植物源农药印楝素的研究与应用

印楝素是目前世界上最优秀的植物源农药,田间登记应用已30多年,对全球作物保护和生态安全发挥了重要的作用。本文回顾了印楝素的发现和印楝在中国引种情况,总结了印楝素结构鉴定与全合成的历程,重点介绍印楝素拒食、抑制昆虫生长发育、诱导细胞凋亡和自噬的分子作用机理以及印楝分子生物学、印楝素生物合成研究的最新进展。1983年,赵善欢等成功地将印楝引种中国,随后我国许多学者开展印楝引种与繁育,种植面积曾超过6万hm~2,为我国印楝素杀虫剂的规模化生产提供了原料保障。1997年印楝素以新化合物结构作为新农药在我国登记,实现了商业化应用,2014年成为农业部推荐使用的低毒低残留农药主要品种,获得了显著的经济和生态效益。我国学者发现了印楝素诱导细胞自噬现象,阐明了印楝素诱导细胞凋亡和自噬的分子调控机理。随着强化农产品质量安全的源头控制,印楝素的研究和应用将会越来越深入普及。今后要进一步加强基础研究,明确印楝素的分子靶标,为印楝素的科学使用提供理论基础。     

接种量与通气比对印楝悬浮细胞生长及印楝素产量的影响

为印楝悬浮细胞扩大培养提供依据,利用5L气升式发酵罐,以印楝悬浮细胞作种子细胞,研究接种量与通气比对印楝悬浮细胞生长和印楝素产量的影响。结果表明:在反应器中,印楝悬浮细胞生长和印楝素产量呈偶联型;种子细胞适宜接种量和通气比分别为60g/L和0.2vvm,在此条件下,悬浮培养基质中的pH呈先降后升的变化趋势,细胞干重和印楝素产量分别为11.41g DW/L和8.32mg/g,添加复合诱导子后48h印楝素产量最大,达94.78mg/L。     

印楝素A诱导Sf9细胞凋亡的显微和超微形态变化

利用倒置显微镜和透射电子显微镜技术观察印楝素A诱导草地贪夜蛾Spodoptera frugperda蛹卵巢Sf9细胞凋亡的显微和超微形态变化.结果表明:1.5μg.mL-1印楝素A对Sf9细胞具有显著的凋亡诱导作用,从凋亡小体和贴壁细胞数量变化判断,印楝素A处理12 h,细胞开始出现少量凋亡小体,12~24 h凋亡小体逐渐增多,但贴壁细胞未见明显减少,因此24 h之前(0~24 h)属于凋亡早期阶段;24~36 h凋亡小体大量出现,贴壁细胞逐渐减少,属于凋亡中期;处理36 h以上,凋亡小体和贴壁细胞急剧减少,细胞凋亡进入晚期.观察诱导24 h的细胞超微结构发现,胞内的主要细胞器在数量或形态上发生了显著变化,包括溶酶体数量显著增加,线粒体内部嵴变模糊,内质网从囊泡状变成线管状,细胞核出现分页、皱缩以及区域性膨大等.     

不同杀虫成分对Sf9细胞凋亡的影响

通过倒置显微形态观察凋亡小体、DNA琼脂糖凝胶电泳确证的模型,研究了8种代表性杀虫成分对草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda离体培养细胞系Sf9的凋亡诱导效果,以探讨不同杀虫成分对昆虫细胞凋亡的影响.结果表明,印楝素0.15～1.50 μg/mL处理后72 h内、喜树碱0.35～3.50 μg/mL处理后36 h,Sf9细胞产生大量典型凋亡小体,处理时间延长或剂量加大则以造成细胞坏死为主;DNA电泳产生典型的DNA Ladder,表明印楝素和喜树碱对Sf9具有明显的细胞凋亡诱导作用.印楝素1.5 μg/mL诱导处理Sf9细胞凋亡高峰期为处理后24～48 h,喜树碱0.35～3.50 μg/mL诱导处理Sf9细胞凋亡高峰期为处理后12 h.苦参碱、氟铃脲、毒死蜱、灭多威、氯氰菊酯以0.1～10.0 μg/mL及昆虫蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone)以0.048～4.800 μg/mL处理后72 h内对Sf9均无明显的细胞凋亡诱导作用.杀虫剂对昆虫细胞凋亡诱导效应随供试化合物、细胞种类、处理剂量、处理时间而异.     

印楝素对小菜蛾胚胎细胞增殖和凋亡的影响

【目的】探讨印楝素对小菜蛾Plutella xyllostella胚胎细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制。【方法】将体外培养的小菜蛾胚胎细胞分为印楝素处理组和未处理组,采用CCK-8试剂盒检测细胞增殖的抑制率,激光共聚焦镜检PI染色后的细胞死亡和DAPI染色后的凋亡小体,通过Western-blotting检测各组细胞Caspase-3的表达情况以及通路蛋白Akt的磷酸化水平。【结果】印楝素对小菜蛾胚胎细胞有明显的增殖抑制作用,且呈现浓度依赖性,24 h的IC_(50)为4.4μg·mL~(-1)。印楝素处理后的细胞经PI染色后能明显观察到死亡细胞,DAPI染色后可见凋亡小体;Caspase-3蛋白发生剪切,并且抑制Akt的磷酸化水平。【结论】印楝素对小菜蛾胚胎细胞的增殖有明显的抑制作用,并通过抑制Akt信号通路的活化,诱导细胞产生依赖于Caspase-3的Ⅰ型凋亡。     

印楝农药的安全性研究进展

印楝素是世界上公认最有潜力的杀虫植物,由于印楝植物源农药的研究和使用不断受到人们重视,所以对印楝植物源农药使用后安全性研究就显得十分必要。综述了印楝植物源农药制剂对脊椎动物的毒性,对生态环境和非靶标生物的影响。     

影响印楝愈伤组织生长和印楝素累积的因素

研究了培养基细胞分裂素、蔗糖浓度、光照条件对印楝愈伤组织生长和印楝素累积的影响.结果表明,印楝愈伤组织培养以MS 3.0mg/L NAA 1.0 mg/L 6-BA 40 g/L蔗糖为最佳培养基,半光照培养,此时印楝素的累积量达到较高水平.     

印楝素A和印楝素B的稳定性比较

印楝种子甲醇抽提物在甲醇+水(体积比为55:5)中于(54±1) ℃下贮存7和14 d,印楝素A的降解率分别为33.59%和54.45%,印楝素B的为11.96%和21.11%;印楝种子甲醇抽提物在(54±1) ℃下贮存7和14 d,印楝素A的降解率为82.35%和94.79%,印楝素B的为20.32%和54.75%;印楝素干粉于(54±1) ℃下贮存14 d,印楝素A和印楝素B的降解率分别为90.15%和81.85%.在(54±1) ℃下热贮7 d,在甲醇、甲醇+水(9:1)和甲醇+印楝油(9:1)中印楝素A的降解率分别为29.65%、44.99%和12.76%,印楝素B的分别为19.68%、25.65%和9.67%.印楝油对印楝素A和印楝素B均有保护作用.     

印楝素杀虫剂对小菜蛾和菜粉蝶幼虫的毒力测定初报

使用化学杀虫剂引起的害虫抗药性和农药残留、污染农产品及环境的问题,已受到世界各国的广泛关注.为寻找化学杀虫剂的替代品,近年各国积极开展了对植物杀虫剂的研究.楝科植物中的印楝(Azadirachta indica)的杀虫作用已引起许多专家和学者的兴趣,并对它的作用方式和机理进行了研究.实验证明,印楝提取物对多种作物害虫都有一定的杀灭作用,且不污染环境,是一种很有前途的植物质杀虫剂.1998年受中国科学院昆明植物研究所委托,对由该所研制的0.5%印楝素乳油,以小菜蛾和菜粉蝶幼虫为对象进行室内毒力测定,现将试验结果简报如下.     

印楝果实成熟期调查及不同采收期印楝素含量的变化

印楝果实的成熟期较长,不同成熟期所采样品的百粒重、印楝素含量和印楝素产量也不相同,调查和实验结果显示：印楝果实的成熟期集中在7月初至9月中旬期间;早期样品的百粒重低而印楝索含量高,后期样品百粒重高而印楝素含量低,成熟率约30％时百粒重和印楝素含量基本稳定,印楝素产量在果实成熟后基本稳定;同一时期采摘的样品中,绿色果皮的样品印楝素含量和产量均高于黄色果皮的样品。     

国产印楝树皮中印楝素测试初报

用TLC法测知引入中国种植的印楝树皮中含有印楝素;用对印楝素有典型中毒反应的菜青虫、玉米螟所做的生物活性测定结果也表明树皮提取物中含有一定量的印楝素;用HPLC法测定印楝素含量为0.65mg/g干树皮。其结果有助于直接用印楝物质作为杀虫剂及印楝产物综合利用的研究。     

印楝素在贵州茶区防治茶小绿叶蝉药效试验

为进一步了解印楝素对贵州茶区茶树主要害虫的田间防治效果以及其对天敌、茶树植株的影响,以0.3%印楝素乳油和30%印楝油为供试药剂进行了田间试验。结果表明:这两种药剂在大田中单独施用后防治茶小绿叶蝉较为理想,最高防效可达91.82%~94.87%,同时速效性好,持效期长,可维持在14 d以上,且对茶树生长安全、对天敌亦无影响,推荐施用剂量分别为90和30 m L/667m2。     

印楝杀虫活性物质在植物中的系统性分布

总结了印楝素在植物中的系统性分布及印楝制剂在田间应用的作用和意义;指出印楝素可被植物吸收并在植物中呈系统性分布,其被植物根吸收后由茎向叶传导,叶片吸收的印楝素不向根和茎传导.     

基于SAS PROC MIXED的印楝品种印楝素质量分数稳定性

基于SAS PROC MIXED的印楝Azadirachta indica品种印楝素质量分数的稳定性,探索建立高效、科学的印楝品种印楝素质量分数稳定性的分析方法,探究稳定性类型和机制。在元阳、元江、元谋,7个印楝品种、单株小区、三重复、完全随机区组、多系受粉,运用HPLC技术分析种子印楝素组分质量分数,基于SAS软件PROC MIXED程序的Stability Variance,Finlay-Wilkinson,Eberhart-Russell,AMMI-1和Environmental Variance 5种模型,进行品种种子印楝素质量分数稳定性参数估计、品种效应差异性检验和稳定性参数寻优,用Akaike信息量准则（c_AIC）评价和选择最佳模型,推断稳定性类型和机制。结果表明:5种模型中Finlay-Wilkinson和AMMI-1模型的品种印楝素A和印楝素B质量分数的c_AIC值最小,均分别为-17.3和-5.8;7个品种的印楝素A和印楝素B质量分数的稳定性参数大小基本一致,稳定性排序分别为Wx0423 > Wx0416 > Dhg0507 >平均木（ck）> At0515 > Ld0505 > Ww0401和平均木（ck）> Wx0416 > Wx0423 > Dhg0507 > Ld0505 > Ww0401 > At0515;品种印楝素A和印楝素B质量分数的品种效应差异显著性分别为极显著（P < 0.01）和显著（P < 0.05）,证明品种印楝素A和印楝素B的稳定性随环境条件的变化会发生可预测的改变即动态稳定性,其遗传机制受遗传控制。Finlay-Wilkinson和AMMI-1适于印楝品种种子印楝素质量分数稳定性分析,而Stability Variance,Eberhart-Russell,Environmental Variance模型并不适用;品种印楝素A和印楝素B质量分数的稳定性均为动态稳定性,稳定性绝大部分依赖于个体缓冲性。多种模型分析基础上的稳定性综合评估更高效更科学。     

印楝素在甘蓝及土壤中的消解动态

【目的】甘蓝Brassica oleracea生长期施用w为0.3%的印楝素乳油,检测印楝素在甘蓝和土壤中的残留及消解动态。【方法】印楝素在0.05~5.00 mg·kg~(-1)水平范围内取0.1、0.5、1.0 mg·kg-1添加,样品中的印楝素经乙腈超声波辅助提取,弗罗里硅土固相萃取柱净化,高效液相色谱(HPLC)检测,外标法定量。【结果】印楝素在甘蓝中的平均回收率为88.52%~93.21%,相对标准偏差为2.75%~3.55%;在土壤中平均回收率为90.69%~93.32%,相对标准偏差为2.09%~3.46%。印楝素在甘蓝中的残留半衰期为0.89 d,在土壤中的残留半衰期为2.40 d。【结论】印楝素属易降解农药。该施药方法安全可靠,值得借鉴。     

外源鲨烯和茉莉酸甲酯对印楝素生物合成代谢网络的影响

基于广泛靶向代谢组技术,以印楝愈伤组织为材料,研究了外源鲨烯和茉莉酸甲酯(MeJ)处理对印楝素生物合成代谢网络的影响.通过饲喂印楝愈伤组织鲨烯和茉莉酸甲酯,结合超高效液相色谱和质谱分析手段,对饲喂处理后的印楝愈伤组织代谢物进行定性定量分析.结果 表明,MeJ和鲨烯显著影响印楝愈伤组织的代谢活动,MeJ处理后共检132种差异代谢物,包括52种初生代谢物和80种次生代谢物.MeJ调控有机酸、脂质、氨基酸以及黄酮类和酚类物质的代谢,抑制印楝素B、诺米林和葫芦素E的合成.鲨烯处理检出137种差异代谢物,32种代谢物表达上调.MeJ和鲨烯均显著促进印楝素A、Azadiradione、Nimbin和Salannin的合成,抑制印楝素B和D的合成.初步阐明了MeJ和鲨烯影响印楝素A合成的机制,即二者通过调控初级代谢途径,影响印楝素合成前体的供给;通过抑制固醇类物质的次生代谢,促使更多的前体进入印楝索A合成的代谢流,进而调控印楝素的生物合成.     

生态认知和社会化服务对农户农药减量施用行为的影响——基于重庆市水稻种植户的调研数据

为探究农户农药减量施用的影响机制,本研究基于重庆104份水稻种植农户样本数据,以农户的生态认知、社会化服务和政策激励为重要支撑,构建农户农药减量施用行为的影响机制及分析框架,并采用多元线性回归模型、泊松分布回归模型和中介效应分析模型对其进行实证检验。结果表明：社会化服务对农药减量施用有显著正向影响,通过购买社会化服务组织提供的农药减量技术措施可以显著减少农药施用量;生态认知对农药减量施用有显著正向影响,农户的生态认知水平越高,便会更愿意保护生态环境而减少农药施用;生态认知在社会化服务对农户农药减量施用行为的影响中起中介作用,社会化服务组织在推广宣传农药减量技术的过程中,可以向农户普及相关知识从而提高生态认知,有利于农药减量施用;社会化服务通过提升生态认知影响农户农药减量施用的中介效应被政策激励正向调节,政府开展实施的宣传教育、技术培训、价格补贴强化了农户生态认知对农药减量施用程度的正向影响。研究表明,完善社会化服务体系、提高生态认知水平以及着力落实农药减量施用政策激励可以作为推进农药减量化的重要思路。     

印楝素对min6细胞增殖及胰岛素分泌的影响

【目的】研究印楝素对min6细胞增殖、葡萄糖摄取及胰岛素分泌的影响,并探讨其作用机制。【方法】不同浓度印楝素处理min6细胞48 h,检测细胞增殖量。在5.5和25.0 mmol·L~(-1)葡萄糖条件下,检测印楝素处理细胞的葡萄糖摄取水平,胰岛素ELISA检测试剂盒检测细胞胰岛素的分泌。【结果】与对照组相比,在5.5和25.0mmol·L~(-1)葡萄糖条件下,印楝素均表现促进细胞增殖活性。印楝素处理下,与25.0 mmol·L~(-1)葡萄糖条件相比,5.5 mmol·L~(-1)葡萄糖表现出更显著地促进葡萄糖摄取和胰岛素分泌的作用。【结论】印楝素可能通过调控葡萄糖水平影响胰岛素的分泌。     

印楝制剂对西花蓟马的忌避作用

[目的]为更好的防治西花蓟马。[方法]分别用不同浓度的印楝乳油(0.3%)和印楝素(62.73%)对西花蓟马作室内和田间试验,研究不同印楝制剂对西花蓟马的忌避活性。[结果]2种药剂均对西花蓟马成虫有一定的忌避作用,随浓度的提高忌避率增大,都是选择性忌避效果好于非选择性忌避效果。选择性忌避试验中,12 mg/L的印楝乳油和印楝素忌避率都是在48 h时最高,分别为63.93%、64.52%。田间试验表明印楝乳油比印楝素的忌避效果要好,忌避率都是施药后第1天最大,第3天有所下降,第5天和第7天又升高,12 mg/L的印楝乳油和印楝素在第1天的忌避率分别为70.63%、58.33%。[结论]印楝制剂对西花蓟马均表现一定的忌避作用,印楝乳油比印楝素忌避效果好。