棉花GhIQM1基因克隆及抗黄萎病功能分析

棉花是我国重要的经济作物,而黄萎病(Verticillium wilt)是棉花生产上的主要病害,严重危害棉花产量和纤维品质。本研究通过转录组数据分析筛选出1个与棉花抗病相关、不依赖Ca²⁺的钙调素结合蛋白基因GhIQM1。该基因受黄萎病菌和水杨酸(SA)诱导表达。利用病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)技术研究其在棉花抗黄萎病中的功能发现,抑制GhIQM1基因表达增强了植株对黄萎病的抗性, TRV:GhIQM1植株病情指数、维管束褐化程度、体内病原菌积累量都显著低于TRV:00。qRT-PCR分析表明,抑制GhIQM1表达的植株接种黄萎病后,作为参与水杨酸途径中的3个重要基因NPR1、NPR3和PR5的表达量显著高于对照。以上结果初步表明,GhIQM1基因可能通过抑制SA途径负调控了棉花的黄萎病抗性。     

棉花冠菌素不敏感因子GhCOI1基因分离和对大丽轮枝菌的抗性分析

为了解决黄萎病对棉花的危害,利用基因工程技术培育抗病棉花品种是当前育种的主要目标。从棉花中克隆了一个黄萎病抗性基因GhCOI1,其编码冠菌素不敏感因子。GhCOI1基因序列全长2 213 bp,编码一个600氨基酸的多肽,分子量为68 k Da,等电点p I是7.06。GhCOI1含有典型的F-box和LRR结构域。组织表达分析表明,该基因在根器官优势表达,并且其表达受到大丽轮枝菌浸染诱导。利用病毒诱导基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术,抑制了GhCOI1基因在棉花植株中的表达;通过大丽轮枝菌接菌分析表明,GhCOI1基因沉默能够引起植株的抗性下降,发病加重。研究结果表明GhCOI1参与棉花对大丽轮枝菌抗性调控,因此,其可以作为棉花抗病育种的候选基因。     

棉属D基因组3个野生棉种Bet v1基因鉴定及功能分析

【目的】对棉花D基因组中Bet v 1基因家族进行分析,比较其在不同抗性棉种间的表达模式差异,为深入研究Bet v 1基因在棉花抗黄萎病中的作用提供理论依据。【方法】通过生物信息学方法对D基因组中Bet v 1基因进行鉴定。通过雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii,D5)、三裂棉(G. trilobum,D8)和瑟伯氏棉(G.thurberi,D1)转录组和实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析Bet v 1基因在黄萎病菌处理下的表达模式。利用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)对Bet v 1基因进行功能鉴定。【结果】[棉花D基因组中包含59个成员,其中57个基因带有内含子,分布于8条染色体上,多数为亲水性蛋白并定位于细胞质。]黄萎病菌胁迫条件下3个野生棉种的Bet v 1基因表达量与其抗病水平一致。将不同表达水平的基因分为3组,其中第3组基因响应黄萎病菌侵染并在抗病棉种瑟伯氏棉中高表达,表明该组基因可能与黄萎病胁迫应答反应有关。从中筛选出高水平表达的Bet v 1基因,在陆地棉中沉默相应的同源基因,棉株感病加重,揭示该基因在棉花抵御黄萎病菌侵染过程中起正调控作用。【结论】响应黄萎病菌胁迫的Bet v 1基因在棉花抗黄萎病复杂的生物过程中至关重要。本研究结果为棉花Bet v 1家族基因的深入研究提供依据,为进一步解析棉花Bet v 1基因的功能奠定基础。     

TRV病毒介导的基因沉默体系在棉花中的建立及应用

以陆地棉CLA1基因为标记基因,利用烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)载体建立基于病毒介导的棉花基因沉默体系(virus-induced gene silencing, VIGS)。病毒RNA2的RT-PCR分析证明,棉花子叶接种TRV病毒后,该病毒可高效扩散到受体的根、茎、叶等器官。利用TRV-VIGS体系同时诱导34份不同来源棉花材料CLA1基因沉默,尽管不同材料间的抑制程度有差异,但均可有效抑制CLA1基因的表达,说明该体系在棉花研究中的广谱利用性。GhMAPKKK基因受黄萎病菌诱导表达, 接种后96 h表达量达到高峰。利用TRV-VIGS体系,成功抑制了棉花GhMAPKKK基因的表达,与对照株相比,抑制后的棉花植株接种黄萎病菌后更易感病,说明GhMAPKKK参与了棉花对黄萎病菌的抗性反应。具有广谱性、灵敏性和高通量等特点的棉花TRV-VIGS体系建立将加速棉花功能基因组研究进程。     

棉花WRKY22基因分离及其对黄萎病的抗性分析

为了克隆棉花抗黄萎病相关基因,利用生物信息学、病毒诱导基因沉默技术(VIGS)、实时定量PCR(q PCR)和接菌分析来研究棉花WRKY基因对大丽轮枝菌的诱导响应和抗性。结果从棉花中筛选出8个与拟南芥直系同源的棉花抗病相关WRKY基因,这些直系同源WRKY基因表达受到大丽轮枝菌浸染诱导响应。其中有6个GhWRKY基因的表达均受到大丽轮枝菌诱导上调,而GhWRKY70和GhWRKY48的表达量随着不同的时间点呈现上调或下调。GhWRKY22等5个基因表达量在24,72 h分别表现为上调,呈现出双峰曲线。对GhWRKY22表达特征进一步分析,结果显示,GhWRKY22基因在茎里优势表达,同时表达受到大丽轮枝菌、水杨酸和茉莉酸激素的诱导。GhWRKY22基因沉默植株对大丽轮枝菌的敏感性增加,抗病标志基因(PR1、PR3、PR4、PR5、PAL和PDF1. 2)表达量也显著降低,揭示GhWRKY22是通过SA和JA信号途径参与棉花对大丽轮枝菌的响应过程。总之,棉花中8个WRKY基因参与棉花对黄萎病抗性调控,其中GhWRKY22基因正调控棉花的抗性,可作为棉花抗病育种的候选基因。     

棉花GbSTK基因调控开花和黄萎病抗性的功能研究

棉花是重要的经济作物,实现既抗病又早熟是棉花重要的育种目标,但棉花抗病与早熟基因之间的关联性研究报道甚少。本课题组前期鉴定到一个响应黄萎病菌诱导的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因GbSTK,可以提高转基因拟南芥的黄萎病抗性。本研究发现多个抗病棉花品种中STK基因的表达量显著高于感病对照品种H208。在抗病品种农大601中沉默STK基因,沉默植株在接菌后20d,其黄萎病抗性显著降低,病情指数由27.5(耐病)升高到63.2(感病),表明该基因正向调控棉花黄萎病抗性。对转GbSTK基因拟南芥表型鉴定发现,其开花时莲座叶片数平均为7.5个,显著低于空载体对照植株(11.9个),转基因植株开花时间较对照平均提早5~7 d。进一步对拟南芥开花途径标志基因FT、SOC1和LFY的转录水平检测发现,转基因不同株系中FT和SOC1的表达水平显著高于对照植株,而LFY基因的表达受影响较小,表明STK基因可以影响开花关键基因FT和SOC1的表达,进而调控植株提早开花。基于酵母双杂交互作蛋白筛选试验,初步获得30个与GbSTK具有互作关系的候选蛋白,为进一步揭示GbSTK的分子调控网络奠定了基础。本研究首次鉴定出可同时提高黄萎病抗性和提早开花的一个功能基因,为棉花抗病早熟遗传改良提供了参考依据。     

一个受黄萎病菌诱导的海岛棉功能基因GbVWR的克隆与表达

黄萎病是一种土传真菌维管束病害,严重影响棉花产量和品质。挖掘抗黄萎病相关基因对于棉花抗黄萎病遗传改良具有重要意义。本研究通过筛选黄萎病菌胁迫下的海岛棉全长cDNA文库和陆地棉SSH文库,获得一个与黄萎病菌胁迫相关的基因,命名为GbVWR。生物信息学特征和基因表达分析表明,GbVWR基因全长520 bp,开放读码框198 bp,编码65个氨基酸残基组成的蛋白,理论等电点为5.32,包含一个信号肽和一个跨膜区,是一种分泌蛋白。GbVWR基因可以诱导表达7 kD的蛋白。在GbVWR基因起始密码子上游1500 bp的核苷酸序列区间预测到真菌激发子响应、激素响应、伤口响应及黄酮生物合成基因调节等应答元件。GbVWR基因在海岛棉根中表达最高,茎中其次,叶中最低。受黄萎病菌诱导后,GbVWR基因在接菌后2 h可对黄萎病菌作出应答反应。此外SA、ET和GA均可显著诱导GbVWR基因的表达。初步推断GbVWR是海岛棉抵御黄萎病菌过程中一个新的功能基因,通过参与多种激素信号途径发挥功能     

GhWRKY48负调控棉花对大丽轮枝菌的抗性

为了防治棉花黄萎病对棉花生产的危害,利用抗病基因培育抗病品种是最经济有效的方法。从陆地棉中克隆了1个WRKY转录因子基因,命名为GhWRKY48;其编码序列全长为882 bp,编码293个氨基酸残基,预测分子质量和等电点分别为32.68 ku和6.10。qPCR组织特异性表达分析结果表明,GhWRKY48在根、茎和叶中均表达,而在茎中为优势表达;同时GhWRKY48表达受到大丽轮枝菌、茉莉酸和水杨酸的诱导。通过病毒诱导基因沉默技术获得GhWRKY48基因沉默植株。对基因沉默植株接种大丽轮枝菌进行抗病性分析,结果显示,沉默植株的病株率和病指均低于对照植株,表明沉默GhWRKY48基因能够提高棉株抗病性。综上所述,GhWRKY48是一个负调控转录因子,抑制下游抗病基因的表达,从而参与棉花对大丽轮枝菌的抗性;因此,GhWRKY48基因可以作为一个理想的候选基因用于棉花的抗病育种。     

利用WGCNA鉴定棉花抗黄萎病相关基因共表达网络

加权基因共表达网络分析(Weighted Gene Co-expression Network Analysis,WGCNA)作为一种典型的系统生物学方法,可用来鉴定协同表达的基因模块,探索模块与目标性状之间的生物学相关性,并挖掘网络中的核心基因。黄萎病(Verticillium wilt)可严重降低棉花(Gossypium spp.)的产量及品质,因此研究抗病基因及抗病机制,对于棉花抗病育种工作具有重要意义。本研究以黄萎病菌侵染不同时间点的海岛棉(Gossypium barbadense)幼苗根尖转录组数据为基础,分析其差异表达基因,并选取在不同样本之间表达水平变异最大的前50%基因(共35,647个)进行WGCNA。结果表明,在黄萎病菌侵染条件下,共有22,850个基因差异表达,其中4685个为所有侵染时间点共有的差异基因。共鉴定到18个基因共表达模块,其中5个为抗黄萎病相关特异性模块(black、mediumpurple3、darkolivegreen、plum3模块分别与侵染2 h、6 h、48 h、72 h时间点正相关;mediumpurple2与侵染2 h时间点负相关)。GO和KEGG富集分析表明,特异性模块可以富集到有生物学意义的富集结果,如刺激响应、钙离子结合、黄酮类化合物合成代谢等抗逆相关通路。通过计算模块内基因的连通性,挖掘出了网络中的核心基因,功能预测表明,这些基因可能在逆境胁迫响应中发挥重要作用。本研究为进一步理解棉花抗黄萎病的分子机制、选育棉花抗病新品种提供了理论指导。     

海岛棉品种根部黄萎病菌诱导表达全长cDNA文库的构建

以海岛棉品种 712 4黄萎病菌接种前后的根部组织为材料 ,构建的黄萎病菌诱导表达的全长c DNA文库。该文库的克隆数目为 1.15×10 7pfu,插入片段的大小在 0 .5～ 6kb之间 ,文库的阳性克隆子的比例为 84.7%。该文库可以用于抗黄萎病基因的克隆及其相关研究。在文中作者同时对棉花的文库构建所应该注意的事项进行了讨论。     

棉花黄萎病菌与抗黄萎病遗传育种研究进展

简要综述了棉花黄萎病菌及抗黄萎病遗传育种的研究进展。研究表明 ,各地的棉花黄萎病菌均存在致病力的分化 ,其致病机理是病菌侵入棉花后菌丝及孢子在导管内大量繁殖 ,同时刺激邻近的薄壁细胞产生胶状物质及侵填体而堵塞导管 ,使水分和养分运输发生困难 ,更重要的是病菌在棉株体内产生的糖蛋白毒素作用的结果。棉花抗黄萎病的遗传方式争论较大 ,但一般在温室由单一菌系接种鉴定时棉花黄萎病抗性表现为单基因遗传 ,而在田间病圃或用多菌系混合鉴定时 ,棉花黄萎病抗性表现为多基因遗传。由于陆地棉内缺乏高抗黄萎病资源 ,给棉花抗黄萎病育种带来一定困难 ,但 90年代以来 ,已育成 86 - 6、川 73 7、川 2 80 2、豫棉 1 9号、豫棉 2 1号等一些抗黄萎病的新品种。上述抗黄萎病品种在棉花黄萎病综合防治中起了重要作用     

酸不可溶性木质素和漆酶在棉花抗黄萎病中的作用

以抗病海岛棉Pima 90-53、耐病陆地棉冀棉20和感病陆地棉邯208为材料,研究黄萎病菌胁迫下棉花细胞壁的组织结构和木质素含量与棉花抗性的关系,并分析参与木质素合成的胞外漆酶的基因表达水平。结果发现,室内接种黄萎病菌24 h,在Pima 90-53的根部导管组织中没有发现病原菌的侵入,而在冀棉20和邯208的导管组织均有病原菌侵入;接种35 d时,Pima 90-53的茎部导管细胞壁高度木质化且导管堵塞不明显,冀棉20的导管细胞壁中度木质化且导管堵塞不明显,而邯208的导管细胞壁仅发生轻度木质化且导管堵塞严重。对田间病圃种植棉花叶片和叶柄的测定发现,3个品种的酸不可溶性木质素含量与品种的病情指数呈显著负相关(r = 0.99991^*),酸不可溶与可溶性木质素的比值大小与棉花品种黄萎病抗性强弱表现一致。基于此,进一步采用Real-time PCR技术分析参与木质素合成的漆酶基因GhLaccas表达差异发现,在冀棉20接种病菌后各检测时间点的表达量均显著高于邯208,且在冀棉20中GhLaccase表达量较0 h升高9~14倍,在8 h达到最高并在72 h内一直维持较高水平,表现出较高的应答效率。以上结果表明酸不可溶性木质素含量与黄萎病抗性呈正相关,漆酶在棉花抗黄萎病过程中起着重要作用。     

棉花黄萎菌间接ELISA方法的建立及其检测棉花体内带茵的应用

利用棉花黄萎病的病原菌的菌丝蛋白作为抗原,制备了该病原菌菌丝蛋白的多克隆抗体,建立了特异性检测棉花黄萎病菌的间接ELISA方法.该方法检测灵敏度达到5 ng/mL棉花黄萎菌菌丝蛋白.应用该方法可定量检测棉花组织及其根部土壤中棉花黄萎菌的含量,同时发现病株的茎、根及根部土壤的带菌量多少与病株发病程度有一定的相关性.本研究说明,该方法可在棉花黄萎病的早期检测和预报上具有重要的应用前景.     

杀虫剂累计施用量对棉株衰老及黄萎病抵抗能力的影响

以常规棉和抗虫棉为材料研究了大田棉铃虫中度——重度发生情况下,杀虫剂对棉株衰老和抗黄萎病能力的影响。结果表明,杀虫剂累计用量超过一定值后,叶绿素含量、可溶性蛋白含量降低,抗氧化系统酶类活性下降,活性氧积累,膜脂过氧化加剧,促使棉花早衰,抗黄萎病能力下降。     

短季棉花黄萎病田间分布型初步研究

通过对短季棉重病田的研究表明，棉花黄萎病株在田间呈正态分布，对棉株产量影响大的重病株则呈负正态分布，而几乎绝产的枯死病株也呈负二项分布，说明危害棉花产量大的病株在田间呈聚集状态。     

陆地棉植株组织结构和生化代谢与黄萎病抗性的关系

通过对8个陆地棉品种的植株组织结构、酶活性和根系分泌物的比较分析,研究陆地棉黄萎病抗性机制。研究结果表明,陆地棉抗病品种根和茎的导管细胞壁厚、直径小、数目多,髓射线数目多、单位面积薄壁细胞数多,有助于抵御棉花黄萎病菌的侵入与扩展。过氧化物酶（POD）活性与棉花抗黄萎病的关系不明显,但苯丙氨酸解氨酶（PAL     

一种新的棉花黄、枯萎病快速接种方法的研究

 3种不伤根的棉花黄、枯萎病接种方法,即全生育期的田间病圃鉴定法、液体培养棉花苗期孢子悬浮液浸根法和土壤种植棉花苗期孢子悬浮液灌根法进行对比,结果表明,液体培养棉花苗期孢子悬浮液浸根法（接种浓度为10⁷个分生孢子·mL^-1）全周期只需要30 d。通过这种方法,不仅可以鉴定出棉花品种对黄、枯萎病菌的抗、感病性,还可以鉴定不同黄、枯萎病菌菌株的致病力。对比不同浸根接种时间（10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）对结果的影响,发现浸根接种40 min可加快发病,鉴定结果和田间病圃鉴定的比较一致。     

棉花黄萎病抗性遗传和分子生物学研究进展

介绍了棉花黄萎病菌的致病机制 ,棉花黄萎病抗病机制及其遗传以及棉花黄萎病的鉴定方法 ,并对分子生物学在棉花黄萎病研究中的应用状况进展进行了综述。