猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

为体外表达猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）糖基化囊膜蛋白GP5,以及制备其多克隆抗体,以PRRSV PC疫苗株RNA为模板,应用RT-PCR扩增GP5基因,并克隆至原核表达载体pET-32a（+）,构建重组表达载体pET-32a-GP5。经过酶切和测序鉴定后,将阳性重组质粒转化到大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中,加入IPTG低温诱导表达。使用亲和层析法纯化PRRSV GP5蛋白。然后将纯化的蛋白免疫北京大耳白兔制备多克隆抗体,并进行酶联免疫吸附试验（ELISA）和间接免疫荧光分析（IFA）。结果显示,表达的PRRSV GP5原核蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,相对分子质量大约30 kDa;制备的GP5蛋白多克隆抗体ELISA效价可达1:64 000;IFA检测显示,制备的多克隆抗体能够识别PRRSV。重组PRRSV GP5蛋白及其多克隆抗体的成功制备为PRRSV血清学检测方法的建立提供了良好的生物学材料。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2主要抗原区域的原核表达及间接ELISA检测方法的建立

本研究以高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HPPRRSV)重组NSP2蛋白为包被抗原,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。通过RT-PCR技术,从PRRSV SCMS08株中,成功扩增出NSP2的主要抗原区域。将其克隆到pET-32a(+),成功构建原核表达载体,并转化宿主菌(E.coli)Rosetta 2(DE3)。以镍柱纯化表达蛋白,SDS-PAGE检测证实重组蛋白获得了高效表达,Western blot检测表明所表达蛋白能够被抗组氨酸标签单克隆抗体和PRRSV阳性血清识别。以此蛋白包被酶标板,初步建立了PRRSV NSP2-ELISA诊断方法。优化的NSP2-ELISA的最佳抗原包被浓度为1.7μg·mL-1,血清的最佳稀释度为1∶40。用该方法检测185份血清样品,与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果符合率为90.8%。建立的间接ELISA方法敏感性高、特异性强,可用于猪繁殖与呼吸综合征的常规诊断及流行病学调查。     

PEDV流行株N基因主要抗原表位原核表达及ELISA方法的建立

为建立检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)N蛋白抗体的ELISA方法,应用RT-PCR从腹泻仔猪样本中扩增获得了1段PEDV河南流行毒株N基因全长序列,根据对其氨基酸序列的抗原性分析结果,将N基因上2个大的抗原表位区(112³21位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32α,构建pET-32α-N重组质粒并转化至宿主菌BL21(DE3)中。将重组菌在37℃条件下加入IPTG进行诱导使该蛋白获得了高效表达,表达产物为融合蛋白,相对分子质量约41 300。Western-blot分析表明,所表达的蛋白可与抗PEDV全病毒小鼠阳性血清发生反应。以纯化的重组N蛋白作为包被抗原建立了检测PEDV抗体的间接ELISA方法,抗原最佳包被量0.226μg/孔,血清最佳稀释度为1∶100,二抗最佳稀释度为1∶2 000,待检血清D450值≥0.28判定为阳性。国内首次用该方法对临床猪血清样本进行了检测,母猪血清PEDV抗体阳性率为84.26%(166/197),仔猪血清阳性率为27.93%(31/111)。结果表明,建立的间接ELISA方法特异性、灵敏性和可重复性良好,可用于临床上PEDV抗体水平的监测和PED流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒糖基化囊膜蛋白5原核表达载体的构建及免疫原性分析

为分析猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)糖基化囊膜蛋白5（GP5）的免疫原性,本研究通过提取PRRSV分离株（GenBank登录号：HQ701732.1）RNA和RT-PCR扩增得到开放阅读框5（ORF5）基因。根据ORF5的基因序列,设计2对引物,经PCR扩增分别获得不含信号肽和跨膜功能区的2段基因片段。利用酶切位点,将2段基因连接到原核表达载体pET-28a（+）上,获得重组表达质粒pET28a-GP5。将重组质粒导入BL21（DE3）感受态细胞,经IPTG诱导获得表达。经Western blotting鉴定,重组蛋白可被PRRSV阳性血清识别。将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA方法检测,小鼠能产生针对蛋白的血清抗体。因此,该重组PRRSV GP5蛋白具有良好的生物学活性,为进一步研究GP5蛋白的结构和功能奠定基础。     

小反刍兽疫病毒核衣壳蛋白抗原性与特异性的比较

为筛选建立小反刍兽疫病毒N蛋白双抗原夹心ELISA抗体检测方法的抗原原料,本研究通过优化大肠杆菌密码子、优化蛋白表达与纯化条件等方法,分别在pET-30a与pET-32a两个不同原核表达载体中成功获得了可溶性的小反刍兽疫核衣壳蛋白(N)。分别对重组大肠埃希氏菌pET-30a-(N)-BL21(DE3)株与pET-32a-(N)-BL21(DE3)株种子批的P7代与P20代进行蛋白诱导表达与抗原提取纯化,共获得6批小反刍兽疫病毒pET-30a-(N)蛋白与pET-32a-(N)蛋白,并对蛋白的浓度、纯度、抗原性和特异性进行检验。结果表明两个纯化后的重组抗原与羊小反刍兽疫病毒阳性血清有明显反应,具有较好的反应性,而与羊痘病毒阳性血清、羊口蹄疫病毒阳性血清、山羊关节炎/脑炎病毒阳性血清等特异性血清均无交叉反应,具有较好的特异性。本研究结果为今后以N蛋白为基础建立相应的抗原捕获ELISA方法,竞争ELISA检测方法、间接ELISA检测方法以及双抗原夹心ELISA抗体检测方法打下了坚实的基础。     

猪血凝性脑脊髓炎病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立与应用

为建立检测猪血凝性脑脊髓炎病毒(porcine hemagglutinating encephalomyelitis virus,PHEV)血清抗体的间接ELISA方法,构建了高效表达PHEV核衣壳蛋白(N)的重组质粒(pET28a-N),Western blot检测该重组蛋白具有较好的免疫原性。以纯化的N重组蛋白作为包被抗原,通过方阵试验确定了抗原的最适包被浓度为2mg/L,酶标二抗的最佳稀释倍数为1∶10 000,建立了用于PHEV抗体检测间接ELISA方法。此外,用该法(N-ELISA)对天津市地区采集到的200份猪血清样品进行检测,阳性检出率为83.5%,与前期工作中建立的全病毒作为包被抗原的间接ELISA诊断方法 (HEV-ELISA)检测结果的符合率为90.91%。结果表明:以重组N蛋白为包被抗原所建立的用于PHEV血清抗体检测的方法能够用于检测PHEV感染及相关的流行病学调查。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白多克隆抗体的制备及其中和活性研究

为了制备猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)N蛋白鼠源多克隆抗体并验证其中和活性,试验采用RT-PCR方法扩增了PRRSV的ORF7基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a中,并在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中表达重组N蛋白,纯化重组N蛋白制成弗氏佐剂抗原,采用皮下多点注射法免疫Balb/c小鼠,经3次免疫后获得多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体效价,以血清中和试验和间接免疫荧光法验证其中和活性。结果表明:试验成功扩增了大小为390 bp的ORF7基因片段,经双酶切和序列测定,重组表达质粒pET-32a-N构建成功,重组N蛋白分子质量约为28.0 ku,制备的多克隆抗体效价较高,重组N蛋白多克隆抗体按照1∶2、1∶4和1∶8比例稀释时,荧光数量与不加多克隆抗体时比较无明显区别。说明在大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中成功表达了PRRSV重组N蛋白,制备的鼠源多克隆抗体能够与重组N蛋白发生特异性反应,但没有抗PRRSV中和活性。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组N蛋白的高效表达及间接ELISA方法的建立

根据GenBank中猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 美洲株 ATCC VR2332 的 N 蛋白基因序列,设计合成1对特异性引物,用RT-PCR方法从PRRSV Hn-1/06株中克隆了大小为372 bp的 N 蛋白基因(EU025136).将 N 蛋白基因亚克隆到原核表达载体pET-32a中构建了重组表达质粒pET-N,在IPTG的诱导下成功表达了相对分子质量约为33 000的可溶性融合蛋白N-His;经SDS-PAGE和凝胶薄层扫描分析,融合蛋白的表达量约占细菌总蛋白量的29%.将融合蛋白加入镍琼脂糖凝胶树脂层析柱,经300 mmol/L咪唑磷酸盐缓冲液洗脱,其纯度可达,91%.用Western blotting分析纯化后的融合蛋白,显示良好的生物学活性.利用纯化融合蛋白作包被抗原及优化ELISA反应条件,建立了可检测抗PRRSV N 蛋白抗体的间接ELISA方法(N-ELISA),并将所建立的N-ELISA与国外进口的PRRS检测试剂盒IDEXX-ELISA对200份临床送检血清进行平行检测,阳性符合率为92.7%.结果表明,本试验建立的N-ELISA与IDEXX-ELISA具有同样高的特异性.     

猪流行性腹泻IgA抗体间接ELISA检测方法的建立

本实验将构建的重组表达质粒pET-32a(+)-S798转入大肠杆菌中诱导表达,获得表达量较高的包涵体蛋白。以纯化的S重组蛋白作为包被抗原,初步建立了母猪乳汁中IgA抗体的间接ELISA检测方法。抗原包被浓度为0.938ug/mL,乳汁稀释度为1:320,对反应条件进行优化,批内批间重复性试验变异系数均小于10%,与市售试剂盒相比特异性为90%、敏感性为94%、符合率为92%,本方法具有良好的特异性和敏感性,可以对猪乳汁中抗流行性腹泻病毒的IgA抗体水平进行快速检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白的表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测感染猪繁殖与呼吸障碍综合症病毒(PRRSV)或PRRSV弱毒疫苗免疫后猪群体内抗体水平的方法,本研究以PRRSV GP5基因的原核表达蛋白为包被抗原,建立了间接ELISA抗体检测方法。利用RT-PCR扩增PRRSV GP5基因,将其克隆于p GEX-6p-1中构建原核重组表达载体p GEX-6P-GP5,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,以梯度尿素法对表达蛋白纯化后,以其为包被抗原,利用方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了GP5蛋白的最佳包被浓度是150 ng/孔,被检血清的最佳稀释倍数为80倍。试验结果显示,该检测方法的特异性、敏感性、重复性很强。从山东各地采集203份猪血清样品进行检测,结果显示该检测方法与商品化PRRSV抗体检测试剂盒(法国LSI)检测结果的符合率为96.5%。本研究建立的间接ELISA方法,为猪群体内PRRSV抗体水平的检测提供了重要的检测手段,在疫苗免疫效果的评价方面有着广泛的应用。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆与原核表达

通过PCR方法从重组质粒扩增得到猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)结构蛋白ORF5基因,将其克隆至原核表达载体pET-32a,得到重组表达载体pET-32a-GP5,转化大肠埃希菌BL21.用不同浓度的IPTG分别于37 ℃诱导.经SDS-PAGE分析,所表达的融合蛋白分子量约为31.4 ku;薄层扫描分析显示,表达量占菌体总蛋白含量的28.8%.重组蛋白可被PRRSV阳性血清所识别,可用于PRRSV的检测.     

犬瘟热病毒重组核蛋白间接ELISA方法的建立

将已构建成功的重组质粒pGEX-4T-1-N转化大肠杆菌BL21株,在最佳诱导条件下获得犬瘟热病毒(CDV)重组N蛋白。将表达产物纯化后进行SDS-PAGE和W estern-b lot分析,与CDV标准阳性血清呈阳性反应。本研究初步建立了以纯化的N蛋白为包被抗原的间接ELISA检测方法,经初步试验证实,该方法敏感、特异。试验结果表明,大肠杆菌中表达的CDV N蛋白在免疫原性上与天然核衣壳蛋白具有较高相似性,可作为诊断用抗原。     

非洲猪瘟病毒p30基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测血清中非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)抗体的间接ELISA方法,本试验将ASFVp30基因进行原核表达,采用SDS-PAGE和Western blotting方法对重组蛋白进行表达鉴定和免疫原性分析,随后以纯化的重组蛋白为包被抗原,经条件优化、特异性试验、敏感性试验和重复性试验,建立一种血清中ASFV抗体的检测方法。结果显示,ASFVp30基因成功克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,获得pET-32a-p30重组质粒;转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达,得到P30重组蛋白,重组蛋白大小约为42ku,主要以包涵体形式存在;Western blotting结果显示,纯化后的蛋白具有良好的免疫原性;以纯化的P30重组蛋白为包被抗原,建立了检测ASFV抗体的间接ELISA方法,通过方阵试验对间接ELISA方法进行优化,最终确定了抗原最佳包被浓度为1.2μg/mL,待检血清最佳稀释倍数为1∶100,最佳封闭液为1%BSA,酶标抗体最佳稀释度为1∶4 000,以此建立的ASFV间接ELISA方法临界值为0.322。本方法仅与ASFV阳性血清发生特异性反应,与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、口蹄疫病毒、伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型及猪流行性腹泻病毒阳性血清均无交叉反应,具有较强的特异性。该方法检测ASFV阳性血清灵敏度可达到1∶1 600;批内重复性和批间重复性变异系数均10%。本试验建立的间接ELISA方法具有良好的特异性、灵敏度和重复性,可初步应用于ASFV抗体的检测。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

猪感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)14 d后就可以产生针对非结构蛋白(Non-Structural Protein 7,Nsp7)的抗体,而且抗体水平很高,与N蛋白抗体水平相似,但比N蛋白抗体持续时间更长。另外,检测Nsp7抗体可用于区分PRRSVⅠ型和Ⅱ型的感染。本试验旨在建立一种快速、特异且敏感的检测血清中PRRSV抗体的方法。试验根据NCBI数据库录入的Nsp7蛋白序列(GenBank:EF536003)设计引物,利用聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增Nsp7基因,构建原核表达载体pET28a-Nsp7,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,并诱导重组蛋白表达。利用亲和层析纯化重组蛋白,Western Blot鉴定表达产物。将纯化后的重组蛋白按不同浓度包被酶标板,通过方阵滴定法确定最佳抗原包被浓度及血清稀释度,并对其条件进行优化,最终建立检测PRRSV Nsp7抗体的间接酶联免疫吸附测定(Enzyme Linked Immunosorbent Assay,ELISA)方法。结果表明,试验表达了重组Nsp7蛋白,重组的Nsp7蛋白能与PRRSV阳性血清发生特异性反应,建立了一种基于重组Nsp7蛋白的间接ELISA检测方法。建立的间接ELISA检测方法分别与商品化PRRSV抗体检测试剂盒检测结果相比,两者符合率为87.74%。试验表明,建立的间接ELISA方法可以用于PRRSV抗体的检测。     

鸭瘟病毒胸苷激酶基因的原核表达及其蛋白间接ELISA检测方法的建立

本研究旨在以表达纯化的鸭瘟病毒胸苷激酶(thymidine kinase,TK)重组蛋白作为包被抗原,建立检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法。根据GenBank上收录的鸭瘟病毒TK基因序列设计出1对引物,采用PCR扩增出鸭瘟病毒TK基因。将TK基因与原核表达载体pET-32a连接,通过PCR、双酶切和测序鉴定,将阳性重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)工程菌,IPTG诱导表达。采用切胶纯化的方法纯化蛋白,Western blotting分析鉴定表达产物。用纯化的TK重组蛋白作为包被抗原,并优化其他条件,最终建立检测鸭瘟病毒抗体的间接ELISA方法。结果显示,重组质粒构建成功,经Western blotting检测得到目的蛋白,TK重组蛋白能被阳性血清识别,说明该重组蛋白具有较好的抗原性。确定了最佳反应条件:酶标二抗的最佳稀释度为1:200,最佳抗原、抗体的稀释度分别为1:400和1:200,抗原抗体作用时间为60 min,最佳封闭液为5% BSA,最佳封闭时间为60 min,最佳显色时间为10 min。结果表明,该方法具有良好的稳定性及较高的敏感性,为鸭瘟的检疫、监测和防制工作提供了一种有效的手段。     

基于3种抗原的融合表达蛋白建立牛分枝杆菌抗体ELISA检测方法

为建立一种诊断牛结核病的间接ELISA方法,以牛分枝杆菌Rv3403c、CFP10和ESAT6蛋白为靶标抗原,通过酶切连接和重叠延伸PCR方法,将3个抗原基因串联在pET-28a载体上,基因之间用Linker序列连接,构建出pET-28a-Rv3403c-CFP10-ESAT6并转化至大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,纯化目的蛋白并分析其反应原性。以纯化后的融合蛋白作为包被抗原建立间接ELISA抗体检测方法。结果显示：通过SDS-PAGE和Western blot鉴定分析,成功表达并纯化出包涵体蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6,目的蛋白具有良好的反应原性;以融合蛋白为包被抗原建立的间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,与其他牛病原体阳性血清不发生交叉反应。临床结果显示,本方法与商品化试剂盒阳性符合率为66.7%,阴性符合率99.3%,总符合率为99.3%。研究表明,成功串联表达了具有良好反应原性的融合蛋白Rv3403c-CFP10-ESAT6,并以此为包被抗原建立了一种牛分枝杆菌间接ELISA抗体检测方法,为检测和净化牛结核病提供了诊断工具。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒重组M蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及应用

为建立一种敏感、特异、快速、高通量的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)抗体血清学检测方法,本研究利用原核表达技术表达了PRRSV M蛋白,将纯化后的重组M蛋白作为包被抗原建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。参照已发表的PRRSV基因组M基因序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约435 bp的M基因片段,将目的片段亚克隆至pET32a(+)表达载体中,经IPTG诱导获得了以包涵体形式表达的重组M蛋白,重组蛋白纯化后,免疫印迹检测结果表明具有良好的抗原性和特异性。以重组M纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PRRSV抗体的间接ELISA方法,该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪细小病毒(PPV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪圆环病毒2型(PCV2)其他6种常见猪病病原的阳性血清均为阴性;该方法批内与批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%;该方法与商品化ELISA试剂盒的符合率为95.3%。本研究建立的M-ELISA检测方法将为猪群免疫PRRS疫苗后抗体水平监测及PRRSV野毒感染的快速诊断与流行病学调查等提供了一种简便易行、快速、高通量的血清学抗体检测方法。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白的原核表达和间接ELISA方法的建立

根据猪繁殖与咱呼吸综合征病毒JX株编码N蛋白的ORF7基因序列设计特异性引物。采用RT-PCR方法扩增猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因片段(367 bp),将其克隆于表达载体pET-32a上。测序验证后将重组质粒pET-32a-JX-N转入宿主菌Rosetta,经0.7 mmol/L IPTG诱导,SDS-PAGE显示外源基因编码的重组N蛋白在宿主菌中表达效率较高。Western-Blot试验结果显示,重组N蛋白具有反应原性。将纯化的重组N蛋白包被酶标板,建立并优化了能够用于PRRSV抗体检测的间接ELISA方法。     

PRRSV重组M蛋白表达及胶体金试纸的制备

为建立PRRSV抗体的检测方法,通过扩增PRRSV ORF6基因,将其克隆至pET-28a（＋）中,IP TG诱导重组质粒转化菌表达,经SDS-P AGE和Western blot鉴定,表明重组质粒能够表达目的蛋白;经亲和层析纯化表达蛋白,以SP A标记胶体金,用纯化M融合蛋白和羊抗猪抗体为检测线和质控线研制胶体金试纸,检测猪血清样品,比较与IDEXX ELISA试剂盒检测结果的符合率。结果表明,表达蛋白具有良好的反应性,制备的胶体金试纸与IDEXX ELISA试剂盒检测符合率为89％,该方法为P RRSV抗体的检测提供了快速简便的方法。     

原核高效表达猪繁殖与呼吸综合征病毒核衣壳蛋白的特性及应用

从已构建的PRRSV ORF7重组质粒pUCm-T-ORF7中用PCR扩增ORF7基因亚克隆至表达载体pGEX-4T-3,构建重组表达质粒pGEX-4T-3-ORF7并转化大肠杆菌.经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,成功表达了谷胱苷肽转移酶(GST)融合的核衣壳蛋白(N),重组N蛋白表达量约为菌体总蛋白的35%,主要以可溶的形式存在,且能形成同源二聚体.重组N蛋白经谷胱苷肽凝胶(glutathione sepharose 4B)亲和层析后得到高度纯化,并将该蛋白作为抗原建立了间接ELISA检测方法.利用该方法对某猪场76份猪血清进行检测并将结果与IDEXX公司ELISA试剂盒检测结果作比较,2种方法的总符合率达93.4%,检测结果之间差异不显著(P＞0.05).结果表明大肠杆菌表达的重组GST融合N蛋白具有良好的抗原性,因而有望利用该重组蛋白开发为试剂盒应用于临床PRRSV抗体的检测.