-PAGE电泳分析发现相对分子质量为16、20ku两条目的蛋白表达带,脱糖基化分析表明目的蛋白得到了适度的糖基化修饰,Western blotting分析显示表达的蛋白具有良好的免疫反应性,分子筛纯化可以获得纯度为95%的蛋白质,淋巴细胞增殖活性分析表明所得的蛋白质具有促淋巴细胞增殖的活性。毕赤酵母表达系统可以高效地表达具有生物活性的重组猪IL-2蛋白分子。     

柔嫩艾美耳球虫真核起始因子3d基因的酵母表达分析

在毕赤酵母真核表达系统中表达柔嫩艾美耳球虫真核起始因子3d(Emeria tenella eukaryotic initiation factor 3d,EteIF3d)基因,并获得具有天然构象的活性蛋白。将EteIF3d基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9k上,将构建正确的重组质粒通过电激转化入酵母细胞GS115,用组氨酸缺陷培养基和G418分别进行筛选,获得含重组质粒的酵母表达细胞。在含1%甲醇的BMMY培养基中诱导培养,收集1~3 d的表达上清。表达产物进行SDS-PAGE检测,并用Western blot进行免疫学分析。结果表明,本研究成功构建了重组质粒pPIC9k-EteIF3d,并成功表达该蛋白,且该蛋白能与兔抗EteIF3d血清特异性结合,具有良好的抗原性。EteIF3d基因可在真核表达系统毕赤酵母中表达,且获得蛋白具有抗原性,从而为进一步研究该蛋白的结构和功能奠定了基础。     

猪带绦虫未知基因SLC10在毕赤酵母中的表达

SLC10是以反式剪切引导序列为基础,通过RT-PCR从猪囊尾蚴中克隆到的一个未知基因。将猪囊尾蚴SLC10基因从重组克隆载体pGEM-SLC10扩增并酶切后,与相应酶切处理的毕赤酵母分泌性表达载体pPIC9K相连接,构建重组表达载体pPIC9K-SLC10,转化大肠杆菌JM109,经PCR、酶切和测序鉴定,基因序列完全正确。纯化的重组质粒pPIC9K—SLC10用内切酶Sac I线性化,电转化毕赤酵母,使重组表达载体与酵母染色体发生同源整合;采用G418抗性梯度法筛选多拷贝重组菌株,用甲醇进行诱导表达;通过SDS-PAGE和Western—blot分析表达产物,结果表明目的蛋白得到了表达,但不具有免疫反应性。     

猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2 基因的真核表达及表达产物的抗菌活性研究

为获得猪蛔虫抗菌肽Cecropin P2基因并研究其抗菌功能,根据CecropinP2成熟肽的编码基因,人工合成3条寡聚核苷酸片段,经PCR获取Cecropin P2基因序列,成功构建了重组表达质粒pPIC9 K-Cecropin P2-His6并转化毕赤酵母GS115感受态细胞。转化子经MD、MM以及G418筛选,1%甲醇诱导表达,利用Tris tricine-SDS-PAGE对表达产物进行检测。体外抑菌试验表明,获得的重组蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有较好的抑菌活性。本试验为抗菌肽的应用和新抗菌肽类药物的开发提供了必要的试验基础。     

禽传染性支气管炎病毒S1基因毕赤酵母表达载体的构建

本试验根据已公布的IBV株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列，去掉由18个氨基酸构成的信号肽后，设计一对IBV S1基因表达片段的PCR引物，利用RT—PCR扩增得到了IBV四川分离株的S1基因片段，将该片段克隆到PMD18-T载体上，通过对所得到的重组质粒进行酶切分析、菌落PCR鉴定，证明得到了含有目的基因片段的阳性重组质粒，测序分析片段长为1566bp，已经成功切除了由18个氨基酸构成的信号肽序列。将该基因亚克隆到毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K的SnaBⅠ和NotⅠ酶切位点，并通过菌落PCR、双酶切鉴定了该重组质粒的正确性，IBV S1基因毕赤酵母表达载体的构建为进一步利用毕赤酵母表达IBV S1蛋白提供了基础材料，并对表达产物的免疫原性和禽传染性支气管炎基因亚单位疫苗及特异性诊断抗原的研究打下了基础。     

土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫（Orientobilharzia turkestanicum）成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因（TPI），鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接，构建重组表达质粒pPIC9k-TPI，并将其电击转化到毕赤酵母GS115中，重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白，经SDS-PAGE、Western-blotting检测，并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示，成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。     

Expression,Purification and Biological Activity Identification of Chicken Growth Hormone in Pichia pastoris

The growth hormone（GH）regulated diverse functions of the target cells through binding its receptor and played important roles in the process of metabolism of the body's growth and development.In order to obtain high purity chicken growth hormone（cGH）with biological activity,the gene segment of the mature cGH with six histidine at the C terminus was cloned into the expression vector pPIC9K.The recombinant plasmid（pPIC9K-cGH）was transformed to Pichia pastoris（GS115）by electroporation to construct the recombinant Pichia pastoris（GS115-pPIC9K-cGH).The GS115-pPIC9K-cGH secreted the recombinant protein（cGH）whose molecular weight was about 25 ku induced by 1% methanol induction for 96 h.The purity of cGH attained at least 95% through using Ni affinity chromatography and polyacrylamide glucan gel chromatography to purify the recombinant protein.The results of Real-time quantitative-PCR showed that the purified cGH recombinant proteins could up-regulate its target gene insulin-like growth factor Ⅰ（IGF-Ⅰ）mRNA in chicken liver cancer cell（LMH).It certified that the recombinant cGH protein had biological activity.This study laid a foundation for research of the structure,function and application of cGH.     

新型欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin在毕赤酵母中的表达

前期采用差减杂交的方法筛选到新型欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin,其基因全长为477 bp,编码159个氨基酸,理论分子量约17.4 kDa。为了获得具活性的大量表达的抗菌肽,本研究利用毕赤酵母表达了elecilin。首先将elecilin基因克隆至酵母分泌表达载体pPICZaA,构建了重组分泌表达质粒pPICZaA-elecilin,电击转化毕赤酵母X-33。经Zeocin筛选和PCR鉴定,获得重组酵母菌,通过甲醇诱导,SDS-PAGE和Western blot鉴定,证实诱导后的培养基中存在与预期分子量大小相一致的蛋白,能被His-tag单克隆抗体识别,表明利用酵母成功表达了欧洲鳗鲡抗菌肽elecilin。这为进一步研究该抗菌肽的功能及作为饲料添加剂的应用奠定了基础。     

抗菌肽SMAP-29基因密码子优化及其毕赤酵母表达载体构建

以GenBank发表的绵羊骨髓抗菌肽(SMAP-29)基因(L46854)为模板,选择毕赤酵母偏好密码子,合成SMAP-29成熟肽基因。将合成的基因克隆入pPIC 3.5K载体中构建重组酵母胞内表达载体pPIC 3.5K-SMAP-29,经酶切分析、PCR和测序鉴定证明载体构建成功。表达载体的正确构建为SMAP-29的高效表达和生物学活性研究奠定基础。     

鸡生长激素在毕赤酵母中的表达、纯化和活性鉴定

生长激素（growth hormone,GH）与受体结合调节靶细胞的功能在机体的生长发育及代谢过程中起着极其重要的作用。为获得高纯度具有生物学活性的鸡生长激素（chicken growth hormone,cGH）,试验将C端融合了6个组氨酸的cGH成熟片段基因序列克隆入毕赤酵母表达载体pPIC9K中,使用电转法将重组质粒导入毕赤酵母GS115,以1%的甲醇诱导重组菌（GS115-pPIC9K-cGH）96 h,表达大小约为25 ku的目的蛋白cGH,经Ni离子亲和层析和聚丙烯酰胺葡聚糖凝胶层析获得95%以上的cGH重组蛋白。实时荧光定量检测结果表明,纯化的cGH重组蛋白可刺激鸡肝癌细胞LMH内的胰岛素样生长因子Ⅰ（insulin-like growth factor Ⅰ,IGF-Ⅰ）基因的mRNA表达上调,表明所发酵纯化的重组蛋白cGH具有生物学活性,这为其结构和功能的研究及生产应用奠定了基础。     

绵羊生殖道抗菌肽cDNA克隆及真核表达载体构建

绵羊生殖道抗菌肽（ORTAP40）是从中国美利奴绵羊生殖道分离的一种新型的阳离子抗菌肽,在绵羊发育早期的防御中起到了主要的作用。在本研究中,根据ORTAP40 N端氨基酸序列设计引物,利用3′RACE技术克隆了绵羊生殖道抗菌肽3′末端全长cDNA序列,并被GenBank收录,登录号为FJ514476,经过cDNA序列分析显示,ORTAP40是一个4.8 ku的小肽,与先期分离纯化的分子质量一致。作者随后参照巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）密码子偏好性,设计并人工合成了ORTAP40成熟肽目的基因片段,所合成的ORTAP40基因全长120 bp,通过基因重组的方法将目的基因克隆到pPIC3.5K和pPICZαA表达载体上,成功构建了重组酵母胞内表达载体pPIC3.5K-ORTAP40和外泌表达载体pPICZαA-ORTAP40,为抗菌肽的开发和应用奠定了基础。     

鸡β干扰素在毕赤酵母中的分泌表达及其抗病毒活性测定

为研究鸡β干扰素（chicken interferon-β,ChIFNβ）蛋白在毕赤酵母中的表达及其抗病毒活性,将克隆的ChIFNβ基因亚克隆至酵母表达载体pPICZα-A中,构建重组质粒pPIC-ChIFNβ。将鉴定正确的质粒pPIC-ChIFNβ线性化,通过电转化整合到毕赤酵母菌株X-33基因组中,得到阳性菌株。经1.0%甲醇连续诱导4 d,表达产物利用SDS-PAGE电泳、细胞病变抑制法等进行分析。ChIFNβ在酵母中获得了分泌型表达,表达产物分子质量约为17 ku。表达产物以细胞病变抑制法检测其活性,效价为10^7.5 U/mL;在鸡胚中能有效抑制禽流感病毒H9N2的增殖。动物攻毒保护试验结果显示,表达的蛋白可提供70%的免疫保护。表达的ChIFNβ蛋白具有较好的抗病毒活性,本研究可为ChIFNβ的应用提供重要参考。