不同激活方式对小鼠卵母细胞孤雌胚形成及其发育的影响

为探讨不同激活方式对小鼠卵母细胞孤雌胚形成及其发育的影响,用乙醇、Ca-A23187、SrCl2、乙醇与6-DMAP和CB及Ca-A23187＋CHX＋CB分别对小鼠卵母细胞进行了激活处理。结果显示,7％乙醇激活小鼠卵母细胞时．以7min的激活效果及孤雌胚发育较好,以形成单倍体胚为主,桑囊胚发育率可达30.00％：用SrCl2激活小鼠卵母细胞时,6或10mmol／L为最佳处理浓度,激活后大部分为二倍孤雌胚,桑囊胚发育率可迭27．97％：以7％乙醇激活5min．再用2mmol／L 6-DMAP＋5μg／mL CB激活3h效果最佳,能形成1个原核,桑囊胚发育率高达38．64％。小鼠卵母细胞经乙醇或Ca-A23187、6-DMAP和CB等联合激活后能较好地发育。     

牛卵母细胞的去核与激活

比较了Ionomycin(离子霉素)和乙醇及其与其他物质的组合激活牛卵母细胞的效果,并研究了去核时间、细胞松弛素B、末期去核等对去核效率的影响。结果表明,配合使用6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)或放线菌酮(CHX)可显著提高Ionomycin或乙醇激活牛卵母细胞的效率,Ionomycin+6-DMAP激活的牛孤雌胚在8/16细胞之后的发育率明显高于乙醇+6-DMAP(或CHX)。牛卵母细胞的去核在成熟培养20h或之前进行效果较好,此时有较高比率的卵母细胞中第一极体与染色体位置靠近。牛卵母细胞在不含细胞松弛素B的操作液中可进行去核,但所得核移植胚胎的卵裂率明显下降,而对8/16细胞胚之后的发育没有明显影响。牛卵母细胞的末期去核率显著高于中期,二者核移植胚胎的早期发育率基本相同。     

不同化学激活方法及卵丘细胞层数对牛体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

为探索适宜的牛体外成熟卵母细胞孤雌激活方式,提高核移植效率及研究胚胎孤雌发育。研究比较了不同浓度的乙醇( EH)、离子霉素(ionomycin)、钙离子载体A23187与蛋白激酶抑制剂6-二甲氨基嘌呤(6-DMAP)、细胞松驰素(cytochalasin B, CCB)对牛卵母细胞激活发育的影响,并在相同条件下,比较了不同卵丘细胞层数对卵母细胞激活后胚胎发育能力的影响。结果表明: (1) 5 μmol·L-1 Ionomycin,10 μmol·L-1 A23187,7% EH分别联合2 mmol·L-1 6-DMAP,CCB均可以有效地激活牛孤雌胚,其中以Ionomycin＋6-DMAP+CCB组囊胚发育率极显著高于其他各组(P<0.01),并且激活液中CCB的存在对牛孤雌胚胎的发育有利;(2) 卵母细胞包被的卵丘细胞层数不同对卵母细胞成熟激活有显著的影响,卵丘细胞层数3～5层和多于6层的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)孤雌激活的分裂率和囊胚率分别为69.09%,31.58%和75.14%,38.85%,这2组之间差异不显著(P>0.05), 但其显著高于1～2层组与混合组(P< 0.05), 因此,这2组细胞是最佳的试验研究材料。     

6-二甲基氨基嘌呤对体外成熟山羊卵母细胞孤雌激活及发育的影响

体外成熟的山羊卵泡卵母细胞用7%的乙醇和5μmol/L的离子霉素刺激处理后,分别置于含2 mmol/L 6-二甲基氨基嘌呤(6-DMAP)和不含6-DMAP的培养液中培养4 h,研究6-DMAP对体外成熟山羊卵泡卵母细胞孤雌激活率、原核形成以及孤雌胚体外发育潜能的影响。结果表明:6-DMAP能显著提高山羊卵母细胞的激活率,乙醇 6-DMAP和离子霉素 6-DMAP处理卵母细胞激活率分别为75.6%和71.1%,均显著高于单独使用乙醇(54.3%)和离子霉素(56.8%)处理;显著抑制卵母细胞第二极体的排出,乙醇 6-DMAP和离子霉素 6-DMAP处理仅含1个极体的孤雌胚分别为90.3%和96.3%,显著高于单独使用乙醇(26.3%)离子霉素(33.3%)处理。孤雌胚体外培养7 d,乙醇 6-DMAP和离子霉素 6-DMAP处理4-细胞发育率为45.6%和47.9%,8-细胞孤雌胚发育率为25.0%和29.6%,桑/囊胚形成率为7.4%和9.9%,均显著高于单独使用乙醇和离子霉素处理(P<0.05)。     

不同激活剂对兔卵母细胞孤雌激活效果的研究

目的:探寻一种稳定有效的卵母细胞激活方法,为兔体细胞核移植提供实验基础。方法:兔超排后获得卵母细胞体外成熟22~24 h,经脱颗粒处理后采用不同激活剂和不同处理时间进行激活,体外培养5~7 d,观察胚胎发育与囊胚形成情况。结果:卵母细胞经过离子霉素作用5 min或者乙醇作用7 min均能被激活,但两者卵裂率、囊胚率都较低;乙醇和离子霉素分别与6-DMAP联合激活兔卵母细胞时,离子霉素+6-DMAP处理组卵裂率(73.7%)显著高于乙醇+6-DMAP处理组(38.5%,P<0.05);与离子霉素联合激活时,2.0 mmol/L的6-DMAP处理5.0 h时的卵裂率和囊胚率最高,达75.6%和45.5%。结论:激活方法对兔卵母细胞孤雌激活率的影响很大,不同激活剂的联合应用及激活剂的作用时间对兔卵母细胞的激活存在显著差异。     

不同化学激活方法对山羊卵母细胞激活效果的研究

激活是体细胞核移植技术的关键步骤。本研究对常用化学激活剂乙醇、钙离子载体A2 3187和离子霉素以及添加 6 二甲基氨基嘌呤 (6 Dimethylaminopurine ,6 DMAP)和放线菌酮 (cycloheximide ,CHX)对山羊卵母细胞的激活效果以及不同卵龄的卵母细胞激活后体外发育效果进行了比较。结果表明 :离子霉素处理组激活率显著高于乙醇和A2 3187处理组 (89.6 %vs 6 3.5 % ,6 8.7% ;P <0 .0 5 ) ;离子霉素 +6 -DMAP处理组激活率显著高于离子霉素 +CHX和离子霉素 +CHX +细胞松弛素D处理组 (90 .1%vs 5 8.9% ,6 3.7% ;P <0 .0 1) ;体外成熟 2 4、2 6、2 8h组桑椹胚率分别为 16 .0 %、2 0 .6 %和 33.3% ,30h组桑椹胚率下降 (13.8% )。以上结果说明 ,在本研究的激活条件下 ,山羊卵母细胞适宜的激活方法为 :成熟起始后 2 8h使用离子霉素和 6 DMAP进行联合激活。     

化学激活对猪体外成熟卵母细胞孤雌发育的影响

 探索了离子霉素结合细胞松驰素B（cytochalasin B, CB）、放线菌酮（cycloheximide, CHX）以及6-二甲基嘌呤（6-dimethylaminopurine, 6-DMAP）等化学物质，对猪卵母细胞激活后发育的影响。试验1，体外成熟卵母细胞分别用15、20、25、30 mol·L-1的离子霉素处理40 min或电激活（1.3 kV·cm-1，80 s,1次脉冲），结果表明，20 mol·L-1组的激活率（69.93±5.80）%显著高于15 mol·L-1组（P <0.05），但与其它各组差异不显著（P >0.05）。试验2，卵母细胞采用20 mol·L-1离子霉素分别激活10、20、30、40、50 min，再用2 mmol·L-1 6-DMAP处理6 h，其中，40 min组的卵裂率、囊胚率[（72.40±13.02）%、（25.37±11.43）%]较高，但与其它各组差异不显著（P >0.05）。试验3，卵母细胞经离子霉素（20 mol·L-1、40 min）激活后，分别用7.5 g·ml-1 CB、10 g·ml-1 CHX、2 mmol·L-1 6-DMAP、7.5 g·ml-1 CB +10 g·ml-1 CHX和7.5 g·ml-1 CB +2 mmol·L-1 6-DMAP处理6 h，2 mmol·L-16-DMAP组的激活率、卵裂率和囊胚率[（86.05±4.29）%、（61.77±8.10）%和（21.62±3.31）%] 显著高于7.5 g·ml-1 CB组（P <0.05）与另外几组差异不显著（P >0.05）。试验4，卵母细胞由离子霉素（20 mol·L-1、40 min）激活后，用2 mmol·L-1 6-DMAP分别处理3.5、5.5、7.5 h，5.5 h组的卵裂率和囊胚率[(66.59±14.36)%和(25.40±10.16)%]高于另外两组，但差异不显著（P >0.05）。结果表明，离子霉素（20 mol·L-1、40 min）+6-DMAP（2 mmol·L-1 、5.5 h）为最佳激活方案。离子霉素激活卵母细胞后，CB与CHX、6-DMAP的互作对卵子的发育有抑制作用。     

不同激活剂对兔卵母细胞孤雌激活效果的研究

目的:探寻一种稳定有效的卵母细胞激活方法,为兔体细胞核移植提供实验基础。方法:兔超排后获得卵母细胞体外成熟22²4 h,经脱颗粒处理后采用不同激活剂和不同处理时间进行激活,体外培养524 h,经脱颗粒处理后采用不同激活剂和不同处理时间进行激活,体外培养5⁷ d,观察胚胎发育与囊胚形成情况。结果:卵母细胞经过离子霉素作用5 min或者乙醇作用7 min均能被激活,但两者卵裂率、囊胚率都较低;乙醇和离子霉素分别与6-DMAP联合激活兔卵母细胞时,离子霉素+6-DMAP处理组卵裂率(73.7%)显著高于乙醇+6-DMAP处理组(38.5%,P<0.05);与离子霉素联合激活时,2.0 mmol/L的6-DMAP处理5.0 h时的卵裂率和囊胚率最高,达75.6%和45.5%。结论:激活方法对兔卵母细胞孤雌激活率的影响很大,不同激活剂的联合应用及激活剂的作用时间对兔卵母细胞的激活存在显著差异。     

猪卵母细胞不同孤雌激活方法的研究

通过对不同电激活参数的摸索,电激活和化学激活联合的研究,以确定适合于猪卵母细胞孤雌激活的最佳方案。结果表明,体外成熟猪卵母细胞在电场时程60μs,1次直流脉冲的条件下,电场强度1.6kV/cm时其卵裂率(88.68%)和桑葚胚率(81.13%)较其他各组高。在电场强度为1.6 kV/cm,1次直流脉冲的条件下,脉冲时程20μs时,卵母细胞卵裂率仅为75.38%,桑葚胚率为64.62%;40和80μs时,卵裂率分别是84.62%和77.17%;100μs时,卵母细胞的卵裂率和桑葚胚率都明显下降。在电场强度为1.6kV/cm,电场时程为60μs的条件下,2次电脉冲激活卵母细胞的卵裂率(87.50%)、桑葚胚率(81.25%)和1次电脉冲的卵裂率(88.68%)、桑葚胚率(80.13%)之间无显著性差异(P﹥0.05),但两者均显著高于3次电脉冲的卵裂率(72.50%)和桑葚胚率(70.27%)。成熟卵母细胞经电刺激(ES)后,分别用CB(7.5μg/mL)、CHX(10μg/mL)、6-DMAP(2 mmol/L)、CB(7.5μg/mL)+CHX(10μg/mL)、CB(7.5μg/mL)+6-DMAP(2 mmol/L)各自处理4 h,ES+CB+CHX和ES+CB+6-DMAP组卵裂率显著高于其他3组,但其桑葚胚率差异不显著。结果显示,电场强度为1.6 kV/cm,电场时程60μs,1次脉冲的电刺激对体外成熟的猪卵母细胞(IVM)孤雌激活效果最好;1次或2次电脉冲就足以激活猪卵母细胞,过高脉冲对细胞反而有伤害作用;电激活和化学激活联合应用可提高猪卵母细胞的卵裂率。     

电脉冲与化学激活联合处理对猪卵母细胞孤雌发育的影响

探讨了猪卵母细胞电激活后间隔不同时间用化学药物处理对猪卵母细胞孤雌发育的影响。结果表明 :1)电激活后间隔 0 ,3,4 ,5和 6h再分别用 6 二甲基氨基嘌呤 ( 6 Dimethylaminopurine ,6 DMAP)、放线菌酮 (cyclohex imide ,CHX)处理 6h ,各组卵裂率、囊胚细胞数差异不显著 (P >0 0 5 ) ,但在 6 DMAP组中对照组囊胚率极显著高于其余各组 (P <0 0 1) ,在CHX组中对照组囊胚率极显著高于间隔 5和 6h组 (P <0 0 1) ,而其余各组之间差异不显著 (P >0 0 5 ) ;2 )电激活后间隔 4h再分别用 6 DMAP ,CHX和细胞松弛素B(CytochalasinB ,CB) + 6 DMAP处理 6h ,各组卵裂率差异不显著 (P >0 0 5 ) ,对照组囊胚率极显著高于其余各组 (P <0 0 1) ,其余各组囊胚率显著性均无差异 (P >0 0 5 )。对照组中无单倍体囊胚 ,二倍体囊胚为 88 2 4 % ,但 6 DMAP ,CHX ,CB + 6 DMAP中产生的囊胚大部分是单倍体 ,且三者之间无显著性差异 (P >0 0 5 )。以上结果说明 ,猪卵母细胞电激活后间隔一段时间再用DMAP和CHX激活 ,激活作用随时间的延长而减弱 ;猪卵母细胞电激活后 4h再用 6 DMAP ,CHX ,CB + 6 DMAP激活 ,产生的囊胚大部分为单倍体 ,该方法适于猪卵母细胞ICSI的激活。     

Effects of Chemical Activation on the Parthenogenetic Development of Porcine in vitro Maturation Oocytes

The objective of this study was to determine the effects of ionomycin combined with cytochalasin B (CB), cycloheximide (CHX), or 6-dimethylaminopurine (6-DMAP) on the activation of porcine oocytes. In Experiment 1, in vitro matured oocytes were activated with 15,20,25 or 30 mmol L-1 ionomycin separately. Activation rates of 20,25 mmol L-1 and 30 mmol L-1 treatments were higher (P<0.05) than that of 15 mmol L-1 treatment. In Experiment 2, in vitro matured oocytes were activated with 20 mmol L-1 ionomycin for 10,20,30,40 or 50 min and then incubated with 2 mmol L-1 6-DMAP for 6 h.Cleavage and blastocyst rates [(72.40±13.02)％, (25.37±11.43)％] after treatments for 40 min were higher (P>0.05) thanthose of the other treatments. In Experiment 3, matured oocytes were activated with ionomycin and then incubated with 7.5 mgmL-1 CB, 10 mg mL-1 CHX, 2 mmol L-16-DMAP, 7.5 mg mL-1 CB + 10 mg mL-1 CHX or 7.5 mg mL-1 CB + 2 mmol L-1 6-DMAP for6 h. The rates of activation, cleavage and blastocyst of 2 mmol L-1 6-DMAP treatment [(86.05±4.29)％, (61.77±8.10)％ and(21.62±3.31)％] were higher (P<0.05) than those of 7.5 mg mL-1 CB treatment. In Experiment 4, matured oocytes wereactivated with ionomycin and then incubated with 2 mmol L-1 6-DMAP for 3.5, 5.5 or 7.5 h. Cleavage rates and blastocyst rates of 5.5 h treatment [(66.59±14.36)％ and (25.40±10.16)％] were higher (P>0.05) than those of other treatments. In conclusion, activation of porcine oocytes appears to be most successful using the combination of ionomycin (20 mmol L-1,40 min) followed by 6-DMAP (2 mmol L-1, 5.5 h).     

几种不同化学激活方法对牛卵母细胞孤雌激活的影响

为确定牛体细胞核移植胚胎的激活条件 ,比较了几种不同化学激活方法对牛卵母细胞激活的影响。选择明显具有第一极体的成熟卵母细胞 ,随机分为 9组 :1Ionomycin(I) +6 -甲氨基嘌呤 (D) (ID) ;2 I+D+细胞松弛素 B(CCB) (IDC) ;3I+放线菌酮 (X) (IX) ;4 I+X+CCB(IXC) ;5体积分数 7%乙醇 (E) +D(ED) ;6E+D+CCB(EDC) ;7E+X(EX) ;8E+X+CCB(EXC) ;9Sr2 + +CCB(SC)。Ionom ycin和乙醇的处理时间为 5min,6 - DMAP± CCB的处理时间为 4 h,放线菌酮± CCB的处理时间为 5 h,Sr2 + +CCB的处理时间为 10 h。培养36 h后 ,各组卵母细胞的卵裂率分别为 72 .0 % ,75 .5 % ,81.3% ,85 .1% ,81.7% ,82 .4 % ,74 .4 % ,78.1%和 5 1.0 % ;培养到 196 h时 ,各组的囊胚发育率分别为 18.2 % ,2 4 .5 % ,7.2 % ,11.9% ,11.1% ,19.4 % ,6 .7% ,12 .2 %和 2 .0 %。结果表明 ,在 10 mm ol/ L Sr2 +内培养 10 h不能有效地激活牛卵母细胞 ,Ionom ycin+6 - DMAP± CCB以及乙醇 +6 -DMAP+CCB结合使用可以有效地激活牛卵母细胞。Ionom ycin比乙醇对牛卵母细胞的激活作用强 ;6 - DMAP比CHX的激活效果好 ,激活液中 CCB的存在对牛孤雌胚胎的发育有利     

不同促精子活动剂对水牛卵母细胞体外受精及随后胚胎发育的影响

主要探讨精子活动促进剂对水牛Bubalus bubalis卵母细胞体外受精及随后胚胎发育的影响. 来自屠宰场水牛卵巢的卵母细胞和卵丘细胞复合体,在体积分数为5%CO2 的培养箱中培养24～26 h,然后通过体外受精测定其受精和胚胎发育能力. 试验1解冻的精子用50 g/mL的胰蛋白酶处理30 min,然后进行受精;试验2受精在含不同浓度咖啡因 (0, 2.5, 5.0 和 10.0 mmol/L)的受精液中进行;试验3在含不同浓度的钙离子载体A23187 (0, 0.1, 1.0 和 2.5 μmol/L)的受精液中进行体外受精;试验4在PHE、咖啡因和A23187不同组合(空白, PHE, PHE+2.5 mmol/L咖啡因+2.5 μmol/L A23187和PHE+2.5 μmol/L A23187) 的受精液中进行体外受精. 试验结果表明,精子用胰蛋白酶处理后的受精卵囊胚发育率显著下降 (12.5%和2.6%,P<0.05),而用咖啡因和钙离子载体A23187处理,对卵母细胞的卵裂率和囊胚发育率没有明显影响. 在体外受精中PHE和钙离子载体的组合使用能提高受精卵的胚胎发育率,而高浓度的咖啡因则降低卵母细胞的卵裂率和胚胎发育率.     

紫杉醇在猪体外成熟卵母细胞玻璃化冷冻中的作用探讨

使用1．00μmol／L紫杉醇预处理卵母细胞,冷冻后其形态完整率（89．93％）和FDA染色存活率（83．33％）均显著高于未处理组的79．12％和70．97％。不同预处理时间试验表明：预处理30min组冷冻后卵母细胞形态完整率和FDA染色存活率最高,分别达到90．21％和84．13％。预处理浓度1．0μmol／L,30min是比较合适的处理方法;紫杉醇、细胞松弛素B前处理能显著提高猪成熟卵母细胞的玻璃化冷冻的效果,但两者之间没有显著差异。     

仿刺参(Apostichopus japonicus )多倍体诱导的初步研究

报道了仿刺参（Apostichopus japonicus Liao）多倍体诱导的结果。采用经紫外线照射后的海水成功地使仿刺参分别单独产卵、排精，从而准确地控制了仿刺参的多倍体诱导的开始时间。使用0.2、0.4mg/L细胞松驰素B（CB）在授精后5、10min开始处理受精卵抑制第一极体（PB1）放出，用10、20、30、40mg/L的6－二甲基氨基嘌呤（6－DMAP）分别在授精后5、10、20、28、35min开始处理抑制受精卵PB1、第二极体（PB2)祚出的方法诱导了刺参的多倍体。研究了诱导的药物浓度、处理时间与诱导效果的关系，同时对幼体的成活率等进行了探讨。结果表明，2种药物均可诱导仿刺参产生三倍体和四倍体。采用CB抑制PB1诱导，到达下幼体时，可产生21.3％的四倍体。用6－DMAP抑制PB2放出诱导三倍体，三倍体率可达25.8%。以幼虫浮游期中，处理组和对照组幼虫的摄食、生长、浮游时间以及变态率等方面没有明显差异。     

孵育和激活剂作用时间对山羊核移植胚胎早期发育的影响

探讨了电融合前对重构卵继续孵育及激活剂6-DMAP不同作用时间对山羊核移植胚胎体外发育的影响。结果显示,重构卵在成熟液中继续培养后,9~10 h组的融合后卵子死亡率(27.42%)显著低于30 min和90 min组(49.26%和56.3%)(P0.05),胚胎卵裂率(68.15%)则显著高于30 min和90 min组(55.6%和54.24%)(P0.05);重构卵用离子霉素激活后,再用6-DMAP激活0 h、2 h、3 h、4 h、5 h及8~10 h,各组间的胚胎卵裂率均无显著差异(P0.05),但均显著高于未用6-DMAP组的卵裂率(P0.05)。本试验结果表明,电融合前,继续成熟培养重构卵有利于降低电融合时的卵子死亡率,提高卵子利用率;联合使用离子霉素和6-DMAP有利于提高激活效果,而6-DMAP的作用时间(2~10 h)不影响核移植胚胎的卵裂。     

VE对犬卵母细胞体外成熟的影响

在基础培养液中分别添加浓度为0,50,100,200μmol/L的VE,研究不同浓度VE对成熟情况的影响。结果表明,体外培养48h后VE浓度为50μmol/L组GV期的比率显著高于100和200μmol/L组(P<0.05);100μmol/L组GVBD期的比率显著低于其它组(P<0.05);达到MI-MII期的比率各组之间差异不显著(P>0.05),但100μmol/L组MI-MII期的比率相对较高。体外培养72h后,VE浓度为200μmol/L组的GV期的比率显著高于对照组和100μmol/L组(P<0.05),与50μmol/L组之间差异不显著(P>0.05);达到GVBD和MI-MII期的比率各组之间均差异不显著(P>0.05)。因此,VE对犬卵母细胞的核成熟没有明显促进作用。