蓖麻 PIP5K1 基因克隆、生物信息学及功能分析

蓖麻 PIP5K1 基因在植物生长发育和抗逆过程中起重要作用。为探究蓖麻 PIP5K1 基因在蓖麻物种中的生物学功能和不同时期雌性植株中的表达情况,以 aLmAB2 品系的蓖麻花序为试验材料,克隆 PIP5K1 基因,对该基因编码的蛋白质进行生物信息学分析,并对 PIP5K1 基因在不同时期雌性系植株的表达模式进行分析。结果表明：从蓖麻花序轴顶端将总 RNA提取出来,并将其反转录成 cDNA,克隆后得到一个全长为 2325bp 的 PIP5K1 基因片段,经测序后比对这一基因序列和 NCBI参考基因序列相同。对该基因所编码蛋白展开生物信息学分析,确定 PIP5K1 基因所编码蛋白质的氨基酸等电点为 8.85,氨基酸数目为 774,分子量大小为 87967.37Da,是一种亲水性稳定蛋白;无跨膜螺旋区,属于非跨膜蛋白;蛋白质二级结构由 α 螺旋、β 转角、伸展链及无规卷曲构成;三级结构与二级结构预测结果一致;与同属于大戟科的木薯亲缘关系较近,与其他科亲缘关系较远。qRT-PCR 分析表明,PIP5K1 在标雌系、单雌系、两性系花序中均有不同程度的上调和下调,推测 PIP5K1 基因参与蓖麻花序发育的调控。本研究为探究 PIP5K1 基因促进蓖麻植株的生长发育机制奠定了理论基础。     

水稻eIF3g亚基编码基因的克隆及植物表达载体构建

真核生物起始因子(e IF)种类多且复杂,广泛参与真核生物翻译起始进程,并在植物生长发育调控过程中发挥重要的功能。本研究前期通过酵母双杂交从水稻cDNA文库筛选到一个可能调控根系生长发育的起始因子,CDS全长为828 bp,该基因编码水稻eIF3g亚基,命名为OseIF3g1。利用RT-PCR技术进行克隆,将该基因全长CDS通过BamHⅠ和SmaⅠ酶切位点连接至植物表达载体pBI121,经双酶切验证后确认已成功构建转基因过表达载体,为该基因后续的遗传转化及相关功能研究提供基础。     

蓖麻RcDELLA基因的克隆及序列分析

DELLA家族蛋白是植物GA信号途径的重要阻遏蛋白,能抑制植物的生长和发育,使植株产生矮化的表型。为了明确DELLA基因在蓖麻中的作用和功能,对RcDELLA基因进行生物学信息分析。以蓖麻2129六叶期茎尖的cDNA为模板,根据NCBI公布的DELLA(XM_002533984.2)蛋白基因片段设计引物,克隆该基因,并对其进行生物信息学分析。克隆得到该基因的完整阅读框,该基因编码序列全长为1 701 bp,编码567个氨基酸,推测其分子量为62 550.40 ku,等电点为5.14。二级结构预测表明α-螺旋占40.4%,β-折叠占8.6%,无规则卷曲占51.0%。系统进化树结果表明,RcDELLA先与大戟科巴西橡胶树和麻疯树形成分支。通过PCR扩增得到了RcDELLA基因的完整阅读框,同源性比对结果显示,RcDELLA具有典型的DELLA结构域,与NCBI上公布的其他植物的DELLA蛋白序列具有高度的同源性。系统进化树结果显示,与麻疯树亲缘关系最近,符合进化关系。生物信息学分析将为进一步研究DELLA基因在蓖麻矮化过程中的作用和功能奠定理论基础。     

转基因烟草中半胱氨酸跨膜基因CYS生物信息学分析

在烟草中过量表达MYB转录因子LrAN2,能够激活上调花青素生物合成代谢通路,但富含半胱氨酸跨膜结构域蛋白A (CYS)的表达量明显降低。作为植物中一种重要的生物氨基酸,CYS的生物学研究鲜有报道。本研究克隆烟草的CYS基因,其全长为282 bp,编码氨基酸数94个。预测编码的蛋白分子量和等电点分别为24 019.84 Da和5.23,并且序列中没有保守区。实验结果显示该蛋白具有亲水性,主要由α-螺旋(19.35%)和无规则卷曲(65.59%)构成,CYS蛋白质不通过跨膜区,在膜外进行作用。系统发育树显示,烟草CYS基因与辣椒CYS基因亲缘关系最近,其次是番茄的HTC基因和WIH2基因。本研究结果克隆并分析CYS基因编码区序列,为CYS基因的功能研究提供参考依据。     

蓖麻GRF转录因子家族生物信息学鉴定及表达分析

GRF是植物特有的转录因子,主要参与调控植物生长发育过程.本研究利用生物信息方法对蓖麻GRF (RcGRF)基因进行全基因组鉴定,并对其理化性质、基因结构、保守结构域、系统发育、组织表达分析以及外源赤霉素(GA)和多效唑(PAC)处理两个蓖麻品种(高杆'滇蓖2号'和矮杆'滇蓖5号')后顶端嫩茎转录组测序分析.结果 表明,蓖麻共有9个GRF转录因子,蛋白长度233～617 aa,等电点(pI)为6.34～9.48,每个成员含有2～4个内含子,每个RcGRF的蛋白结构域均包括一个由39～43个氨基酸组成的WRC保守结构域和一个由34个氨基酸组成QLQ保守结构域.系统发育分析表明蓖麻与拟南芥GRF的亲缘关系比水稻更近.不同组织表达结果表明多数RcGRF基因在发育的胚乳及萌发的种子中高表达,而RcGRF2在叶片、雄花和萌发的种子中都不表达.GA和PAC处理转录组测序结果显示GA处理DB2 RcGRF1、DB2 Rc GRF17下调表达,GA处理DB5 RcGRF1、DB5 RcGRF4下调表达,PAC处理DB2 RcGRF4、DB2 RcGRF6上调表达、RcGRF9下调表达,表明RcGRF1、RcGRF4、RcGRF7、RcGRF9可能通过赤霉素途径调节植物株型.本研究为蓖麻GRF基因对生长发育调控机理研究奠定分子基础,为调控蓖麻株高相关基因的研究提供科学依据.     

蓖麻AP2/ERF转录因子家族的生物信息学分析

AP2/ERF家族是一种广泛存在于植物体内的重要转录因子,该转录因子大多数参与植物的生长发育、生理代谢以及抵抗非生物胁迫的过程。本研究利用蓖麻基因组数据库寻找到了113个蓖麻AP2/ERF家族基因,利用生物信息学方法对这113个蛋白序列构建无根进化树,且对氨基酸组成成分进行分析,发现组成蛋白质的氨基酸数目在不同亚族之间差异较大,其中AP2亚族的平均氨基酸数目为个439,亚族中最小的平均氨基酸数目为ERF亚族,平均为255个。在蓖麻的113个蛋白序列中大部分为稳定的亲水性蛋白、且含有多个磷酸化位点、在该蛋白中α—螺旋和无规则卷曲是主要的二级结构方式,除AP2亚族外,其余亚族均含有β—转角,亚族无规则卷曲均占50%以上,说明延伸链和(β—转角则分散在整个氨基酸链中。三级结构与二级结构预测一致。还对保守结构域、蛋白无序化特性等进行了预测和较为全面的分析。这些分析结果为进一步研究蓖麻中AP2/ERF转录因子对生长发育过程中的作用提供了理论依据。     

蓖麻NAC转录因子家族的鉴定及生物信息学分析

NAC蛋白是植物特有的转录因子大家族,作用于植物生长发育和逆境胁迫响应,本研究基于蓖麻全基因组数据,利用生物信息学分析方法对蓖麻NAC转录因子家族成员、系统发育、编码蛋白的结构和理化性质进行分析。蓖麻NAC转录因子家族包括91个成员,分为14个亚族,其中蓖麻NAC转录因子Ⅻ亚族和Ⅻ亚族为蓖麻特有NAC蛋白;基因结构分析显示内含子数量为2~5个,Ⅻ亚族中12个成员缺少内含子;蛋白结构域分析显示Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四个亚族蛋白质序列5个结构域(Motif)保守性较强,motif 2几乎存在所有蓖麻NAC蛋白中;与拟南芥105个NAC成员构建系统发育进化树,蓖麻58个NAC蛋白分别聚类到38个OGs,NAC转录因子的40个OGs中蓖麻缺少OG3b和OG7f;理化性质和结构分析显示蓖麻NAC蛋白质绝大多数是亲水氨基酸,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构大部分相似。蓖麻具有很强的抗逆境胁迫能力,本研究为蓖麻耐性相关的NAC转录因子调控机理研究提供了科学依据。     

植物抗病毒侵染的分子机制

植物病毒病是一类严重危害农作物生产的重要病害。已报道的植物抗病毒基因主要在抑制病毒增殖和阻止病毒扩散中起作用。病毒的复制涉及自身的编码蛋白及其与寄主蛋白间的互作, 参与病毒复制的寄主蛋白很多, 如真核翻译起始因子eIF4E和eIF4G, 植物的内膜系统等, 相关蛋白的功能丧失或构型改变可阻滞病毒的复制;此外, 植物细胞内的硫氧还蛋白可调节细胞的氧化还原状态, 进而阻断病毒的增殖。病毒在植物体内的扩散包括胞间移动和长距离迁移, 植物抗病蛋白(R蛋白)通过识别病毒的无毒因子(Avr)促发防御反应, 诱导过敏性坏死, 限制病毒在细胞间的扩散, 编码这类抗病蛋白的基因主要为TIR-NBS-LRR和CC-NBS-LRR。病毒的长距离迁移涉及的因素很多, 目前仅发现韧皮部的RTM蛋白可能以多聚蛋白的形式抵制病毒的长距离移动。另外, RNA沉默也是植物抵制病毒侵染的免疫反应机制。本文旨在综述植物的各种抗病毒机制和相关的抗病基因, 并探讨分子标记辅助选择(marker-assisted selection, MAS), 定向诱导基因组局部突变(targeting induced local lesions in genomes, TILLING)和转基因等生物技术在抗病改良中的应用前景。     

蓖麻GST的基因克隆及生物信息学分析

谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)是谷胱甘肽结合反应的关键酶,催化谷胱甘肽结合反应的起始步骤,主要存在于胞液中,有多种形式,其在病理学上有一定的重要性。本研究通过克隆GST基因以及对其进行相关的生物信息学分析。利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增该基因,经分析该基因可编码219个氨基酸,并且通过相关分析得到这219个氨基酸组成的蛋白为稳定的亲水性蛋白,有一个明显的区段存在信号肽,在该蛋白中α-螺旋和无规则卷曲是主要的二级结构方式,根据序列同源比对,蓖麻、麻疯树和榴莲聚类到一起,说明相对于其他物种,它们的同源性较高。这些分析结果为蓖麻谷胱甘肽S-转移酶生物合成及其功能的进一步研究提供一定的理论与实践依据。     

北方旱地红小豆DREB2A基因克隆及表达分析

脱水响应元件结合蛋白(DREB)转录因子在植物干旱和热胁迫应激调控中具有重要功能。为提高红小豆在北方干旱缺水条件下的产量,本研究以拟南芥DREB2A基因序列为依据,从红小豆基因组数据库中鉴定出了1个DREB2A的同源基因(Vigna angularis,登录号为XP_017429189.1)。经基因表达分析,结果表明:此基因为拟南芥DREB2A的直系同源基因,编码的蛋白不具有信号肽的作用,二级结构主要以无规则卷曲为主,而且含有多种逆境性转录因子。通过物种间系统进化树分析发现,该基因与红小豆DREB2A亲缘关系近的植物是沙冬青。荧光定量PCR技术分析结果表明,在红小豆非生物胁迫的调控中红小豆DREB2A也起到重要作用。本研究为阐释红小豆抗逆分子机制提供理论基础。     

盐藻DsMAPKKK基因的克隆与生物信息学分析

为了阐明MAPKs级联反应在盐藻耐盐机制中发挥的作用,需要克隆MAPKs信号转导途径中的成员之一MAPKKK基因并研究其功能。采用RT-PCR与RACE技术从盐藻中首次克隆到一个盐藻MAPKK激酶基因,将其命名为DsMAPKKK (GenBank Accession No.KF366904)并进行了生物信息学分析。结果表明,DsMAPKKK基因的cDNA全长为1460 bp,开放阅读框为879 bp,编码292个氨基酸;该蛋白无信号肽,无跨膜域,是定位于细胞质基质的亲水性不稳定蛋白质;蛋白质序列中包含一个24—45位的蛋白激酶ATP结合区和一个137—149位的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶活性区;发现了多个潜在的磷酸化位点和一个重要的催化活性位点Asp141;蛋白质二级结构的主要组成元件为α -螺旋和自由卷曲;成功构建了蛋白质三级结构立体模型;系统进化分析表明该蛋白质与团藻、衣藻的相应蛋白进化关系最近。     

基于转录组测序的苦瓜热激蛋白相关基因分析

为获得苦瓜叶片高温胁迫状态下表达的相关基因,本研究以高温胁迫下苦瓜叶片为实验材料,采用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术对正常温度(26℃)和高温胁迫(38℃)下苦瓜叶片转录测序后进行组装,再利用KEGG、Pfam、Swiss-Prot和NR数据库平台对热激蛋白的相关功能基因筛选,共获得24个热激蛋白相关基因,包括得20个热激蛋白基因、2个位于叶绿体中的小热激蛋白以及2个热激转录因子。聚类分析研究表明,涉及到热激蛋白相关的20个Unigene广泛分布于3大类中,其中c42567和c43094这两个亲缘关系最近;两个小热激蛋白c42963和c12133的亲缘关系次之;c35683和c3040两个热激转录因子亲缘关系最远。通过本次研究中获取的24个热激蛋白相关Unigene信息,有助于深入研究苦瓜耐高温胁迫机理等提供数据信息。     

甘薯Sporamin基因家族的结构特征及系统进化分析

Sporamin基因编码的特异贮存蛋白约占甘薯块根中蛋白总量的80%,是甘薯作物特性的重要氨基酸来源。Sporamin基因与编码KTI(Kunitz-type trypsin inhibitors)型大豆胰蛋白酶抑制剂的基因具有同源性,其蛋白产物具有胰蛋白酶抑制活性和肿瘤抑制活性。本研究鉴定了甘薯基因组中的Sporamin基因,预测并分析其在基因结构上的特征,并将此结构特征与Sporamin基因系统进化关联分析。研究鉴定发现普通甘薯(6X)具有极少的Sporamin基因,这可能是单倍型拼接的冗余或错误导致。全基因组加倍及共线性的关联分析发现,WGT和串联重复是Sporamin基因大量扩增的最主要因素,同时依赖基因丢失进行遗传资源的平衡控制。系统进化分析揭示了不同甘薯Sporamin基因的亲缘关系及进化速率差异,还发现较少比例的WGT重复基因可能导致Sporamin基因进化速率的加快。特异性基因表达分析发现部分持续高表达的Sporamin基因,蛋白互作分析发现部分Sporamin蛋白的可能作用通路。研究为甘薯Sporamin基因在分子生物学、遗传改良等领域的后续研究提供了数据材料,具有重要的参考价值与指导意义。     

茎点枯病菌诱导下芝麻内参基因的筛选

用CodeHop方法设计简并引物克隆得到了GAPDH、β-actin、α-tubulin、UBQ5、RPL4、eIF4A和eEF1α 7个看家基因的部分序列,将这7个基因和GenBank中已公布的18S rRNA、NADHD 2个基因共9个基因作为候选内参基因,利用实时荧光定量PCR技术,分析其在茎点枯病菌诱导下芝麻中的表达稳定性。经BestKeeper、NormFinder和GeNorm软件分析可知,UBQ5、eIF4A、α-tubulin 3个基因表达均较稳定,eEF1α变化最大。当使用多基因作为内参基因时,选择这3个最稳定的候选内参基因即可准确矫正定量结果。     

小麦(Triticum aestivum)蔗糖关键合成酶基因TaSPP2克隆与结构分析

磷酸蔗糖磷酸化酶(sucrose phosphate phosphatase,SPP)是蔗糖合成最后步骤的关键酶,在参与小麦(Triticum aestivum)蔗糖代谢转运和籽粒灌浆中起重要作用。为了在基因组DNA水平上揭示小麦SPP酶基因的结构特征,预测该基因所编码蛋白特性,本研究通过克隆小麦SPP酶全长基因,利用生物信息学方法,从基因结构、理化特性、进化关系、亚细胞定位、跨膜结构和二级结构等方面对该基因进行了预测和分析。结果表明:通过克隆、测序和拼接,获得小麦磷酸蔗糖磷酸化酶基因(TaSPP2),该基因全长2865 bp,包含8个外显子区和7个内含子区,被定位在小麦D基因组上。TaSPP2与粗山羊草(Aegilops tauschii)亲缘关系最近。该基因编码的蛋白分子量为47.19 kD,等电点为6.04,含有38处磷酸化位点,不含跨膜区,属于非分泌型亲水胞内蛋白。二级结构以无规则卷曲为主(45.02%),其次是α-螺旋占和延长链,无β-转角。本研究结果将为进一步验证和解析小麦TaSPP2基因的功能提供理论依据。     

木薯(Manihot esculenta)AKT1基因的克隆及生物信息学分析

植物细胞中的K^+通道蛋白AKT1(Arabidopsis K^+transpoter 1)主要负责吸收K^+。本研究基于木薯基因组数据库信息,利用PCR技术从木薯中克隆一个MeAKT1基因,该基因全长2634 bp,编码877个氨基酸,生物信息学分析表明MeAKT1含有10个外显子和9个内含子,编码的氨基酸分子量为99.02 kD,等电点为8.43,属于稳定蛋白。MeAKT1包含有5个跨膜区域,N端含有1个Ion_trans结构域,C端有1个KHA结构域,其二级结构以α-螺旋和无规则卷曲为主,进化树分析发现MeAKT1与蓖麻RcAKT1的亲缘关系最近。通过对MeAKT1蛋白的生物信息学分析有助于下一步深入研究MeAKT1在木薯耐贫瘠过程中的功能。     

无核荔枝生长素反应因子基因克隆及序列分析

为获得在无核荔枝中胚珠退化过程中差异表达的生长素反应因子基因(ARF),对其全长的克隆并进行分析,根据构建的无核荔枝胚珠败育SSH消减文库的生长素反应因子EST序列,提取高质量的RNA,通过SMART-RACE技术,获得一个生长素反应因子3501 bp的核苷酸序列。应用生物信息学软件进行分析,预测该序列含有2550 bp的开放阅读框,推导的蛋白质为849个氨基酸,具有B3、Auxin_resp和AUX_IAA保守区与结构功能域。分析表明该基因为ARFs基因家族中的一个新成员,进化树上与芒果亲缘关系最近。     

盐生杜氏藻MAPK基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术克隆了盐生杜氏藻（简称盐藻）的一种促有丝分裂活化蛋白激酶基因（GenBank Accession JQ782412）,命名为DsMAPK。对其进行生物信息学分析结果表明：该基因的cDNA全长为1861bp,开放阅读框（ORF）为1407bp,编码468个氨基酸,5′非编码区67bp,3′非编码区387bp;该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,无跨膜区域,为非跨膜蛋白,且定位于细胞质基质。二级结构预测表明该蛋白有25.2%的α-螺旋,12.4%的伸展片段,62.4%的自由卷曲;蛋白质同源性分析表明,与衣藻、团藻的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,在高盐胁迫（含3mol/L NaCl）下,DsMAPK基因的表达量显著上升,胁迫1h后表达量达到最大值,为正常水平（含1.5mol/ L NaCl）的5倍,差异达到极显著水平（P<0.01）。这些研究结果为进一步阐明DsMAPK的功能及作用机制奠定了基础。     

谷子WRKY转录因子对白发病菌胁迫的响应

谷子白发病是谷子生产上的重要病害,可严重影响谷子的产量和品质。WRKY转录因子广泛参与植物的抗病,生长发育等多种生理过程。为了探究谷子WRKY转录因子对白发病菌胁迫的响应,进而发掘谷子特有的抗病基因并为以后的抗病研究提供参考,本研究以感病品种‘晋谷21’为试材,基于前期对转录组测序的基础上,筛选出8个与谷子白发病相关的WRKY转录因子基因,然后通过生物信息学技术,对这8个WRKY转录因子基因特征,基因序列及所在染色体位置,基因组结构模式启动子序列元件,与白发病菌相关的调控元件以及表达模式等进行了分析。研究发现,8个WRKY转录因子基因中5个基因分布在5号染色体上,在受白发病菌胁迫后其表达水平存在显著差异。启动子顺式元件分析的组成和分布也存在较大差异,8个基因的蛋白大小是202~440个氨基酸,系统进化树分析表明,基因Seita.8G123100,Seita.5G261700的亲缘关系较近,并且受侵染后的表达水平均高于正常水平。发现8个基因中5个基因在受到病原菌侵染时其表达水平高于其正常状态下的基因表达水平,可以作为谷子抗病的重要候选基因。本研究结果为后续筛选谷子抗病基因及谷子抗病机制的研究奠定了一定的理论基础。