脱氧雪腐镰刀菌烯醇降解菌的分离和鉴定

【目的】分离筛选能够降解脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)的细菌,以期能在该毒素的生物解毒处理中得到应用。【方法】用高产毒禾谷镰刀菌F-25接种灭菌的小麦籽粒,培养后获得DON毒素;然后以DON毒素为唯一碳源进行DON毒素降解菌的驯化富集培养,得到能够降解DON毒素的混合菌群,逐一对分离到的细菌进行DON毒素降解能力检测,得到能够降解DON毒素的菌株。【结果】筛选得到的菌株DDS-1对液体培养基中的DON毒素的降解能力达95%以上,显著高于其它菌株;从形态、生理生化特性以及16S rDNA序列进行分析,DDS-1菌株初步鉴定为徳沃斯氏菌Devosia sp.;把DDS-1添加到小麦饲料中后,饲料中的DON毒素降解率达到75.47%。【结论】选出的DON高效降解菌株徳沃斯氏菌,不但对液体培养基中的DON毒素具有很好的降解作用,对饲料中DON毒素也有很好的降解效果。这为真菌毒素的生物脱毒处理提供了可行的方法。     

一株纤维素降解菌的鉴定及其对饲料粗纤维的降解效果

【目的】对本课题组分离的一株纤维素降解菌进行鉴定,优化其产酶条件并检测其对饲料粗纤维的降解效果,以期为该菌在饲料粗纤维降解中的应用提供理论依据。【方法】通过菌株形态特征和16SrDNA序列分析鉴定了实验室分离保存的一株纤维降解菌;研究该菌所产纤维素酶的部分酶学性质和酶谱,并优化其产纤维素酶的条件;利用体外发酵和尼龙袋法测定菌株N3所产粗酶液对3种饲料(麸皮、麦草、燕麦)粗纤维的降解率;利用RB亮蓝脱色试验检测该菌的木质素降解能力。【结果】经鉴定,该菌株为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis N3;N3菌株不产生漆酶,主要向胞外分泌分子质量70ku以上的纤维素酶组分;N3菌株所产纤维素酶的最适反应温度和pH分别为60℃和5.5;N3菌株以体积比1∶50接种至最适发酵培养基(碳源为麸皮、氮源为蛋白胨,初始pH为5),37℃培养24h时,所产纤维素酶活性最高,可达3.50U/mL;菌株N3所产粗酶液对麸皮的粗纤维降解率最高,对麦草秸秆的粗纤维降解率最低。【结论】分离到的纤维降解菌Bacillus subtilis N3主要分泌分子质量70ku以上、耐热的纤维素酶,对饲料粗纤维具有较强的降解能力。     

漆斑菌发酵产胆红素氧化酶及其对酸性靛蓝脱色的研究

[目的]提高漆斑菌（Myrothecium sp.IMER1）产胆红素氧化酶产量,并研究其酶液对酸性靛蓝脱色性能。[方法]筛选合适的产酶培养基,研究外加碳源、温度、pH值等条件对产酶量的影响。提取粗酶液并对酸性靛蓝进行了脱色研究,用紫外-可见分光光度计扫描其在200~800 nm波长的变化。[结果]漆斑菌在PDB培养基上生长良好且产酶量最大;当以PDB培养基为基本培养基时,葡萄糖是其产酶的最适外加碳源,该菌最适产酶的温度和pH值分别是28℃和7.0。该酶在2 h内对酸性靛蓝脱色率可达到82%,酸性靛蓝降解液的扫描光谱图证实了染料分子的结构受到了破坏。[结论]试验结果为提高胆红素氧化酶产量提供了试验依据,证实了该酶在印染废水的脱色净化处理中具有潜在的应用前景。     

蜜蜂球囊菌几种胞外蛋白酶的特性

 【目的】研究由蜜蜂球囊菌引起的真菌性疾病白垩病的侵染机制,以及蜜蜂球囊菌胞外蛋白酶的种类及其特性。【方法】利用人工合成的培养基,在体外诱导蜜蜂球囊菌分泌胞外蛋白酶,用硫酸铵沉淀和透析,获得初酶液,利用相应的底物对酪蛋白酶、偶氮酪蛋白酶、胶原蛋白酶、弹性蛋白酶和胰蛋白酶的活力进行测定。【结果】蜜蜂球囊菌分泌的胞外酶主要有酪蛋白酶、偶氮酪蛋白酶、胶原蛋白酶3种,无弹性蛋白酶和胰蛋白酶。对这3种酶的最适温度、pH值以及热稳定性和酸碱稳定性进行了测定。这3种胞外酶的最适反应温度都在40℃左右,最适pH为7左右,均不耐高温,热稳定性差,在中性的pH环境下比较稳定。【结论】蜜蜂球囊菌可以分泌多种胞外蛋白酶,它们的最适pH和温度与蜜蜂消化道内的环境一致。     

中华寿桃多酚氧化酶的特性研究

 【目的】对分离纯化后的中华寿桃果肉多酚氧化酶的酶学性质进行研究,探讨中华寿桃果肉褐变机理。【方法】以邻苯二酚为作用底物,用分光光度法在420 nm下测定不同pH、反应温度、底物浓度条件下桃果肉的多酚氧化酶（PPO）活性。【结果】中华寿桃果肉66 kD的PPO最适pH约为6.5,最适反应温度为60℃左右,该酶对温度有较强稳定性;该酶最适作用底物为绿原酸、儿茶酚和对羟基苯甲酸;FeSO4、EDTA和抗坏血酸等化合物可以抑制PPO活性,CaCl2、CuSO4和MnSO4等则起促进作用。【结论】该酶耐热能力强,适度低温、酸性条件、抗坏血酸处理等可以抑制该酶活性。     

产纤维素酶海洋细菌的筛选鉴定和产酶条件优化

从宁波洋沙山海域采集样品,通过刚果红染色法共筛选到23株具有纤维素分解能力的菌株。根据复筛结果,选择其中一株高产碱性纤维素酶的海洋细菌MB117进行深入研究。经16S rDNA鉴定,MB117为交替假单胞菌属（Pseudoalteromonas sp.）细菌。发酵条件研究结果表明,MB117菌株培养的最适pH为7.0,1%接种量和10%装液量最利于产酶,低温有助于菌体生长和产酶。酶学性质研究结果表明,酶反应的最适pH为9.0,pH 7.0~10.0范围内酶活力均可保持在85%以上;MB117菌株CMCase不耐高温,酶最适反应温度为40 ℃。     

苦马豆素降解酶的酶促降解特性

【目的】研究苦马豆素(Swainsonine,SW)降解酶的酶促降解特性。【方法】应用渗透休克原理,提取SW降解菌株YLZZ-1粗酶液,进行酶促降解研究,并考察SW降解酶的酶活力、动力学参数及稳定性。【结果】YLZZ-1菌株的胞内粗酶液对SW的降解率高达91.73%。SW降解酶对SW酶促降解的最适pH为8.0,最适温度为30℃,在pH6.0~8.5、温度25~45℃具有较好的降解活性,其米氏常数Km为0.073 98 mmol/L,最大反应速度Vmax为0.111 5μmol/(mg.min)。SW降解酶有较好的pH稳定性,但对热不稳定。【结论】菌株YLZZ-1的SW降解酶属于胞内诱导酶,具有良好的降解能力。     

皂苷鼠李糖苷酶RhaG和RhaD的酶反应特性研究

[目的]研究皂苷鼠李糖苷酶RhaG和RhaD的酶反应特性。[方法]对微生物Absidia sp.G3g菌产的人参皂苷糖苷酶（RhaG）和Absidia sp.D0d菌产的薯蓣皂苷糖苷酶（RhaD）分别进行分离纯化,并对2种提纯酶的分子量和酶性质进行了研究。[结果]RhaG和RhaD的酶蛋白分子质量分别为61、56 kDa。RhaG的酶反应最适pH为5.0,pH稳定范围为3.0～7.0;最适温度为40℃,30～60℃温度稳定性较好;米式常数Km为9.523 mmol/L。RhaD的酶反应最适pH为5.0,pH稳定范围为3.0～7.0;最适温度为40℃,30～50℃温度稳定性较好;米式常数Km为8.834 mmol/L。[结论]该研究为进一步探明2种酶间的差别奠定了基础。     

阴沟肠杆菌WJ-1中甲氰菊酯降解酶基因pytZ的克隆、表达和重组酶特性研究

【目的】农药降解酶通常比农药降解菌更能耐受异常环境,具有更宽广的降解谱。为获得高产率和高质量的农药降解酶,在实验室前期获得阴沟肠杆菌WJ-1和证实具有农药降解酶基因pytZ的基础上,本研究拟将阴沟肠杆菌WJ-1农药降解酶基因pytZ重组表达于受体菌Escherichia coli BL21。并对重组菌农药降解酶的生理生化特性进行深入研究。【方法】通过PCR技术扩增获得阴沟肠杆菌WJ-1农药降解酶基因pytZ,构建pMD19重组质粒,再与pET-24a(K+)表达载体进行连接,构建基因工程菌E.coli BL21/pET-24a(K+)-pytZ。将重组菌进行摇瓶培养。使用不同温度、pH值、IPTG浓度探讨重组酶酶促反应动力学参数。【结果】获取得到基因工程菌E.coli BL21/pET-24a(K+)-pytZ。30℃和IPTG诱导浓度为0.8 mmol/L时,摇瓶培养48 h后可以获得最高的农药降解酶产量,酶活力达到15.3 U/mL。重组菌农药降解酶的酶促反应最优温度为35℃,25～45℃热稳定良好;重组菌农药降解酶的酶促反应最优pH值为8.0,pH 7.0～9.0酸碱稳定良好;重组菌农药降解酶对底物甲氰菊酯的反应动力学参数,米氏常数K_m为0.076 mmol/L,最大反应速率V_(max)为3.023 mmol/(L·min)。【结论】利用基因工程菌Escherichia coli BL21/pET-24a(K+)-pytZ生产得到更大量的甲氰菊酯降解酶,纯度更高,具有更好的温度和pH值适应性,反应动力学参数显示其降解效率更高。     

纤维素降解菌协同效应与粗酶液影响因素

高效微生物菌系和适宜反应条件是纤维素生物转化的关键。试验以前期分离获得的纤维素降解菌为基础,研究了降解菌之间的协同效应和粗酶液性质。结果表明,降解菌之间存在协同效应,其中X2与X5混合培养产酶能力达到了0.66 U.mL-1,比单一降解菌酶活力提高了将近1倍;其粗酶液最适反应温度和pH值为25℃和5.0;金属离子络合剂EDTA对酶活力的抑制效果较为明显;Ca2+和Mn2+是粗酶液的激活剂,在研究浓度范围内能够显著提升酶活力。研究结果为纤维素的生物转化提供了重要种质资源和技术参数。     

无核白葡萄多酚氧化酶的酶学特性

【目的】研究无核白葡萄多酚氧化酶（PPO）的酶学特性,为无核白葡萄干加工过程中褐变问题的解决和控制提供参考。【方法】利用McIlvaine缓冲液从无核白葡萄中提取PPO,研究了反应温度、pH、底物浓度、酶液用量对其催化活性的影响,并考察了该酶在不同温度条件下的稳定性,分析了其催化邻苯二酚的催化动力学方程及其参数。【结果】以10 mmol/L的邻苯二酚McIlvaine溶液为底物时,无核白葡萄PPO的最适作用温度为25 ℃,最适反应pH为6.0。在最适作用条件下,米氏常数（K_m）和最大反应速率（V_max）分别为45 mmol/L和500 U/min。该酶在温度低于25 ℃时,能在60 min内保持较稳定的活性,30～60 ℃的高温处理只能破坏其部分活性,在70 ℃条件下保温处理10 min可使其活性全部丧失。【结论】高温短时处理能够破坏无核白葡萄的PPO活性,因此高温处理可在葡萄干加工的前处理中推广应用。     

绿盲蝽水溶性海藻糖酶ALTre-1基因原核表达、 纯化与酶学特性

【目的】在前期克隆了绿盲蝽水溶性海藻糖酶（ALTre-1）基因的基础上,以获得具有酶活性的重组蛋白,明确酶促反应的最佳pH值及最适温度,为绿盲蝽海藻糖酶分子调控机制及其抑制剂的应用研究奠定基础。【方法】将含有绿盲蝽ALTre-1基因的T载体经Nde I和Not I双酶切,构建ALTre-1基因原核表达载体（pET28a-ALTre-1）,表达载体经诱导表达和蛋白纯化,获得ALTre-1功能区纯化蛋白。在蛋白浓度为0.3 mg•mL-1的条件下,以海藻糖为底物,对纯化得到的重组Tre-1蛋白进行活性检测,确定其酶促反应的最佳pH值和最佳温度。【结果】ALTre-1基因在大肠杆菌中BL21中能够高效表达,纯化获得的重组蛋白在试验条件下有较高的海藻糖酶水解活性（（184.83±13.39）nmol•μg-1•min-1）。重组ALTre-1蛋白活性最适pH值为7.0（酶活性为（202.04±13.76）nmol•μg-1•min-1）,表明重组ALTre-1蛋白是1个在中性环境中具有最佳活性的海藻糖酶,同时重组ALTre-1蛋白酶活性最适温度为55℃（酶活性为（228.59±4.62）nmol•μg-1•min-1）。【结论】本研究克隆得到了ALTre-1全长基因,获得了具有海藻糖酶活的重组蛋白,该重组蛋白在pH 7.0、温度55℃条件下酶活性最高。     

赛买提杏多酚氧化酶特性的研究

[目的]多酚氧化酶(PPO)会对杏加工生产产生重大影响,它不仅影响杏加工产品如杏酱等的色泽,而且也影响其品质,特别是在制作杏茶、杏汁饮料的过程中更为突出.所以,准确测定PPO活性,具有重要的生理和现实意义.[方法]以新疆主栽赛买提鲜杏为原料,对杏组织中PPO的特性进行了研究.[结果]杏多酚氧化酶最适反应pH为6.0,最适反应温度为25℃;杏多酚氧化酶的最适反应波长为400 nm,最适反应时间为6 min,当酶加入量为0.4 mL时,酶活性最大;60～80℃处理10 min,酶基本失活.[结论]丙酮粉与pH为6.0的磷酸缓冲液反应6 min,离心后制得粗酶液;一定量的磷酸缓冲液和邻苯二酚在25℃下保温10 min,添加0.4 mL酶液,在400 nm波长下,测定的PPO活性较为准确.     

水酶法提取扁桃仁油工艺的研究

[目的]采用水酶法提取扁桃仁油.[方法]采用单因素试验和正交试验,研究单一酶和复合酶种类及浓度、酶解时间、酶解温度、酶解pH、料液比对出油率的影响.[结果]水酶法提取扁桃仁油的最佳工艺条件为:采用由果胶酶、纤维素酶和木瓜蛋白酶组成的复合酶,酶解温度55℃,酶解时间3h,酶浓度2;,酶解pH7.0、料液比1∶4,在此条件下出油率达77.31;.[结论]单一酶中碱性蛋白酶,复合酶中果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶的组合对扁桃仁油的提取率最高;复合酶的出油率比单一酶高.     

高产碱性纤维素酶细菌的筛选鉴定及其酶学特性与发酵条件研究

【目的】从自然环境中分离筛选高产纤维素酶的菌株,开展碱性纤维素酶的酶学特性分析,为该菌株及所产纤维素酶的综合开发利用打下基础。【方法】采用羧甲基纤维素钠（CMC_Na）平板筛选法筛选纤维素酶高产菌株,利用生理生化分析结合分子生物学法对菌株进行鉴定,并通过3, 5-二硝基水杨酸（DNS）法研究其活性特征与发酵条件。【结果】在长期覆盖枯树叶的土壤中分离获得1株高产碱性纤维素酶的菌株,经鉴定该菌株为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）,名称为B. cereus strain CQNUX 3-1。酶活性分析显示该菌株胞外分泌液具有内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶及β-葡萄糖苷酶的活性,其酶活力分别达107.7、33.1和155.6 U/mL。酶学特征分析表明3种酶组分均具有较好的耐碱和一定的耐高温能力。其中,内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的最佳反应温度分别为70、60和40℃;最佳反应pH分别为8.0、9.0和9.0;Fe3+能增加3种酶的酶活力,而β-葡萄糖苷酶具有较好的EDTA、尿素和Cu2+耐受性。发酵条件对菌株产酶的分析结果表明,该菌株发酵温度在37℃较适宜;发酵第4 d时的酶活力达最大值;该菌株能在碱性发酵环境下生长并产酶,在初始pH为7.0时发酵酶活力最高。【结论】筛选获得的纤维素酶高产菌株B. cereus strain CQNUX 3-1所生产的纤维素酶具有较高的反应温度适用性和较强的碱耐受性,菌株发酵产酶温度适中,且有较宽的发酵pH适用范围,可作为碱性纤维素酶生产资源菌株,具有应用于纤维素酶制剂制备与生产、纤维素资源综合利用等领域的潜力。     

牡丹多酚氧化酶的酶学特性

【目的】研究影响牡丹试管苗多酚氧化酶（PPO）酶学特性的因素,为牡丹的高效组培提供参考。【方法】以牡丹品种“乌龙捧盛”为供试材料,采用分光光度计比色法,研究温度、pH值、PPO提取液添加量及底物的类型和浓度对牡丹PPO活性的影响。【结果】以邻苯二酚为底物时,牡丹PPO的最适反应温度与最适pH分别为25 ℃和6.0,最适PPO提取液添加量为1 mL。牡丹PPO的最适作用底物为咖啡酸,其最适浓度为0.08 mol/L。【结论】通过选择合适的pH值和培养温度,同时结合化学抑制剂调控牡丹PPO活性,可以达到在牡丹组织培养中减少褐化现象、提高试管苗生根率的目的。     

一株碱性高温α-淀粉酶产生菌的分离鉴定及其酶学性质初步研究

[目的]从乌鲁木齐地区啤酒厂、面粉厂、酱醋厂等地采集的酒渣、麸皮和酱渣中筛选淀粉酶产生菌.[方法]筛选采用可溶性淀粉培养基和K-KI染色;酶活测定采用硝基水杨酸法;菌株鉴定使用法国梅里埃细菌自动鉴定仪.[结果]得到9株酶活较高的淀粉酶产生菌,其中1株编号为A-1的菌株酶活最高达28.17 U/mL,生理生化反应鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus.subtilis );并对其酶学性质研究表明,该淀粉酶的最适温度为90℃,最适pH为8.0,最适碳源为玉米粉,最适氮源为黄豆粉.[结论]该菌株为碱性高温淀粉酶产生菌.     

一株棉秆纤维素分解真菌的分离筛选及酶学性质研究

[目的]对从棉秆腐解物中筛选得到的高效棉秆分解真菌SJ-1进行纤维素酶酶学性质的研究.[方法]研究温度、pH、金属离子对纤维素酶活力的影响,并以Lineweaver -Burk作图法测定酶促反应米氏常数Km及最大反应速率Vmax.[结果]该菌株CMCase和FPase的最适反应温度在50～60℃,最适pH为7.0,有较好的耐高温及耐碱能力.K+、Fe2对酶活有显著的激活作用,而Cu2+、Mg2+、Ca2+、Al3+等有一定的抑制作用,其中Al3的抑制作用较为强烈,Cu2+对FPase抑制较强,Mn2-对FPase有激活作用而对CMCase有抑制作用,Zn2对酶活性无明显影响.以CMC - Na做底物时酶反应的Km为2.69 mg/mL,Vmax为0.53 mg/( mL·min).[结论]菌株SJ-1的纤维素酶性质较为优良,为进一步进行菌株的选育与改造提供参考依据.     

美国白蛾几丁质脱乙酰酶的克隆、表达及酶学性质

【目的】研究美国白蛾(Hyphantria cunea)几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase,CDA)基因的酶学性质,了解其在昆虫生命过程中如何发挥功能,为美国白蛾的生物防治提供新靶标。【方法】对家蚕(Bombyxmori)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)和云杉卷夜蛾(Choristoneura fumiferana)3种鳞翅目昆虫的几丁质脱乙酰酶2序列保守域进行分析,采用同源比对方法,设计几丁质脱乙酰酶2基因特异引物,利用PCR扩增该基因全长c DNA序列;构建原核重组表达载体p ET30a-Hc CDA2,克隆获得编码美国白蛾Hc CDA2的基因,IPTG诱导蛋白表达,SDS-PAGE电泳检测;构建重组杆状病毒表达载体p Fast Bac-Hc CDA1和p Fast Bac-Hc CDA2,脂质体转染法转染昆虫细胞Hi5,分别获得P1、P2、P3病毒,收集P3病毒上清,得到美国白蛾Hc CDA1(前期研究所得)和Hc CDA2重组蛋白,Western blot分析;重组蛋白Hc CDA1和Hc CDA2经硫酸铵粗纯化后,以对硝基乙酰苯胺为底物,测定重组几丁质脱乙酰酶Hc CDA12的酶活力,对其最适反应温度、最适p H以及金属离子的影响等酶学性质进行研究。【结果】获得了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因全长c DNA序列,命名为Hc CDA2(Gen Bank登录号:KT781841),基因全长1.6 kb,该基因在大肠杆菌中成功表达61 kD目的蛋白,免疫家兔获得Hc CDA2蛋白的特异性多克隆抗体。Western blot分析结果表明,Hc CDA1和Hc CDA2在昆虫细胞(Hi5)中均成功表达约80 k D蛋白。酶学性质研究表明,昆虫细胞中分泌表达的Hc CDA1和Hc CDA2均具有催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,当温度达到80℃时,Hc CDA2几乎失去酶活力;Hc CDA1酶促反应适宜的p H范围为7.0—9.0,并且Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应的最适p H均为8.0;在最适反应条件下,Hc CDA2蛋白酶活力均高于Hc CDA1蛋白酶活力;Mg~(2+)、Zn~(2+)、Mn~(2+)和Ca~(2+)对Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应整体呈抑制趋势,随浓度增大,Zn~(2)+对Hc CDA1抑制作用逐渐增强,而Mg~(2+)对Hc CDA1的抑制作用则呈现先升高后降低的趋势,而且Mg~(2+)和Ca~(2+)对Hc CDA2的抑制作用也是呈现先升高后降低的趋势。Co~(2+)和Fe~(2+)对Hc CDA1和Hc CDA2酶促反应有激活作用,随浓度增大,Fe~(2+)激活作用越强,而Co~(2+)激活作用则呈现先升高后降低的趋势。【结论】克隆了编码美国白蛾几丁质脱乙酰酶2基因(Hc CDA2),在原核细胞中表达61 k D目的蛋白,免疫家兔获得Hc CDA2蛋白的特异性抗体。得到具有活性的美国白蛾几丁质脱乙酰酶Hc CDA1和Hc CDA2,两者在体外均检测到催化活性,两种酶的最适反应温度均为50℃,最适pH均为8.0。