转录因子MoOaf22对稻瘟病菌营养生长、细胞壁完整性和胁迫应答的调控

为了研究油酸激活型转录因子MoOaf22编码基因MoOAF22(MGG_03413)在稻瘟病菌生长发育及致病过程中的功能,利用基因敲除方法将其进行了缺失突变并对突变体进行了一系列的生物学表型分析。结果表明该基因缺失突变体在完全培养基(CM)上营养生长加快,但在基本培养基(MM)上生长变慢,同时该突变体原生质体释放速度变慢,对荧光增白剂(CFW)和刚果红(Congo Red)耐受性增强,对十二烷基磺酸钠(SDS)、氯化钠(Na Cl)和山梨醇(Sorbitol)敏感,但该突变体在产孢量、附着胞形成及致病性等方面较野生型没有明显变化。说明MoOaf22在稻瘟病菌的营养生长、细胞壁完整性和对外界的胁迫应答过程中具有重要的调控作用。     

Rho型GTPase激活蛋白MoBem2在稻瘟病菌分生孢子形态建成中的功能

为了研究Rho型GTPase激活蛋白编码基因MoBEM2(MGG_09303)在稻瘟病菌致病过程中的作用,利用基因敲除方法进行了缺失突变。结果显示该基因缺失突变体产孢量显著下降40%左右,利用荧光增白剂(CFW)染色发现孢子形状变得畸形,形成单个隔膜孢子,约为40%左右,而野生型超过90%均为正常孢子;另外,该基因的缺失导致突变体在培养8 h时附着胞形成率显著下降,随着时间的延长,突变体附着胞形成率逐渐上升到野生型程度。可见,Mo Bem2蛋白调控稻瘟病菌分生孢子的形态建成,延缓分生孢子萌发过程中附着胞的形成,但对稻瘟病菌的致病性没有影响。     

稻瘟病菌MoZds1的功能分析

由稻瘟病菌引起的水稻稻瘟病对中国水稻产量造成了严重威胁,开展稻瘟病菌功能基因的研究有利于更好地了解稻瘟病菌致病机制,为稻瘟病的防治奠定基础。研究前期通过遗传学手段在稻瘟病菌中筛选到一个酵母ZDS1同源基因MoZDS1。通过基因敲除方法成功获得基因缺失突变体ΔMozds1,发现缺失MoZDS1严重影响稻瘟病菌营养生长。为探究MoZds1在稻瘟病菌中的具体功能,通过生物信息学分析、生长测定、产孢量分析、细胞壁胁迫分析以及自噬流检测等方法,分析了MoZds1在维持营养生长、产孢、应对细胞壁胁迫以及细胞自噬方面的作用。结果表明,MoZds1正调控稻瘟病菌菌丝生长,负调控孢子的形成。此外,MoZds1参与细胞壁完整性途径并调控孢子内糖原的降解速率,然而,MoZds1的缺失未表现出对细胞自噬途径的显著影响。该研究对稻瘟病菌MoZds1的功能进行了系统地分析,或为后续更深入研究MoZds1的功能提供了理论基础。     

轮枝镰孢菌FvST12基因敲除载体的构建及功能分析

[目的]鉴定并分析轮枝镰孢菌中 STE12 类转录因子的基因功能.[方法]以尖孢镰孢菌转录因子Fost12蛋白为靶序列,在轮枝镰孢菌基因组数据库中进行BlastP搜索,发现一个与Fost12蛋白同源性高达98%的基因,命名为FvST12.基于Double-Joint PCR技术,构建该基因的敲除载体,通过真菌原生质体转化及筛选获得基因敲除突变体,并对突变体的表型及致病性进行系统分析,以明确该基因的功能.[结果l突变体在生长速率、菌落形态,产孢量以及高渗和氧化等逆境胁迫反应上与野生型无显著差异;致病性分析表明,突变体致病力明显下降.[结论]轮枝镰孢菌FvST12对致病性起重要调控作用,但不参与营养生长、产孢和高渗和氧化胁迫等逆境反应.     

烟草赤星病菌AabHLH1基因的克隆及功能分析

碱性螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix,b HLH)转录因子是真核生物中高度保守的一类转录因子,参与调控多种植物致病真菌的生长发育、外界胁迫应答反应和致病力等过程。本研究从烟草赤星病菌链格孢中克隆了一个bHLH1类型转录因子基因,命名为AabHLH1。该基因编码区全长1 650 bp,无内含子,编码蛋白含549个氨基酸。利用同源重组方法获得了该基因的插入突变体M1,M1菌落在PDA上呈浅褐色,边缘白色;气生菌丝较野生菌株(WT)稍弱,镜检可见部分菌丝弯曲明显,产孢量降低,且分生孢子萌发时间推迟,萌发率较WT降低56. 12%;黑色素含量降低,毒素致病力明显降低,致病性明显减弱。由此可见,AabHLH1基因参与调控链格孢的生长、产孢和孢子萌发、黑色素和毒素产生以及致病性等过程。     

MoFbc1调控稻瘟病菌生长与致病机制初探

真核生物体内,F-box蛋白作为泛素连接酶复合物(Skp1-Cullin1-F-box,SCF)的调节亚基,参与降解底物的特异性识别。为探究F-box家族基因MoFbc1在稻瘟病菌生长发育及侵染致病中的功能,采用生物信息学方法分析Mo Fbc1蛋白结构域并构建进化树。利用同源重组方法获得MoFbc1基因敲除及其回补菌株并进行表型分析。结果表明,MoFbc1敲除菌株在产孢、附着胞形成及致病性等方面与野生型菌株均无显著差异。但其在MM和RDC培养基上生长速率下降,表明MoFbc1基因可能参与调控稻瘟病菌对部分营养物质的利用;突变体对细胞壁胁迫因子CFW、CR敏感,提示其细胞壁结构可能发生改变。结果为进一步揭示基因MoFbc1调控稻瘟病菌生长发育机制奠定基础。     

GCK家族蛋白激酶MoSOK1调控稻瘟病菌的生长发育与致病性

稻瘟病菌致病相关基因功能的研究有助于揭示其致病机理,为稻瘟病防治提供理论依据。本研究利用基因替换技术对稻瘟病菌SOK1同源基因(MoSOK1)进行了分析。MoSOK1编码GCK(germinal center kinase)家族的Ste20蛋白激酶,其与全蚀病菌中对应蛋白具有最高同源性。本研究表明,MoSOK1基因在附着胞分化关键期上调表达;与野生型菌株相比,MoSOK1基因缺失突变体菌落颜色加深,气生菌丝减少,生长速度变慢,产孢量下降,分生孢子萌发延迟,致病性降低。另外,交配实验表明,MoSOK1基因缺失突变体能够进行交配,但产子囊壳能力降低。本研究初步表明,MoSOK1基因参与稻瘟病菌生长发育和致病过程。     

灰葡萄孢菌BCRho3基因的生物信息学分析

利用生物信息学方法,对灰霉病菌中BCRho3 基因的理化性质、亲疏水性、信号肽、亚细胞定位、结构及功能等进行预测研究,同时构建BCRho3 同源基因的系统发育树,为下一步功能研究提供参考。结果表明,BCRho3基因编码产物为亲水性蛋白,不具有信号肽和跨膜结构,二级结构以琢-螺旋和无规则卷曲为主,主要在细胞质中发挥生物学作用。序列分析表明,BCRho3 基因编码产物可能作为生长因子来发挥作用,同时参与转录及转录调控过程,可能在产孢等生长发育过程中具有调节作用,因此可能在灰霉病的致病性中起关键作用。Rho3 基因编码产物同源性及进化树表明,灰霉病菌BCRho3 基因编码产物与核盘菌、杨盘二孢菌等菌种的Rho3 基因编码产物具有高度的同源性袁遗传距离较近。     

胶孢炭疽菌CgRGS4调控营养生长、渗透压响应、氧化应激反应和致病性

G蛋白信号调控因子(regulators of G-protein signaling,RGS)是G蛋白的一类负调控因子,在植物病原真菌生长发育及致病过程中起着重要的作用,然而目前还未有关于胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)RGS蛋白生物学功能的研究。试验利用PCR技术扩增了胶孢炭疽菌的CgRGS4基因,通过同源重组的方法获得CgRGS4基因的敲除突变体,通过表型分析初步确定了CgRGS4的生物学功能。结果表明,CgRGS4编码一个1 224个氨基酸的蛋白,包含RGS、PXA和PX功能域,该基因敲除突变体在营养相对贫瘠的条件下生长较野生型缓慢,对高渗透胁迫的耐受性增强,黑色素减少,对H_2O_2更加敏感,胞外漆酶及过氧化氢酶活性降低以及致病性减弱。由此可见,CgRGS4参与调控胶孢炭疽菌的营养生长、渗透压响应、氧化应激反应和致病性等多个过程。     

稻瘟病菌致病机制及无毒基因的研究进展

介绍了国内外近年来关于稻瘟病菌致病机制、有性世代、无毒基因分析，重要功能基因克隆以及稻瘟病菌产孢遗传规律的研究进展和成果。     

稻瘟菌Rac1蛋白的原核表达与纯化

Ras相关的C3肉毒素底物1(Rac1)是Rho族蛋白主要成员,在稻瘟菌(Magnaporthe oryzae)的侵染致病过程中发挥重要作用.本研究目的是采用结构生物学的方法进一步探究Rac1结构与功能以及与其他蛋白互作的机制,进一步阐释其致病机制.试验以稻瘟菌的cDNA为模板,根据Ras相关的C3肉毒素底物1基因(MoRac1)序列设计特异性引物进行PCR扩增,克隆了MoRac1基因并构建原核表达载体pHAT2-Rac1,异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达.SDS-PAGE检测与Western blot分析表明,pHAT2-Rac1在BL21(DE3)中表达,大小为25kD.通过亲和层析、离子交换与分子筛对重组蛋白进行纯化,获得了高纯度的目的蛋白.该蛋白的表达与纯化对其结构功能的研究奠定了基础.     

辣椒CaROPGEF1 cDNA的分离及其结构和表达的初步分析

ROP是植物特有的一类Rho相关GTPases,在植物体内通过GTP结合形式与GDP结合形式的切换而对生长发育和适应环境起调节作用.由GTP结合形式向GDP结合形式的转换主要依赖于鸟苷酸交换因子(guanine nucleotide exchangefactor,GEF).本文以锁定于GDP结合形式的辣椒DN-CaROP1突变体为诱饵,采用ProQuestTM酵母双杂交体系,从辣椒幼苗cDNA文库中分离了辣椒GEF阳性克隆,其推导的氨基酸序列与其他植物中发现的GEF具有较高的同源性,并含典型的植物ROPGEF保守域DUF315及N端与C端的高度变化域,将之命名为CaROPGEF1;RT-PCR分析表明,CaROPGEF1在辣椒多种组织中均有表达;进一步酵母双杂交分析表明,CaROPGEF1可与GDP结合态的ROP结合,而不能与GTP结合态的ROP结合.上述结果暗示CaROPGEF1调节的ROP从DN态向CA态的转化在辣椒植株中频繁发生,可能参与辣椒ROP介导的生长、发育和对环境适应的调控.     

A cytosolic protein catalyzes the release of GDP from p21ras

The rate of release of guanine nucleotides from the ras proteins (Ras) is extremely slow in the presence of Mg2+. It seemed likely, therefore that a factor might exist to accelerate the release of guanosine diphosphate (GDP), and hence the exchange of GDP for guanosine triphosphate (GTP). Such a factor has now been discovered in rat brain cytosol. Brain cytosol was found to catalyze, by orders of magnitude, the release of guanine nucleotides from recombinant v-H-Ras protein bound with [alpha-32P]GDP. This effect occurred even in the presence of a large excess of Mg2+, but was destroyed by heat or by incubation of the cytosol for an hour at 37 degrees C in the absence of phosphatase inhibitors. The effect was observed with either v-H-Ras or c-H-Ras, but not with p25rab3A, a small G protein with about 30% similarity to Ras. The effect could not be mimicked by addition of recombinant Ras-GAP or purified GEF, a guanine nucleotide exchange factor involved in the regulation of eukaryotic protein synthesis. By gel filtration chromatography, the factor appears to possess a molecular size between 100,000 and 160,000 daltons. This protein (Ras-guanine nucleotide-releasing factor, or Ras-GRF) may be involved in the activation of p21ras.     

FpPDE1 function of Fsarium pseudograminearum on pathogenesis in wheat

Wheat crown rot caused by Fusarium spp.is a common disease worldwide.Both Fusarium pseudograminearum and Fusarium graminearum infect wheat crown and produce mycotoxin leading to grain loss due to white head.F.pseudograminearum(Fp) was reported in wheat from Henan Province of China a couple of years ago.The wheat crown rot(CR) caused by this new pathogen is as an emerging severe disease of wheat,which has recently expanded to several provinces in China and is,therefore,under rapid investigation.Colonization of wheat tissue by Fp is accomplished though the formation of a septated foot-shaped appressoria and generation of a penetration peg to break through the internal cells of leaf sheath.The molecular mechanism by which Fp regulates the pathogenesis on wheat host is unclear.Here,we report FpPDE1,a P-type ATPase-encoding predicted PDE1 orthologue gene of Magnaporthe oryzae,belonging to the DRS2 subfamily of aminophospholipid translocases.The gene deletion of FpPDE1 with the split-marker approach did not obviously affect hyphae growth and conidiation,but led to an attenuated virulence on wheat base stem and root.Our finding indicates that the putative aminophospholipid translocases is not essential for the infectious hyphae development in Fp.     

水稻白叶枯病菌对拌种灵抗药性分子机制研究

  通过紫外诱变获得了抗拌种灵水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv.oryzae）的突变体，这些突变体可以在含100 μg·ml-1拌种灵平板上生长，而敏感菌株在10 μg·ml-1浓度下则不能生长。敏感菌株琥珀酸脱氢酶活性受拌种灵强烈抑制，而抗药突变体的酶活性较低，且不受药剂抑制。应用6对引物，从水稻白叶枯病菌野生敏感菌株和室内诱导抗药性菌株中扩增到琥珀酸脱氢酶基因全序列。该基因全长3 616 bp，编码1 115个氨基酸，含有2个内含子。与柑橘溃疡病菌（Xanthomonas axonopodis pv. citri）琥珀酸脱氢酶核苷酸同源性93%，氨基酸同源性97%；与其它6种病原细菌琥珀酸脱氢酶基因编码的氨基酸序列同源性为43%～95%。敏感菌株和抗药菌株的琥珀酸脱氢酶序列分析表明，琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白亚基中229位氨基酸由组氨酸（CAC）突变为酪氨酸（TAC）是导致X. oryzae对拌种灵产生抗药性的主要原因。     

苹果树腐烂病菌根皮苷水解酶基因Vmlph1的功能

为明确根皮苷降解酶在苹果树腐烂病菌侵染过程中的作用,从苹果树腐烂病菌基因组序列中鉴定出候选根皮苷降解酶基因Vmlph1,利用Double-joint PCR和PEG介导的原生质体转化技术构建Vmlph1敲除突变体,观察突变体营养生长状况、产孢情况以及致病力的变化;利用HPLC方法检测基因敲除对根皮苷降解速率的影响。结果发现,经PCR及Southern blot验证后获得Vmlph1基因的敲除突变体;与野生型菌株相比,突变体菌落颜色变白,生长速率和产孢能力显著降低;接种到叶片和枝条上,突变体致病力显著降低;突变体根皮苷降解能力与野生型没有显著差异;在根皮苷诱导下,野生型菌株黑色素合成调控转录因子Cmr1基因的表达量显著上调,但突变体Cmr1基因的上调倍数显著低于野生型菌株。表明,根皮苷降解酶基因Vmlph1与苹果树腐烂病菌营养生长、致病力、分生孢子的产生及黑色素合成有关。     

Structure of Galphaq-p63RhoGEF-RhoA complex reveals a pathway for the activation of RhoA by GPCRs

The guanine nucleotide exchange factor p63RhoGEF is an effector of the heterotrimeric guanine nucleotide-binding protein (G protein) Galphaq and thereby links Galphaq-coupled receptors (GPCRs) to the activation of the small-molecular-weight G protein RhoA. We determined the crystal structure of the Galphaq-p63RhoGEF-RhoA complex, detailing the interactions of Galphaq with the Dbl and pleckstrin homology (DH and PH) domains of p63RhoGEF. These interactions involve the effector-binding site and the C-terminal region of Galphaq and appear to relieve autoinhibition of the catalytic DH domain by the PH domain. Trio, Duet, and p63RhoGEF are shown to constitute a family of Galphaq effectors that appear to activate RhoA both in vitro and in intact cells. We propose that this structure represents the crux of an ancient signal transduction pathway that is expected to be important in an array of physiological processes.     

谷瘟病菌无毒基因型鉴定及分析

【目的】鉴定不同地区谷瘟病菌（Magnaporthe oryzae）所含无毒基因的类型,确定无毒基因在菌株中的分布及变异情况,为深入研究谷瘟病菌无毒基因变异机制提供参考。【方法】从中国北方谷子主产区不同区域内采集并分离76个谷瘟病菌的单孢菌株,提取其基因组DNA,根据目前已成功克隆的稻瘟病菌的7个无毒基因的核苷酸序列设计特异性引物,进行PCR扩增及电泳检测,并对部分菌株的无毒基因进行测序分析。【结果】在76个谷瘟病菌中,无毒基因ACE1、Avr-pita、Avr1-CO39和AvrPiz-t的扩增率为100％,无毒基因Avr-pik、Avr-pia和Avr-pii的扩增率分别为63.2%、42.1%和21.1%。在谷瘟病菌菌株P11和P34中,Avr1-CO39的扩增条带较预期片段大490 bp,测序结果发现菌株P11和P34中的Avr1-CO39基因序列完全一致,均在启动子区插入了490 bp核苷酸,该插入序列与non-LTR retrotransposon: Mg-SINE的相似度达99.16％。Avr-pita的测序结果发现,谷瘟病菌菌株中的Avr-pita基因序列变异较为丰富,其变异形式主要为单核苷酸的变异,包括单碱基的插入、缺失及多位点的SNP。Avr-pia的变异类型主要为整个无毒基因的缺失,经测序验证等位基因序列分为4种类型。Avr-pia-A与参考序列（AB498873.1）一致,包含10个菌株;Avr-pia-B包含20个菌株,在-116、-109和-16 bp处分别存在C/T、G/T和C/A变异,但与参考序列的CDS区序列相同;Avr-pia-C仅包含菌株P10,在+150 bp处存在T/G变异,但为同义突变;Avr-pia-D仅包含菌株P18,在+212 bp位点处存在C/T变异,导致该变异位点由编码苏氨酸突变为编码异亮氨酸。谷瘟病菌Avr-pii包含3种等位基因类型。Avr-pii-A型与参考序列（AB498874.1）一致,共包含14个菌株;Avr-pii-B型和Avr-pii-C型分别在+139和+64 bp处存在A/G变异,核苷酸的变异导致该位点由编码苏氨酸改为丙氨酸。Avr-pii-B型和Avr-pii-C型变异均为首次报道。单元型分析表明,AG2包含23个菌株,占供试菌株的30.2%,为优势单元型。【结论】明确了不同地区的谷瘟病菌中无毒基因ACE1、Avr-pita、Avr1-CO39和AvrPiz-t不存在地理来源的差异;而无毒基因Avr-pik、Avr-pia和Avr-pii在各地分布有差异。谷瘟病菌AG2单元型为优势单元型,其次是单元型AG1和AG5。     

Identification of SNPs and Their Effects on Swine Growth and Carcass Traits for Porcine IGFBP-3 Gene

The insulin-like growth factor binding protein-3 （IGFBP-3） was known as a key factor that regulates the effect of insulin- like growth factors （IGF-1 and IGF-2） on pig growth and development. We first identified 38 single nucleotide polymorphisms （SNPs） from a fragment of the IGFBP-3 gene spanning 1 823 bp using the denaturing high-performance liquid chromatography （DHPLC） method and confirmed them by direct sequencing. Among these SNPs, 36 located in introns and the remaining 2 in the 3 prime untranslated region （3UTR）. In addition, 16 PCR-RFLP polymorphisms were identified within these SNPs. Three SNPs were then selected to genotype 272 F2 individuals with PCR-RFLP method and the association of polymorphism with growth and carcass traits were analyzed. The results showed that no significant associations were observed between polymorphisms of A265G and A952G and traits. However, the A2670G significantly related with live body length, loin muscle area, and skin and fat percentage （P〈0.05）; highly significantly associated with weight of carcass lean and lean percentage （P〈 0.01）.