鸡传染性法氏囊病病毒RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中已经发表的传染性法氏囊病病毒（IBDV）VP2基因的高度保守序列,设计并合成了一对引物,Blast在线检索GenBank数据库,未发现其他相似序列。提取已鉴定的IBDV—QD株传代病毒尿囊液的总RNA,合成cDNA模板,优化RT-PCR反应条件,最终获得预期453bp的目的片段,IBDV扩增产物经测序结果证实与GenBank中已发表的致病力不同的IBDV毒株相应序列同源性达97．4％～99．9％,最终建立了RT—PCR检测方法。用已建立的RT—PCR方法对已知的8份临床IBDV阳性法氏囊病料进行检测,阳性率达100％,另外对2份鸡白血病病毒（ALDV）,2份鸡传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）,2份鸡传染性支气管炎病毒（IBV）阳性病料进行平行同条件检测,结果均为阴性。表明所建立的RT—PCR特异性好、敏感性高,可用于鸡传染性法氏囊病的临床初步诊断及流行病学调查。     

鉴别诊断鸡传染性法氏囊病RT-PCR方法的建立

诊断鉴别鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)对该病的临床诊治具有重要意义。从IBDV弱毒疫苗中提取病毒RNA,采用二步RT-PCR方法,建立诊断和鉴别IBDV毒株性质的分子诊断方法。结果表明:针对IBDV VP2基因高变区的基础RT-PCR引物和巢式RT-PCR引物,分别能够扩增出目标大小的特异性片段;区分IBDV超强毒株和经典毒株的RT-PCR扩增结果与预期目标一致。该方法可用于鸡传染性法氏囊病毒病的快速分子诊断及鉴别。     

应用PCR方法检测鸡传染性贫血病毒

根据发表的鸡传染性贫血病毒(CAV)序列,选择鸡传染性贫血病毒基因组保守区域。设计一对引物,建立了CAV快速诊断的PCR方法。特异性结果说明,该方法对CAV不同毒株均能扩增出明显的特异性条带,而新城疫病毒(NDV)Lasota株、传染性支气管炎病毒(IBV)M41株、鸡马立克氏病病毒(MDV)和鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)扩增结果均为阴性;PCR反应敏感性结果显示．该方法能检测出的DNA最低浓度为O．001pg／μl,可用于临床感染不同年龄鸡群的CAV的检测。     

传染性法氏囊病病毒(IBDV)快速检测与分型技术

根据已发表的传染性法氏囊病病毒 (IBDV)核苷酸序列 ,在病毒结构蛋白 VP2编码基因的高变区两端外侧的保守序列内设计合成了 2条寡核苷酸引物 ,对各种不同致病性的 12株参考毒株进行了 RT- PCR检测。结果 :12个参考毒株均能扩增出约 6 79bp的目的片段 ,而对照的 5种鸡源性病原体 NDV、IBV、CAIV、E.coli、PM均未扩增到相应片段 ;对疑似 IBD的 34份临床病料进行检测 ,并同时在其扩增的片段内设计另 1对引物进行 Nested- PCR检测 ,结果基础 RT- PCR检测到 11份阳性 ,Nested- PCR检测到 2 3份阳性 ,后者的检出率大大提高。结果表明 ,建立的 RT- PCR诊断技术具有特异、快捷、敏感的特点。取限制性内切酶 Sac 和 Ssp 以及设计的 2条 vv IBDV(超强毒株 )特异性引物 ,分别应用 v VP2片段 PCR扩增产物的限制性内切酶分析和型特异性引物的 PCR扩增 2种方法 ,对 7个 IBDV分离参考毒株和 2 4个临床样品进行致病性分型。结果 ,确定 2 1株属于 c IBDV(经典毒株 ) ,8株属于 vv IBDV,2株未能确定 ;2种分型方法的结果基本一致 ,均可用于 IBDV的快速分型 ,型特异性引物的 PCR扩增方法更为简便和快捷     

鸡传染性支气管炎病毒变异株ZZ2004 RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank已发表的鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV) ZZ2004 3a、3b及E基因序列,设计1对引物,扩增540 bp特异性核酸片段,建立了检测IBV ZZ2004的RT-PCR方法.特异性试验结果表明,IBV ZZ2004能扩增出540 bp的核酸片段,而IBV M41、H120、H52毒株以及新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、传染性腔上囊病病毒(IBDV)均无特异性条带出现.敏感性试验结果表明,该方法的最低检出量为1.525 pg的模板.上述结果表明,本试验所建立的RT-PCR方法敏感性高、特异性强.利用建立的RT-PCR方法对从河南省分离的6株疑似鸡IBVZZ2004进行检测,结果5株为阳性.该方法的建立为IBV ZZ2004的诊断及流行病学调查提供了可靠的方法.     

鸡传染性喉气管炎病毒PCR检测方式的建立和应用

根据GenBank传染性喉气管炎病毒(ILTV)基因序列,设计合成了1对特异性引物。以ILTV DNA为模板,建立了检测ILTV的PCR检测方法。通过优化PCR反应条件,成功扩增出一条约690 bp的目的基因片段。而鸡传染性法氏囊病病毒、新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、禽流感病毒基因组均未扩增为出相应的片段。敏感性试验检测出其DNA最小检出量为10-2μg。重复性试验中对3份检测为传染性喉气管炎病毒阳性病料进行检测,发现3次重复检测的结果完全一致。临床应用中运用上述优化的PCR反应条件进行PCR检测临床送检的16份疑似鸡传染性喉气管炎病毒感染病料,结果显示检出阳性样品6份,将阳性样品的PCR扩增产物克隆后序列分析显示均为鸡传染性喉气管炎病毒。结果表明,建立的PCR方法具有良好的特异性,敏感性和稳定性,可应用于传染性喉气管炎病毒鉴定和临床诊断。     

鸡传染性支气管炎病毒793/B RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank已发表的鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）793／BS1基因序列，设计1对引物，扩增891bp特异性核酸片段，建立了检测IBV793／B的RT—PCR方法。特异性试验结果表明，IBV793／B能扩增出891bp的核酸片段，而IBVM41H120H52毒株以及新城疫病毒（NDV）、禽流感病毒（AIV）、传染性法氏囊病病毒（IBDV）均无特异性条带出现。敏感性试验结果表明，该方法的最低检出量为10pg的模板。上述结果表明，本试验所建立的RT—PCR方法敏感性高、特异性强。利用建立的RT—PCR方法对从山东省分离的8株疑似鸡IBV793／B进行检测，结果7株为阳性。该方法的建立为IBV793／B的诊断及流行病学调查提供了可靠的方法。     

鸽源传染性法氏囊病病毒的分离鉴定及其A、B节段序列扩增

目的:分离鉴定鸽源传染性法氏囊病病毒(IBDV),扩增其基因组A、B节段cDNA.方法:采用SPF鸡胚尿囊腔接种分离IBDV,RT-PCR鉴定并扩增A、B节段全基因组DNA,进行同源性比较,初步分析分离株序列特征.结果:该分离株经RT-PCR特异性鉴定引物鉴定为强毒株,与强毒株相比,核苷酸序列同源性达97%,氨基酸序列同源性99%.     

传染性法氏囊病病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了建立传染性法氏囊病病毒RT-LAMP检测方法,用于快速检测传染性法氏囊病,从而评估禽类动物健康情况,试验针对传染性法氏囊病病毒VP3序列设计引物,优化反应时间、温度、体系等获取最佳反应参数,对建立的传染性法氏囊病病毒RT-LAMP检测方法的灵敏度、颜色变化、特异性进行研究并应用该方法检测临床疑似病料。结果表明:传染性法氏囊病病毒在60℃75 min和80℃10 min条件下目标核酸区段大量扩增,以此条件成功建立针对鸡传染性法氏囊病病毒的RTLAMP检测方法;在模板浓度为994.9 ng/μL并进行10倍稀释的情况下,所建立的RT-LAMP检测方法具有极高的灵敏性,可以检测到99.49 fg/μL的样品,比RT-PCR方法的灵敏度高100倍左右;在RT-LAMP的检测结果中加入Gene Finder可使阳性结果变为绿色;该方法只有鸡传染性法氏囊病病毒发生反应,表现出良好的特异性;在临床疑似病料检测中,RT-LAMP检测方法的检出率高达93.75%,比RT-PCR检测方法高25.00%。说明试验建立的传染性法氏囊病病毒RT-LAMP检测方法具有简便、灵敏、快速、强异性高等优点,可用于临床鸡传染性法氏囊病病毒的快速检测。     

禽传染性支气管炎病毒一步法RT-PCR检测方法的建立及应用

为建立一种快速检测禽传染性支气管炎病毒(Infectiousbronchitisvirus,IBV)病原的方法,根据GenBank上的禽传染性支气管炎病毒基因组序列,设计1对引物,建立了检测IBV的一步法RT-PCR方法,该方法对20份疑似传染性支气管炎(Infectiousbronchitis,IB)病料、传染性法氏囊病毒(Infectiousbursaldiseasevirus,IBDV)、新城疫病毒(Newcastaldiseasevirus,NDV)进行检测,结果仅IBV为阳性,IBDV、NDV均为阴性。该一步法RT-PCR方法具有良好的特异性、灵敏性和重复性,最低可检测出约4pg的IBVRNA,将为IBV的病原检测及分子流行病学调查等提供早期快速的诊断方法。     

一步法多重RT-PCR检测新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒和传染性法氏囊病病毒方法的建立和应用

根椐GenBank中登录的新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒[AIV(H9)]和传染性法氏囊病病毒(IBDV)基因序列,分别设计3对引物,在建立各病毒单项一步法RT-PCR技术的基础上,优化多重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的一步法多重RT-PCR检测方法,用这3对引物对同一样品中的NDV、AIV(H9)和IBDV核酸模板进行多重RT-PCR扩增,结果可同时扩增NDV的466bp、AIV(H9)的685bp和IBDV的244bp的特异性片段,而对其他4种病原的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该多重RT-PCR技术能检出10pg的NDV、10pg的AIV(H9)和1pg的IBDV模板。用53份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的一步法多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速及准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

应用RT-PCR技术诊断鸡传染性支气管炎

根据已发表的IBV4／91 attenuated株S1基因序列，设计并合成了产物约600bp的IBV特异性PCR引物对。从可疑病鸡气管、肺脏或肾脏组织中提取总RNA，用AMV反转录酶反转录后，再进行PCR扩增。用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物大小。采用NDV和IBDV病料组织作阴性对照，IBV标准株M41作阳性对照。该法检测特异性强、成本低、检出率高，可有效用于鸡传染性支气管炎的早期检测和流行病学研究。     

H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H9亚型禽流感病毒HA基因和禽肺病毒F基因的保守序列,通过Blast进行比对,在各自保守的基因序列中分别设计了两对特异性扩增引物,引物扩增的片段大小分别为569bp和424bp,应用这两对引物建立了H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒的二重RT-PCR检测方法,对建立的方法进行了特异性试验、敏感性试验和临床样品验证。对检测为阳性的样品进行克隆和序列分析,以验证本方法的准确性。特异性试验结果表明,所有参试的H9亚型禽流感病毒都能扩增出大小为569bp的片段,参试的禽肺病毒毒株扩增出424bp的片段,没有其他条带出现,而对照的参试毒株在569bp和424bp处没有任何条带;敏感性试验结果表明,本试验建立的方法能检测到10pg的H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒RNA模板。应用本试验建立的方法对广西采集的病鸡样品132份进行检测,H9亚型禽流感病毒阳性的样品有6份,禽肺病毒阳性的样品2份;随机各挑取2份H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒阳性PCR产物进行克隆和序列分析,经比对分析,2份H9亚型禽流感病毒阳性PCR产物与H9亚型禽流感病毒(No.JF715045.1)100%同源,2份禽肺病毒阳性PCR产物与禽肺病毒株(No.AF187154)100%同源。本试验建立的H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT-PCR检测方法具有特异、敏感、快速的特点,可以用于临床快速准确检测H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒。     

传染性法氏囊病病毒VP2基因原核表达及抗原性分析

从辽宁省某鸡场分离到一株传染性法氏囊病病毒(IBDV)。以该毒株基因组核酸为模板,应用RT-PCR扩增得到VP2基因,构建表达质粒pET28a-VP2,再将其转化至大肠埃希菌BL21(DE3)用IPTG进行诱导表达。表达产物经SDS-PAGE分析在48ku处出现特异性蛋白条带;经Western blot分析VP2蛋白可以与IBDV阳性血清发生特异性反应。用VP2蛋白制备的油乳剂疫苗免疫接种SPF鸡,2周后体内可以检测到特异性抗体。证明VP2蛋白具有重要的应用价值,为IBDV基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

IBD的RT-PCR快速诊断技术的建立

根据已发表的IBDV各致病型毒株的序列,在VP5和VP2的重叠基因区设计合成了一对寡核苷酸引物,对2株参考毒株和8份疑似IBD的临床病料进行RT-PCR检测均得到了明显的阳性扩增结果;而对作为阴性对照的常见4种鸡病病原:鸡新城疫病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡马立克氏病病毒、大肠杆菌均没有扩增到任何片段。利用琼脂扩散试验进行IBDV病原常规鉴定,结果证实5份病料呈现IBD阳性。表明建立的IBD的RT-PCR诊断技术具有快速、特异、敏感的特点。     

鸡传染性贫血病毒PCR检测方法的建立及应用

为了能有效、快速地检测鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV),针对CI-AV VP1基因保守系列设计了1对特异性引物,建立了检测CIAV的PCR方法,进行了特异性和敏感性试验并对临床疑似鸡传染性贫血(CIA)病料进行了检测。结果表明:CIAV扩增产物约为450 bp;仅对CIAV扩增出特异性条带;检测的最小拷贝数为1.0×10~1;检测的110份临床病料阳性率为78.2%(86/110)。说明所建立的PCR检测方法敏感、特异、快速,可用于临床样品CIAV的检测。     

鸡传染性法氏囊病血清抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立可检测鸡传染性法氏囊病血清抗体的间接ELISA检测方法,本研究经RT-PCR扩增IBDV VP2（1nt-708nt）基因片段,并应用pET28a载体进行原核表达,亲和层析纯化重组蛋白作为包被抗原,建立检测IBDV血清抗体的间接ELISA方法。应用所建方法和IDEXX试剂盒,对采自不同地区的156份鸡血清样品进行平行检测和比较。结果表明,RT-PCR扩增获得708bp的VP2基因片段;含重组表达质粒pET28a-VP2的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后,表达了约27kDa的VP2重组蛋白,表达量约占菌体蛋白的30.1%;建立的间接ELISA检测方法与IDEXX试剂盒比较,其特异性、敏感性和符合率分别达到90.24%、95.65%和94.23%。由此可见,本研究所建立的间接ELISA方法敏感、特异,适用于IBDV血清抗体的检测。     

RT-LAMP检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

以鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)的N基因保守区域设计4条引物,通过优化反应条件,建立了检测IBV的逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP),并进行了特异性试验、敏感性试验及临床样本检测。结果显示,建立的RT-LAMP方法对IBV参考株扩增产物的电泳呈特征性梯状条带,而新城疫病毒(NDV)、禽流感病毒(AIV)、马立克病病毒(MDV)、传染性囊病病毒(IBDV)等的扩增产物电泳后均无扩增条带。该方法最低能检出0.19 pg的IBV cDNA模板,敏感性比常规RT-PCR方法高1 000倍。用该方法检测了6份临床疑似IB临床病料,检出率为100%(6/6),与常规RT-PCR的符合率为100%。60 min反应结束后,离心可以看到白色沉淀物,简单直观,适用于基层实验室快速准确诊断。     

核酸探针检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立及应用

以地高辛(DIG)标记鸡传染性支气管炎病毒(IBV)pol基因的保守片段制成核酸探针,与IBV参考株、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、禽流感病毒、正常鸡胚尿囊液及正常鸡肾组织等的RT-PCR产物进行斑点杂交,以检测探针的特异性,结果该探针仅与IBV毒株的RT-PCR产物杂交呈阳性,与对照病毒和组织的RT-PCR产物杂交呈阴性.敏感性试验显示,探针最低能检出约3.4pg的IBV RT-PCR产物.用该方法检测了38份疑似IBV临床病料,31份阳性;而用RT-PCR法扩增IBV S2基因确诊为阳性的只有29份.对人工接种IBV H52弱毒苗鸡咽喉和肛门拭子32份进行检测,检出15份阳性.结果表明,利用DIG探针检测IBV的RT-PCR产物,特异性和敏感性强,可重复,能克服RT-PCR非特异性反应和探针Northern杂交的不稳定性.     

鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒的制备

为了制备鸡传染性法氏囊病毒病毒样颗粒,本试验通过RT-PCR技术扩增出鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株JL株的VP2全长基因,并将其插入杆状病毒表达系统的供体质粒pFastBacHTA中,构建含有IBDV VP2基因的重组供体质粒pFast-VP2,转化DH10Bac E.coli感受态细胞中,经蓝白斑筛选,获得重组杆粒rBacmid-VP2,将重组杆粒rBacmid-VP2转染sf9细胞后得到重组杆状病毒vBac-VP2。rBac-VP2感染sf9细胞,提取DNA,经PCR电泳分析,得到1条与预期大小相符的特异性条带;间接免疫荧光检测,可见特异性荧光;Western-blotting分析,在大约53 000处出现1条特异性的蛋白条带;电镜观察感染重组杆状病毒的细胞上清和沉淀,均可见重组VP2蛋白自行组装形成的病毒样颗粒。试验结果表明IBDV VP2基因在昆虫细胞中得到了表达,并自组装成了IBDV病毒样颗粒。本试验为研制鸡传染性法氏囊病病毒样颗粒疫苗奠定了基础。