小麦Cyp450基因的电子克隆与生物信息学分析

为获得对小麦Cyp450基因及其编码蛋白质的理化性质与结构特性等,利用电子克隆方法克隆了一个新的小麦Cyp450基因,并对其编码的蛋白质进行了生物信息学分析。结果表明,该基因全长2155 bp,编码511个氨基酸;该蛋白序列的N端存在一个显著信号肽序列,属于CypX超家族,该蛋白定位于细胞质中,属于分泌途径中的信号肽蛋白,含有多个不同的磷酸化位点;二级结构以α螺旋（占48.14%）和无规则卷曲为主（占33.86%）,存在5个不稳定区,在85-511位处形成一个较大的球形蛋白域。该蛋白与大麦、二穗短柄草、水稻和高粱的同源Cyp450蛋白相似性较高,进化距离较近。获得了一个新的小麦细胞色素P450基因,并分析了其编码蛋白质的序列特性,为进一步实验克隆和研究其功能提供了理论基础。     

白羊草BiCDPK基因保守区的克隆及序列分析

为了研究CDPK基因的结构和功能,利用RT-PCR方法从白羊草中克隆得到BiCDPK基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明：该BiCDPK基因cDNA长1048 bp,包含387 bp的开放阅读框,编码128个氨基酸。蛋白表现为弱酸性,且稳定、亲水,二级结构中以无规则卷曲和α-螺旋为主。亚细胞定位于细胞质中,无跨膜结构域,无信号肽。蛋白序列中存在1个丝氨酸磷酸化位点和3个苏氨酸磷酸化位点。进化分析结果表明,克隆的BiCDPK基因与玉米、小麦和水稻具有较高同源性,相似度分别是97%、86%、86%。为进一步研究BiCDPK基因的功能奠定了基础。     

盐生杜氏藻MAPK基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术克隆了盐生杜氏藻（简称盐藻）的一种促有丝分裂活化蛋白激酶基因（GenBank Accession JQ782412）,命名为DsMAPK。对其进行生物信息学分析结果表明：该基因的cDNA全长为1861bp,开放阅读框（ORF）为1407bp,编码468个氨基酸,5′非编码区67bp,3′非编码区387bp;该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽,无跨膜区域,为非跨膜蛋白,且定位于细胞质基质。二级结构预测表明该蛋白有25.2%的α-螺旋,12.4%的伸展片段,62.4%的自由卷曲;蛋白质同源性分析表明,与衣藻、团藻的亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示,在高盐胁迫（含3mol/L NaCl）下,DsMAPK基因的表达量显著上升,胁迫1h后表达量达到最大值,为正常水平（含1.5mol/ L NaCl）的5倍,差异达到极显著水平（P<0.01）。这些研究结果为进一步阐明DsMAPK的功能及作用机制奠定了基础。     

播娘蒿甜菜碱醛脱氢酶基因的克隆和表达分析

采用RT-PCR技术克隆了播娘蒿的甜菜碱醛脱氢酶基因全长cDNA序列(DsBADH)。DsBADHcD-NA序列全长1653bp,其中开放阅读框长1503bp,编码一个由501个氨基酸残基组成的蛋白质,推测的蛋白质相对分子质量为54kD,pI为5.5。序列比对结果表明DsBADH与其它物种的BADHs无论在核酸水平还是在蛋白质水平上都表现较高的同源性,表明BADH基因家族具有较高的保守性。DsBADH基因的氨基酸序列在进化上与同属十字花科植物BADH基因距离较近。蛋白质序列存在一个编码十肽的高度保守序列,该结构在醛脱氢酶中是高度保守的,这些残基可能包含NAD 结合位点及酶催化位点,而且含有与酶功能有关的醛脱氢酶高度保守的氨基酸残基Cys,表明DsBADH可编码活性蛋白。N端存在信号肽,初步将该酶定位于叶绿体。半定量RT-PCR分析表明,DsBADH在根、茎、叶以及角果中均表达,但在角果中的表达显著高于其它组织,而且表明DsBADH受盐诱导正调节表达。     

陆地棉线粒体耐盐基因ccmC的克隆与表达分析

为了研究陆地棉线粒体基因细胞色素C合成酶C亚基(cytochrome c biogenesis C,ccm C)的结构和功能,本研究以陆地棉中9409为材料克隆得到线粒体基因ccm C,对其进行生物信息学分析,并利用q RT-PCR方法对该基因在陆地棉不同组织和盐胁迫前后的表达量进行分析。结果表明:陆地棉线粒体基因ccm C的ORF全长为753 bp,编码250个氨基酸;二级结构预测ccm C蛋白属于跨膜蛋白;该蛋白含有15个磷酸化位点,推测激酶磷酸化可能与其功能的行使相关。q RT-PCR结果表明该基因在陆地棉中具有组织表达差异性,在根中的表达丰度最高;盐胁迫后,该基因的表达量先增加后降低,盐胁迫6 h时表达量最高。研究结果可为今后进一步研究棉花线粒体基因ccm C的功能奠定了分子生物学基础。     

野巴旦杏AlsCBF基因的克隆及生物信息学分析

对克隆获得的野巴旦杏基因AlsCBF进行生物信息学分析,从而为该基因的功能鉴定提供理论基础,以期为新疆巴旦杏的抗寒育种提供基因来源。通过采用RT-PCR和RACE方法从野巴旦杏中克隆到植物抗逆途径关键转录因子CBF基因全长并命名为AlsCBF,GenBank登录号为HQ908653。生物信息学分析表明：该基因全长1171 bp,其中编码区长714 bp,编码237个氨基酸,其蛋白的分子式为C₁₁₅₆H₁₈₃₂N₃₃₂O₃₅₆S₁₅,相对分子质量为26.5581 kDa,理论等电点为6.76,该蛋白为亲水性蛋白,无信号肽存在;其蛋白质二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规卷曲为主。肽链可能含有8处丝氨酸磷酸化位点,1处苏氨酸磷酸化位点。三维结构预测表明其符合AP2结构域模型特点。本研究通过对AlsCBF基因的生物信息学分析,获得了该基因的相关信息,并与已有研究结果进行比对分析,推测该基因在植物抗寒过程中有重要的作用。     

大鲵虹彩病毒-LY株主要衣壳蛋白基因克隆和分子特征研究

【目的】明确大鲵虹彩病毒-LY株主要衣壳蛋白（mcp）基因分子特征和我国不同CGSIV毒株mcp 基因变异及病毒的系统进化关系。【方法】克隆了CGSIV-LY株 mcp基因,并运用生物信息学软件对获得的基因信息进行了分析。【结果】CGSIV-LY 株mcp基因全长1392bp,可编码463个氨基酸。预测蛋白质分子量为50.03ku,理论等电点是5.75,为亲水性可溶蛋白。CGSIV-LY 株mcp不含有信号肽;没有跨膜区存在;抗原表位预测显示抗原性良好;结构预测显示,存在8个潜在的N-糖基化位点,存在17个潜在的O-糖基化位点和20个潜在的磷酸化位点。CGSIV-LY 株 mcp二级结构中无β-折叠,无规则卷曲占57.66%,延伸链占31.11%,α- 螺旋占11.23%,主要以延伸链和无规则卷曲为主。氨基酸序列包含3个结构域：氨基酸N末端,氨基酸C末端和capsid_NCLDV保守区结构域,并在氨基酸序列的第414~436区存在一个低复杂度域。氨基酸序列多重比对和基于mcp氨基酸序列构建的蛙病毒属成员系统进化树分析结果显示,包括CGSIV-LY 株在内的我国出现的不同CGSIV毒株之间mcp 基因差异很小,为平行进化关系,共同聚为蛙病毒属成员独立的一支。【结论】CGSIV-LY 株 mcp为可溶性亲水蛋白,具有良好的抗原性和较为丰富的潜在糖基化位点和磷酸化位点。其蛋白二级结构以延伸链和无规则卷曲为主。我国出现的不同CGSIV毒株mcp基因差异很小,应具有基本一致的分子结构和特征。     

大豆KCS基因的克隆及结构预测

以大豆叶片总RNA为模板,利用RT-PCR方法,克隆获得大豆KCS基因序列。采用生物信息学方法对其进行预测分析,结果表明:大豆KCS基因的CDS序列长度为1533bp,编码510个氨基酸;大豆KCS基因编码的蛋白质理论分子量为57.1kD,等电点为9.03;该基因编码的蛋白具有两个完全跨膜结构;没有信号肽;其蛋白质二级结构中α螺旋占47.65%,无规则卷曲占35.88%,β折叠占16.47%;在进化关系上,与油茶、菟葵、苜蓿的亲缘关系相对较近,该研究结果可为大豆KCS基因结构和功能的进一步研究提供理论参考。     

新疆巴州牦牛Lfcin基因的克隆与分子特征

利用PCR技术首次从新疆巴州牦牛基因组DNA中扩增获得了乳铁蛋白(Lactoferrin,LF)基因exon 2编码区,其中含有乳铁蛋白素(Lactoferricin,Lfcin)基因编码区序列;利用在线生物软件对Lfcin蛋白的结构进行预测.结果表明:克隆获得了含新疆巴州牦牛LF基因exon 2的DNA序列(GenBank:EU547256),共778 bp,其中LF基因exon 2编码区长165 bp,Lfcin基因编码区长75 bp;序列分析显示,克隆获得的牦牛DNA序列与奶牛该序列存在11个碱基的变异;牦牛和奶牛的Lfcin蛋白质序列完全相同,各物种Lfcin蛋白具有较高的同源性;各物种的Lfcin蛋白进化树符合物种进化规律;同源建模预测的Lfcin 3D模型显示,Lfcin为一段由α-螺旋和β-折叠组成的"U型"结构.首次从新疆巴州牦牛品种中克隆获得Lfcin基因编码区全长序列并揭示了其分子特征,为牦牛Lfcin蛋白基因工程和蛋白质功能方面的研究奠定了重要基础.     

副干酪乳杆菌prcA基因克隆及生物信息学分析

旨在了解副干酪乳杆菌prcA基因的结构和功能,探明prcA基因与副干酪乳杆菌拟群体效应相关基因—自诱导肽编码基因之间的联系。通过PCR方法对副干酪乳杆菌中prcA进行扩增,并通过生物信息学方法对该基因的核苷酸组成、蛋白质构象等方面进行预测和分析。克隆得到的prcA基因全长为416 bp,包括一个138 bp的开放阅读框,编码45个氨基酸,蛋白分子量为5326.83 Da,等电点为4.85,是一种稳定蛋白,不含跨膜区,蛋白质的二级结构以α-螺旋、不规则卷曲和延伸主链组成,亚细胞定位预测显示该蛋白主要位于细胞外;prcA基因为副干酪乳杆菌拟群体效应相关基因—自诱导肽编码基因,负责细菌素生成的调控。     

杜氏盐藻MAPKK激酶基因DsMAPKKK的克隆、原核表达与纯化

为了进一步研究MAPKK激酶的生理功能,利用RT-PCR技术扩增了DsMAPKKK的开放阅读框序列,并利用T4连接酶与质粒pGS21a连接,构建了原核表达载体pGS21a-DsMAPKKK。将该重组质粒导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导成功表达了融合蛋白。经SDS-PAGE检测,融合蛋白在上清和包涵体中均存在。可溶性蛋白经过GST柱纯化,电泳分析结果表明,在68kD左右有单一的蛋白条带,说明融合蛋白得到有效纯化。蛋白印迹结果显示在68kD左右有明显的杂交条带,初步证明纯化的蛋白就是带有GST标签的MAPKK激酶。DsMAPKKK的成功表达与纯化,为深入探讨DsMAPKK激酶的性质及功能打下了坚实的基础。     

盐藻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因DsSTPK的克隆、原核表达及纯化

前期研究表明,盐藻丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶DsSTPK在转录水平上的表达受盐胁迫诱导。为了进一步研究该蛋白激酶的生理功能,通过RT-PCR扩增DsSTPK的开放阅读框,并将其克隆至pET32a(+)载体,得到重组表达载体pET32a(+)-DsSTPK。将重组表达载体转化E. coli. BL21 (DE3),IPTG诱导表达,然后对融合蛋白进行表达形式分析,利用His60 Ni离子重力柱进行纯化,所得产物进行SDS-PAGE和Western-blot鉴定。本研究成功构建了重组表达载体pET32a(+)-DsSTPK,经IPTG诱导后表达出的融合蛋白的分子量与预期相符;表达形式分析显示该融合蛋白在上清和包涵体中均存在;将上清蛋白纯化后获得了纯度较高的融合蛋白;Western-blot检测显示该融合蛋白能被抗组氨酸抗体特异性识别,具有良好的免疫学活性。DsSTPK的成功表达、纯化,为下一步制备抗体,然后进一步在蛋白质水平上研究其在盐藻耐盐机制中的作用奠定了基础。     

编码荔枝乙烯受体(LcERS1)的cDNA基因的克隆与分析

利用RT -PCR和RACE方法获得了编码荔枝乙烯受体的cDNA序列 ,长度为 2 ,193bp ,该序列中包含一个ORF全长 1,84 8bp ,编码 6 15个氨基酸 ,推测的分子量为 6 8kD。由该序列推定的蛋白质氨基末端存在疏水区 ,羧基端存在组氨酸激酶区和GAF区。与拟南芥的五个乙烯受体比较 ,推定的荔枝乙烯受体的激酶区有乙烯受体所具有的 5个基序 (H ,N ,G1,F ,G2 )中的H和N基序 (motif) ,分别位于第4 2 3- 4 32和 5 32 - 5 4 3氨基酸 ,其保守序列H为 :MNHEMRTPM ;N为 :LMQTILNIMGNA。结构分析和功能预测表明 ,本研究获得的荔枝乙烯受体编码序列推定的氨基酸序列具有乙烯受体的典型特征 ,初步分析表明获得的荔枝cDNA序列包含了编码荔枝乙烯受体 ,LcERS1,的全长cDNA基因 (lcers1) ,GenBank登录号为AY311484。     

铁对盐藻生长与物质积累的调控作用研究

实验研究了不同浓度的铁对盐藻细胞生长与物质积累的调控作用。结果表明,培养液中供给铁过多或过少都不利于盐藻细胞的生长与物质积累。以培养基中30mg/L的铁浓度对盐藻细胞生长、蛋白质合成与β-胡萝卜素积累的促进作用最大。这一铁浓度可用于盐藻的生产性培养。     

绒山羊和绵羊KAP1.4基因cDNA序列的克隆及其编码蛋白的结构分析

对绒山羊和绵羊KAP1.4基因的编码区进行克隆与分析,在此基础上预测了KAP1.4蛋白的分子结构,为研究毛(绒)用性状的分子基础提供资料。结果表明,克隆测序获得绒山羊、绵羊KAP1.4基因编码区序列长度为579bp和549 bp,分别编码192个氨基酸和182个氨基酸。生物信息学分析表明,绒山羊和绵羊KAP1.4蛋白的基本理化特性方面无明显差异,属于非跨膜蛋白,信号肽的长度和裂解点相同,都具有1个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和6个N端酰基化位点;蛋白的二级结构由β折叠、β转角和无规则卷曲构成。三级结构预测显示,绒山羊与绵羊KAP1.4蛋白在空间三维结构上存在显著差异,将会进一步影响其功能的发挥并成为调控产毛(绒)性状的影响因子。     

棉属野生种旱地棉蛋白激酶基因GarCIPK8的克隆与功能分析

CIPK (calcineurin B-like calcium sensor interacting protein kinase)是植物钙感受器钙调磷酸酶B类似蛋白特定靶向的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在前期的研究中, 我们将棉属野生种D亚组旱地棉(Gossypium aridum)盐胁迫前后RNA混合样品进行转录组测序, 发现一CIPK相关基因存在较高的转录丰度。盐胁迫下荧光定量PCR分析表明该基因在根部表现诱导上调表达, 推测该基因可能参与植物在高盐胁迫下的生理调控。利用电子克隆及RT-PCR方法从旱地棉中克隆了一个ORF全长为1350 bp的蛋白激酶基因GarCIPK8。序列分析表明该基因编码的蛋白含有449个氨基酸, 分子量为51.12 kD, 理论等电点为8.13, 其N端催化结构域包含一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶域, C端具有植物CIPK蛋白家族特有的24个氨基酸组成的NAF保守结构域; 与水稻OsCIPK8蛋白的相似度为73.95%。为进一步验证其功能, 利用组成型高效强启动子CaMV35S和拟南芥逆境胁迫启动子rd29A构建植物表达载体并转化烟草, 经PCR和RT-PCR分子检测, 证明GarCIPK8基因已经整合到烟草基因组中, 并正常表达。T₁代转基因植株耐盐性鉴定结果表明GarCIPK8基因对提高转基因植株的耐盐性有较明显的作用, PEG干旱模拟试验也证明GarCIPK8基因可增强植株的抗旱性。     

山羊心脏型脂肪酸结合蛋白cDNA序列克隆及生物信息学分析

本文通过RT-PCR技术克隆山羊心脏型脂肪酸结合蛋白的cDNA 全序列,并对cDNA序列的氨基酸同源性、理化性质、二级结构特征进行了预测和分析。结果显示,山羊H-FABP基因cDNA全长402 bp,推测的氨基酸序列与绵头同源性为100%;H-FABP蛋白属疏水性蛋白,呈为弱酸性;二级结构以β折叠为主;不含跨膜结构域,具有潜在的信号肽位点、多个其它信号位点以及细胞脂肪酸结合信号位点,从而为揭示H-FABP蛋白空间结构和生物学功能研究提供理论基础。     

甜樱桃(Prunus avium)PaGAST基因的电子克隆及生物信息学分析

为获得甜樱桃PaGAST 基因的cDNA 序列,并预测该基因编码蛋白的结构与功能,以草莓FaGAST1 基因序列为探针,通过基于NCBI数据库中表达序列标签的电子克隆技术对甜樱桃PaGAST 基 因进行克隆。利用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、疏水性和亲水性、信号肽序列、跨膜结构域、亚细胞定位及功能等方面进行分析。结果表明：甜樱桃PaGAST 基因长度为750 bp,开放阅读框长度为324 bp,编码107 个氨基酸,N末端存在信号肽序列,C末端含有保守的GASA结构域。由于PaGAST蛋白中含有的疏水性氨基酸残基较多,该蛋白具有跨膜螺旋区,是一种跨膜蛋白,且有10 个预测的蛋白激酶磷酸化位点。亚细胞定位分析表明,PaGAST蛋白分布在细胞膜外的可能性很大。功能预测显示,PaGAST 基因可能具有响应胁迫应答、信号转导和免疫应答方面的功能。进化分析显示甜樱桃PaGAST蛋白与桃的亲缘关系最近。在一定程度上为甜樱桃PaGAST 基因的克隆及功能鉴定奠定理论基础。     

芍药分生组织决定基因APETALA2(AP2)的克隆及生物信息学分析

花分生组织决定基因APETALA2(AP2)属于植物ABCDE模型基因,在花器官发育过程中起着重要的调控作用。为进一步了解芍药AP2基因的生物学功能,利用RACE扩增和测序技术克隆plAP2基因序列,利用生物信息学在线程序对其序列特征、蛋白结构及功能、亚细胞定位进行预测,并利用MEGA 5.0构建不同植物AP2分子进化树,最后利用qPCR检测其在内外花瓣中的差异表达情况。结果显示,克隆获得芍药AP2基因(plAP2)cDNA序列全长1 935 bp,其ORF全长为1 578 bp,编码525个氨基酸。蛋白结构与功能分析表明,plAP2蛋白为亲水性不稳定蛋白,无跨膜结构和信号肽,表明为非分泌蛋白;核定位信号位于氨基酸序列139-147(KKSRRGPRS);二级结构包括α-螺旋(24%)、β-折叠(19%)、β-转角(28%)和无规则卷曲(28%);plAP2蛋白存在8个糖基化位点和64个磷酸化位点,plAP2蛋白包含2个相同的保守结构域:AP2/(Ethylene-Responsive factors,ERF)(151-213aa和243-306aa)。亚细胞定位主要在细胞质(45.0%)中,少量分布于微体、线粒体基质间隙和溶酶体;进化树分析表明,芍药AP2基因与牡丹高度同源且亲缘关系最近;qPCR检测显示外瓣AP2表达量均极显著高于内瓣(P0.01)。克隆出芍药AP2全长cDNA序列,系统地揭示了plAP2蛋白基本结构、功能位点区域、细胞定位以及组织表达情况,为今后深入研究plAP2基因功能提供基础素材和理论参考。