小立碗藓PpLBD20基因敲除载体的构建及功能研究

LBD(Lateral organ boundaries domain)是植物中特有的基因家族.前期研究发现灰霉菌处理小立碗藓导致配子体中的PpLBD20上调表达,但PpLBD20的功能尚不明确.因此提取小立碗藓DNA,PCR扩增PpLBD20基因的上下游片段,依次插入PTN182载体,利用同源重组原理构建敲除表达载体,酶切和测序验证插入序列的正确性.通过工作浓度为20％的PGE 6000介导小立碗藓原生质体转化,筛选鉴定得到敲除PpLBD20后的突变体植株,观察到敲除后小立碗藓不形成茎叶体结构且配子体成丝状.结果为深入探究PpLBD20在小立碗藓的形态建成调控病原菌侵染的抗性作用奠定基础.     

小立碗藓CAD1基因敲除载体的构建及酶切方法优化

苔藓植物能否合成木质素目前还存在一定的争议。肉桂醇脱氢酶(CAD)催化木质素单体合成的最后一步反应,Real-TimePCR表达分析表明,小立碗藓CAD1基因在接种灰霉菌后的第2天表达量迅速上升。本试验利用PCR技术,以小立碗藓基因组DNA为模板,使用Primer5-Cracked设计的引物,扩增出小立碗藓CAD1基因的上、下游同源臂基因片段。酶切CAD1上游同源臂和pTN182原始质粒,经连接酶连接、转化至感受态大肠杆菌,筛选出阳性株。采用裂解液裂解、质粒DNA提取、质粒PCR以及酶切进行验证,得到CAD11-pTN182。采用同样的方法把下游片段转入CAD11-pTN182,即得CAD11-pTN182-CAD12,最后进行测序分析。结果表明,已成功构建CAD11-pTN182-CAD12敲除载体,并将该重组质粒转入目的菌株大肠杆菌中保存备用,可为后续进行小立碗藓CAD1基因敲除,验证小立碗藓CAD1基因功能,进一步了解模式植物小立碗藓防卫反应机理研究奠定良好基础。     

小立碗藓细胞重新编程过程中染色体重塑观察

小立碗藓(Physcomitrella patens)是研究植物发育的理想模式植物,也是目前发现的具有高频率同源重组特性的植物,其再生能力很强。此研究以生长7d的小立碗藓原丝体、培养0d的原生质体和再生2d的原生质体为材料,旨在了解小立碗藓细胞重新编程过程中染色体结构的动态变化。透射电镜观察发现原丝体染色体结构浓缩程度高;而当原丝体脱去细胞壁成原生质体状态时,异染色质开始解凝,染色体结构变得较为松散;原生质体再生2d时其染色体松散程度次之。通过进一步荧光定量PCR分析染色体重塑相关基因SWI/SNF的表达水平,发现这些基因在原生质体中表达量最高。     

ABA在小立碗藓极端干旱胁迫中的作用机制

[目的]以模式植物小立碗藓为材料,研究脱落酸(ABA)在小立碗藓极端干旱胁迫中的作用机制.[方法]将培养6d的小立碗藓用50 μmol/L ABA预处理1d后(WA),再脱水处理1 d(WAD),然后复水30min (WAR).另外一组材料是将培养7d的小立碗藓(WT,未经ABA处理)直接脱水处理1 d(WD),然后复水30 min (WR).测定6个样品(WT,WA,WAD,WAR,WD,WR)叶绿素荧光光化学淬灭系数(qP,qL)、非光化学淬灭系数(qN)和光合系统Ⅱ的实际光合效率Y(Ⅱ),分析光合作用相关基因的表达.[结果]经ABA预处理的样品脱水-复水后(WAR)其qP、qL、qN、Y(Ⅱ)值可以恢复,而未经ABA预处理的样品脱水-复水后(WR)其qP、qL、Y(Ⅱ)值均为零.进一步分析光合作用相关基因的表达,结果表明,经ABA预处理的样品脱水-复水后(WAR)的光合作用相关基因psbH、psbN和petN相对于其脱水时的表达量上调,petB和petD下降幅度较小;而未经ABA预处理的样品脱水-复水后(WR)的光合作用相关基因psbH、psbN、petN、petB和petD相对于其脱水时的表达量均下调,而且psbH、petN、petB和petD四个基因下降幅度较大.[结论]在复水过程中,ABA可以促进小立碗藓光合作用的恢复,从而提高小立碗藓的抗旱能力.     

小立碗藓PpCASLUU3基因敲除载体的构建

【目的】为探明PpCASLUU3是否参与灰霉菌引起的小立碗藓中类过敏反应,构建PpCASLUU3-PTN182敲除载体,对早期登陆植物防卫防御的进化提供依据。【方法】根据同源重组的原理,以小立碗藓基因组DNA为模板,利用Primer 5设计的引物,扩增得到小立碗藓PpCASLUU3基因的上、下游同源臂基因片段。将上下游同源臂基因分别克隆到pMD-19T上,测序验证,使用EcoR I、EcoR V酶切含上游目的基因的pMD-19T获得上游目的基因片段,使用BamH I、Sma I酶切含下游目的基因的pMD-19T获得下游目的基因片段,同时酶切PTN182载体,经T_4-DNA连接酶连接,转入大肠杆菌感受态,筛选出阳性克隆,采用相同的方法,将下游臂连入PpCASLUU3.1-PTN182载体。【结果】经PCR检测、酶切验证,获得了完整的PpCASLUU3.1-PTN182-PpCASLUU3.2敲除载体。经测序分析,插入序列PpCASLUU3.1和PpCASLUU3.2与未插入前相似度分别为100%和99.63%。【结论】PpCASLUU3-PTN182敲除载体构建成功。     

小立碗藓代谢与发育研究进展

小立碗藓（PhyscomitreUapatens）是目前发现的唯一具有高频率同源重组特性的植物,是研究植物代谢和发育的理想的模式系统。本文从生育周期、代谢和发育方面综述了其研究进展。     

小麦遗传率中潮霉素适宜筛选浓度的研究

研究了潮霉素不同质量浓度对西农 1376和京花 1号小麦愈伤组织及种子的筛选效果。结果表明 ,潮霉素对小麦愈伤组织的适宜筛选质量浓度为 110 mg/L,对转基因小麦后代种子筛选以 14 0 mg/L 较为适宜 ;不同基因型材料对潮霉素的敏感性存在一定差异     

不同小麦品种的潮霉素耐受性研究

潮霉素是基因转化过程中常用的筛选剂,为了探索不同小麦品种对潮霉素的抗性,本研究设置0、25、50、75、100、125、150 mg/L不同的潮霉素浓度,对K35、065657、扬麦158、Bobwhite和济引1号5个幼胚再生率高的小麦品种进行幼胚拯救并测试其对潮霉素的耐性。结果表明：K35和065657幼胚的最适筛选浓度是125 mg/L,扬麦158、Bobwhite和济引1号幼胚的最适筛选浓度是100 mg/L。     

小立碗藓GFP-CAD1-PNT182融合基因表达载体的构建

【目的】为利用绿色荧光蛋白基因(GFP)的表达情况优化聚乙二醇(PEG)介导的小立碗藓原生质体的转化体系及检测CAD1基因在细胞中的定位,构建小立碗藓GFP-CAD1-PTN182融合基因表达载体。【方法】用高保真酶获得GFP基因,通过双酶切GFP基因和CAD1-PTN182表达载体,将两片段洗脱回收,然后用T4-DNA连接酶将酶切产物在16℃条件下过夜连接。将连接产物转化到E.coli DH5α感受态细胞中,通过凝胶成像电泳的方法,挑选阳性克隆进行验证,并经过酶切验证和测序。【结果】序列对比相似度达100%,表明GFP-CAD1-PTN182融合基因表达载体构建成功。【结论】该载体的成功构建,为PEG介导小立碗藓原生质体转化体系的优化提供了便捷的检测手段,同时为进一步研究CAD1基因在细胞中的定位提供了理论依据。     

苔藓植物双向凝胶电泳蛋白样品制备的优化

比较了苔藓植物小立碗藓3种蛋白样品制备方法,结果分析表明,直接研磨法和三氯乙酸（TCA）/丙酮（acetone）沉淀法检测的蛋白点的数量相差不明显;直接研磨法提取蛋白所得到的2-DE图谱蛋白点模糊,分辨率低,横竖条纹干扰严重;三氯乙酸（TCA）/丙酮（acetone）沉淀法分离效果较好,分辨率有所提高.改良的酚抽提/乙酸铵沉淀法检测的蛋白点远远多于前两种方法,所得到的图谱质量最高,分辨率大大提升,蛋白点分布均匀清晰,横竖条纹干扰也很少,凝胶背景干净,是最佳的小立碗藓蛋白样品制备的方法.     

中华结缕草对潮霉素的敏感性研究

研究了中华结缕草3种不同外植体对不同浓度潮霉素溶液的敏感性。结果表明:中华结缕草不同外植体对潮霉素的敏感性存在差异,其中种子经50 mg/L潮霉素处理3周后,发芽率极显著减少,只有6%;愈伤组织经20 mg/L潮霉素处理3周后褐化率达到62%;离体叶片经50 mg/L潮霉素处理7 d后,黄化面积率超过85%。故中华结缕草的种子、愈伤组织、离体叶片在遗传转化中适宜的潮霉素筛选浓度分别为50、20、50 mg/L。     

中华结缕草对潮霉素的敏感性研究

研究了中华结缕草3种不同外植体对不同浓度潮霉素溶液的敏感性。结果表明:中华结缕草不同外植体对潮霉素的敏感性存在差异,其中种子经50 mg/L潮霉素处理3周后,发芽率极显著减少,只有6%;愈伤组织经20 mg/L潮霉素处理3周后褐化率达到62%;离体叶片经50 mg/L潮霉素处理7 d后,黄化面积率超过85%。故中华结缕草的种子、愈伤组织、离体叶片在遗传转化中适宜的潮霉素筛选浓度分别为50、20、50 mg/L。     

小立碗藓细胞色素P450基因CYP73A49的克隆与功能分析

本研究克隆了一个小立碗藓（Physcomitrella patens）P450基因CYP73A49,其cDNA全长1629bp,预测编码542个氨基酸。为了进一步研究其生物学功能,利用同源重组技术对CYP73A49基因实施定点突变,成功构建了能诱导其功能缺失的载体,并获得了苔藓的功能缺失突变体。     

植物细胞重编程机制及其在苔藓植物中的研究进展

重编程在植物组织培养和干细胞治疗等领域有潜在的应用价值。目前,影响陆生植物重编程的分子机制还不清楚,而且缺少从进化-发育角度对重编程的研究。通过建立模式生物小立碗藓的再生体系,研究共有因子Pp CSP1/Lin28调控高等植物重编程的作用机制,并对今后的研究进行展望。     

向日葵遗传转化中抗生素适宜筛选浓度的研究

以油用向日葵新葵杂6号品种为材料,采用不同浓度梯度抗生素处理茎尖、子叶、胚轴转化外植体的方法,研究了不同浓度的卡那霉素和潮霉素对向日葵茎尖、子叶、胚轴不同部位遗传转化外植体的筛选效果。结果表明,卡那霉素对向日葵茎尖、子叶、胚轴不同部位转化外植体的筛选适宜浓度为25～30 mg/mL,潮霉素对向日葵茎尖、子叶、胚轴不同部位转化外植体的筛选适宜浓度为7～10 mg/mL;PCR检测结果显示阳性植株外源基因已导入;不同部位的转化外植体对卡那霉素和潮霉素的敏感性存在一定的差异,但未见明显梯度。     

两种遗传标记筛选物对马铃薯再生试管苗的影响

以马铃薯试管苗的单芽茎段为组织培养材料,研究含不同浓度除草剂Basta和不同浓度抗生素Hygromycin培养基对马铃薯试管苗生长状况的影响。结果表明,除草剂Basta对马铃薯试管苗的筛选浓度为0.6～0.8mg/L;潮霉素Hygromycin对马铃薯试管苗的筛选浓度为7～10mg/L。除草剂Basta和潮霉素Hygromycin联合使用对试管苗具有极强致死作用,不宜联合使用。     

菊花对潮霉素敏感性的研究

[目的]探讨菊花对潮霉素的敏感性,为菊花的遗传转化提供理论依据。[方法]以菊花品种45、34、30、44、20、35的愈伤组织为材料,采用MS培养基附加6-BA、IAA、KT,以不同浓度的潮霉素进行处理。[结果]随着潮霉素浓度的增加,全部试材的褐化率均增大,体积增殖均减小。菊花35对潮霉素最敏感,在潮霉素浓度为10 mg/L时,其褐化率为56.67%。在潮霉素浓度小于20 mg/L时,菊花愈伤组织的体积增殖平均为3 mm;在潮霉素浓度大于20 mg/L时,其体积增殖平均为0.5 mm,且其褐化率达70%~80%。作为菊花筛选标记时,潮霉素的适宜浓度为20 mg/L。[结论]菊花对潮霉素的敏感性在基因型间存在差异。来自同一基因型菊花不同部位的外植体对抗生素的反应不同。     

香菇菌丝体对四种抗生素的敏感性

为探究4种常用抗生素对香菇菌丝体生长的影响,筛选适用于香菇遗传转化的抗生素。本研究以香菇[Lentinula edodes(Berk.)Pegler]沪香F2双核菌丝以及其原生质体单核菌丝为材料,通过测试两者在含有不同种类、不同浓度下抗生素培养皿中的生长速率以及抑制率,探究香菇单双核菌丝对氨苄青霉素、卡那霉素、头孢霉素、潮霉素4种抗生素的敏感性。结果表明:氨苄青霉素、卡那霉素、头孢霉素对香菇单双核菌丝生长以及菌落形态基本没有影响,潮霉素对香菇单双核菌丝生长有强烈的抑制作用,12mg·L-1的潮霉素能够完全抑制香菇双核菌丝的生长,14mg·L-1的潮霉素能够完全抑制香菇单核菌丝的生长。卡那霉素不能作为香菇遗传转化的筛选抗生素使用;潮霉素可以用作香菇遗传转化的筛选抗生素;氨苄青霉素和头孢霉素均可以用于对农杆菌的抑制。     

小立碗藓原生质体细胞壁再生过程观察

[目的]小立碗藓具有遗传背景清楚、活体观察方便、生活史短、再生能力强等特点,是研究发育的理想模式植物.[方法]应用0.5％的崩溃酶将生长7d的原丝体酶解,得到新鲜原生质体,先过滤再用8％的甘露醇洗涤,在含有为8％的甘露醇的BCDA液体培养基内培养2d和4d.采用新鲜原生质体、再生2d和再生4d的原生质体作材料,使用透射电镜,观察不同时期原生质体的细胞壁再生过程,并运用实时荧光定量PCR技术分析了细胞壁再生相关基因的表达.[结果]研究结果表明,原生质体培养2d后开始有微纤丝发生,在原生质体培养4d时形成细胞壁结构,细胞开始进行分裂.分析细胞壁再生相关基因的表达量,发现在新鲜原生质体中基因表达量最低,原生质体培养2d和培养4d后,基因表达量均比在新鲜原生质体中的表达量高.[结论]小立碗藓原生质体在液体培养基中培养2d微纤丝发生;原生质体培养4d形成完整的细胞壁结构.     

HPT转基因水稻对选择培养的品种间差异

用基因枪将ｈｐｔ 基因分别导入到不同水稻品种的愈伤组织中,为提高选择培养基的选择效果,进行了培养基和培养基中潮霉素选择浓度的筛选,结果表明ＫＳＰ 培养基的选择效果优于ＬＳ培养基,且ＫＳＰ培养基中潮霉素的选择浓度以５０ ｍｇ／Ｌ以上为宜,同时表明水稻不同品种对选择培养（ 即对潮霉素的抗性） 存在着差异．．