猪瘟病毒河南野毒株E2基因的克隆及序列分析

旨在了解猪瘟病毒流行毒株的变异情况,为防制猪瘟提供科学依据.根据GenBank上已发表的猪瘟石门株E2基因序列,设计合成了1对特异引物,应用RT-PCR技术对河南省一猪场采集的疑是猪瘟病料的猪瘟野毒E2基因进行扩增,将扩增的E2基因克隆于pGEM-T Easy栽体,对其进行了序列测定及氨基酸序列推导,同时将其与HCLV株、C株、Alfort株和Brecsia株进行了同源性比较及遗传进化分析,并构建了CSFV的遗传发生树.通过PCR扩增得到与预期大小相符的产物,克隆测序验证是E2基因;所扩增的流行野毒与HCLV株、C株、Shimen株、Alfort株和Brecsia株核苷酸序列同源性分别为99.0%,96.5%,93.5%,94.4%和89.9%;氨基酸同源性分别97.8%,94.0%,92.6%,92.0%和91.0%;所绘制的遗传发生树显示所测得流行野毒与C株、HCLV株关系较近.所测的流行株与与中国使用的C株疫苗毒核苷酸同源性很高,说明现行的猪瘟疫苗在一定程度上仍然可以起到保护作用.     

河南省猪瘟流行毒的E2基因序列分析和基因分型

采用 RT- PCR和 n PCR扩增出 3株河南省近期 (1999～ 2 0 0 0年 )猪瘟流行野毒的 E2 基因 ,分别克隆于 PMD- 18T载体 ,对其进行了核苷酸序列测定及氨基酸序列推导 ,同时进行了同源性比较及 E2 糖蛋白结构的分析。结果表明 ,所测 3株 HCV E2 基因的长度均为 116 9bp。编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和部分跨膜序列 ,共由 384个氨基酸组成。3株流行毒的 E2 基因核苷酸序列同源性在 99%以上 ,相应的氨基酸序列同源性也在 99%以上 ;这 3株流行毒与 C-株兔脾组织毒 (疫苗种毒 ) E2 基因的核苷酸序列同源性在 83.14 %～ 83.2 3% ,相应的氨基酸序列同源性在 88.14 %～ 88.6 8%。经遗传发生关系分析 ,C-株兔组织毒 C-株细胞毒属于组群 1(group 1) ,河南省近期流行猪瘟毒属于组群 2 (group 2 ) ,近期猪瘟流行毒与 C-株疫苗毒的 gp5 5蛋白之间存在一定的差异     

广西猪瘟流行毒与C-株疫苗毒gp55（E2）主要抗原区DNA序列差异的比较

采用反转录 PCR(RT- PCR)和套式 PCR(nest Polym erase Chain Reaction,n PCR)扩增出 3株广西省近期 (1999～ 2 0 0 0年 )猪瘟流行野毒的 E2 基因 ,将其分别克隆于 PMD- 18T载体上并进行了核苷酸序列测定 ,根据 C株及 Brescia和 Alfort株确定起始氨基酸三联体的正确位置后进行氨基酸序列推导 ,同时进行了同源性比较及 E2 糖蛋白结构的分析。结果表明 ,所测 3株 HCV E2 基因的长度均为 1170 bp,编码的氨基酸序列均包括完整信号肽序列和部分跨膜序列 ,共由 384个氨基酸组成。3株流行毒的 E2 基因核苷酸序列同源性为 90 .10 %～ 98.5 4%,相应的氨基酸序列同源性为 89.5 9%～ 97.92 %。这 3株流行毒与 C-株兔脾组织毒 (疫苗种毒 ) E2 基因的核苷酸序列同源性为 82 .87%～ 83.99%,相应的氨基酸序列同源性为 86 .98%～ 90 .10 %,表明近期猪瘟流行毒与 C-株疫苗毒的 gp5 5蛋白之间存在一定的差异。     

猪瘟病毒新疆南疆野毒株E2基因高变区扩增及序列分析

参考已发表在GenBank中CSFV Alfort毒株的E2蛋白基因序列，选择其抗原编码高变区作为扩增的靶区域，设计了一对特异性引物。用异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法提取猪瘟病料细胞总RNA，对其进行了RT—PCR扩增。结果得到了与设计大小272bp完全相符的核酸带，并对PCR产物直接进行了核苷酸序列测定。将所测序列与中国C株同段序列进行了比较和分析。结果发现与中国C株核苷酸的同源性均为82．8％；推导的氨基酸同源性为88．3％；两野毒株均有33个碱基发生改变。并用此病料对加日龄易感仔猪成功进行了人工感染试验，结果发现能引起比较典型的猪瘟临床症状和病理变化，表明新疆南疆存在着中等或倔强毒力的野毒株。     

2006—2007年陕西省古典猪瘟流行毒株E0基因的克隆及序列分析

根据GenBank上发表的古典猪瘟参考毒株Shi men毒株全基因组序列,设计并合成2对引物,采用巢式RT-PCR技术,从陕西省猪病料中成功扩增出9株猪瘟流行毒株E0全基因并测定其核苷酸序列,与已发表的ALD、Alfort187、Brescia、C HVRI、CAP、Shi men、GXWZ02和HCLV等代表毒株进行同源性比较分析。核苷酸分析表明:这9株猪瘟流行毒株可以分为2大群,1株(LN163)属于群I,与Shi men强毒株、HCLV疫苗株和GXWZ02野毒株等代表株的同源性为80.8%~82.4%;另外8株属于群II,毒株之间E0基因核苷酸序列的同源性为93.6%~99.6%。氨基酸序列分析表明:9株流行毒株中,群I中的LN163毒株与我国野毒参照株GXWZ02的同源性只有83.9%,而其余8株与GXWZ02株氨基酸序列的同源性为94.4%~98.1%,形成明显不同的进化分支;同时这9株流行毒株与我国疫苗株HCLV和经典强毒株Shi men的氨基酸序列同源性分别为88.0%~89.5%和89.1%~91.8%,均呈现较明显的变异。     

2个猪瘟野毒株E2基因主要抗原区域的扩增及其序列分析

用RT-PCR技术对华东地区2份猪瘟病料的E2基因主要抗原编码区域进行了扩增和序列分析。结果表明这2个毒株的棱苷酸序列同源性为97．321％、氨基酸序列同湃性为100％，但2个毒株的序列与我国的标准强毒Shimen株、疫苗毒HCLV株的差异较大，核苷酸序列、氨基酸序列均只有80％左右，与法国Alfort、意大利C1W株棱苷酸和氨基酸序列的同源性分别为84％～87％和91％。参考国内外对猪瘟病毒基因组的分型方法，将这2株猪瘟病毒归为基因Ⅱ型。     

猪瘟病毒石门株动物传代脾毒与组织培养细胞毒E2基因序列的分析

根据已发表的猪瘟病毒基因组序列,设计合成了2对引物,以脾毒和细胞毒总RNA为模板,利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、套式聚合酶链式反应(nPCR)及测序技术,对多次动物传代和致细胞病变的猪瘟病毒主要囊膜糖蛋白E2基因的核苷酸序列进行了测定,用DNAstar软件比较分析了E2基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性。结果发现,脾毒和标准石门株核苷酸序列的同源性为99.4%,氨基酸序列的同源性为99.0%;细胞毒与标准石门株核苷酸序列的同源性为98.3%,氨基酸序列的同源性为96.7%。由此说明,猪瘟病毒经猪体多次传代和组织培养致细胞病变后,均能保持遗传的稳定性。     

陕西省部分地区猪瘟流行毒株与疫苗毒株E2基因主要抗原区序列变异分析

研究陕西省猪瘟病毒E2基因主要抗原区变异情况,为猪瘟防控提供依据.用巢式PCR方法对猪瘟疫苗和采自陕西省部分地区的疑似猪瘟病料进行E2基因主要抗原区扩增并测序,将测序结果与HCLV疫苗株和Shimen株E2基因进行序列比对分析.结果表明,23株流行毒株之间的核苷酸同源性在86.0％～100％,氨基酸同源性在87.8％～...     

猪瘟病毒石门株E2基因序列分析

经非猪瘟免疫猪增殖猪瘟病毒石门株,从抗凝血中直接提取病毒RNA进行RT-PCR,获得了猪瘟病毒石门株E2基因片段。克隆后测序,结果表明石门株的E2囊膜糖蛋白与国外报道的5株猪瘟病毒的E2囊膜糖蛋白具有相同的骨架结构,即均具有15个半胱氨酸残基和5个潜在糖基化位点,此外石门株也具有保守序列RYLASLH。同源性比较表明,石门株与日本的ALD株和GPE#+-株同源性最高,而与欧洲的Alfort株同源性最低。与国内的疫苗种毒（482代）、疫苗毒以及国外使用的中国猪瘟兔化弱毒株同源性比较表明,石门株与种毒(482代)同源性最高,其次为国外使用的中国猪瘟兔化弱毒株,而与国内使用的疫苗毒同源性最低。本研究提示国内疫苗毒的E2基因在生产中有较大变异,可能导致抗原漂移。     

猪瘟兔化弱毒株E~(rns)基因的克隆及序列分析

从兔脾组织中提取猪瘟病毒兔化弱毒株RNA,利用RT-PCR技术,扩增了猪瘟兔化弱毒的第一个囊膜糖蛋白基因Erns,并对其进行了序列分析。核苷酸序列比较发现,CSFV与Brescia株和GPE-株的同源性为94.6 %,与石门毒株和Alfort/A19株的同源性为95.0 %,与ALD株的同源性为95.4 %。根据核苷酸序列推导出氨基酸序列,并进行氨基酸序列同源性比较,结果表明,CSFV与Alfort/A19株和ALD株的同源性为93.8 %,与GPE-株的同源性为93.0 %,与石门毒株和Brescia株的同源性分别为94.7 %和95.2 %。 rns     

用RT—PCR法对猪瘟病毒检测的研究

用异硫氰酸胍-酚-仿一步抽提法提取病料细胞总RNA并进行反转录，再以此产物为模板对CSFV可疑病料进行了PCR扩增。结果用CSFV特异性引物扩增能得到与设计片段大小相同的产物(272bp)，并且不扩增猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒的核酸；其敏感性要高于猪瘟荧光抗体染色法、猪瘟强弱毒酶标单克隆抗体染色法和电镜负染法，为临床上猪瘟的诊断提供了一个快速、有效的诊断方法。     

广西猪瘟病毒E2基因克隆及序列分析

[目的]了解广西猪瘟病毒(CSFV)流行毒株的变异规律及其与疫苗株的基因差异,为正确选择猪瘟疫苗和防制广西猪瘟提供参考依据.[方法]以广西本地的阳性猪瘟病料为研究对象,应用RT-PCR扩增CSFV的E2基因,经克隆、测序后用DNASTAR软件对其序列进行比对分析,并绘制遗传进化树.[结果]从41份疑似猪瘟病料中共扩增出4个阳性样品的E2基因(1140 bp),经序列比对分析发现,扩增获得的4株CSFV毒株(GXGG1、GXLC1、GXLC2和GXNN1)与兔化弱毒株(HCLV)、Shimen强毒株的核苷酸同源性为82.1%~82.3%和82.9%~83.4%、其推导氨基酸同源性为88.4%~89.2%和88.9%~90.0%,4株毒株间的E2基因核苷酸及其推导氨基酸同源性分别为90.8%~99.6%和94.2%~99.5%,且均属于基因群Ⅱ;E2基因推导的氨基酸表明,E2蛋白空间结构及抗原结构的氨基酸位点693Cys、737Cys、792Cys、818Cys、828Cys、856Cys、833Pro、834Thr、837Arg均未发生变异,但其单抗识别位点G713E、N729D、K734R发生变异.[结论]近年来广西CSFV流行毒株的变异未出现较大差异.与HCLV株、Shimen强毒株亲缘关系较远,但与Paderborn株、GXWZ02株亲缘关系较近.     

浙江部分地区猪瘟流行现状的调查与分析

为了解当前浙江省猪瘟流行情况,对浙江省8个地市的18个疑似猪瘟发病场的流行病学资料进行调查与分析。结果表明,浙江省猪瘟以非典型为主,典型猪瘟也同时存在,绝大多数都是在外界诱因（如长途运输、去势、注苗）诱导或其他病原感染下发生,多为3月龄以内仔猪发病且病程较长。母猪存在隐性感染,部分表现为繁殖障碍,一些临床健康猪存在带毒问题。此外,从疑似猪瘟的38份病料中检出猪瘟病毒（CSFV）、猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）和猪圆环病毒Ⅱ型（PCVⅡ）,检出率分别为47.37%,44.7%和23.68%;而PRRSV、PCVⅡ分别与CSFV的混合感染率为33.3%和11.1%。分子流行病学调查结果表明,浙江猪瘟流行株与CSFV石门毒株（Shimen株）和CSFV兔化弱毒株（HCLV株）2个传统毒株的E2核苷酸同源性分别为81.2%～83.0%和83.1%～84.0%,与不同厂家的弱毒疫苗株核苷酸同源性为81.7%～82.6%,说明浙江省猪瘟流行株正朝远离疫苗毒发展并呈现遗传多样性。     

猪瘟病毒石门株NS4B基因的序列测定及分析

采用ＲＴ－ＰＣＲ技术,利用２对引物,从猪瘟病毒（ＣＳＦＶ）强毒石门株感染的猪血中成功扩增了ＮＳ４Ｂ基因,片段大小分别为７５７ｂｐ和７７４ｂｐ。克隆后经酶切鉴定,自动测序和序列分析,结果显示该基因较为保守,与其他猪瘟病毒毒株均有很高的同源性,与同属的ＢＶＤＶＳＤ－１株和ＮＡＤＬ株也有较高的同源性。     

转录靶向猪Jiv基因shRNA细胞株的建立 及抗猪瘟病毒转基因猪的构建

【目的】构建转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的阳性细胞株,通过比较各细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果,筛选对猪瘟病毒增殖有明显抑制作用的细胞株,为抗猪瘟转基因猪的构建提供材料。【方法】研究设计了靶向猪Jiv基因的4个shRNA干扰片段,并构建插入干扰片段的慢病毒(P1、P2、P3、P4)。将慢病毒分别转染PK-15细胞,阳性细胞接种猪瘟病毒后72 h用实时荧光定量PCR检测猪瘟病毒RNA的量,以比较4种干扰细胞株对猪瘟病毒增殖的干扰效果。将对猪瘟病毒增殖有较好干扰效果的P2慢病毒干扰载体转染猪胎儿成纤维细胞,获得稳定表达靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的猪胎儿成纤维细胞株,作为抗猪瘟病毒转基因猪构建的供体细胞,将细胞核移植到成熟的去核猪卵母细胞中,获得体细胞核移植胚胎,移植入受体母猪输卵管中进行转基因猪构建,对获得的转基因猪进行外源基因的鉴定。【结果】获得了4株转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段的PK-15细胞株,其中转入P2干扰载体的细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的抑制作用,将转入P2干扰载体的猪胎儿成纤维细胞株为核供体细胞通过体细胞核移植,获得经鉴定为外源基因插入阳性的转基因猪。【结论】细胞Jiv基因的表达对猪瘟病毒的增殖有一定的影响,筛选获得的一个干扰细胞株对猪瘟病毒的增殖有明显的干扰效果;通过体细胞核移植技术获得一头转入靶向猪Jiv基因shRNA干扰片段（P2）的转基因猪。     

福建省猪流行性腹泻病毒的ORF3基因序列分析

为探讨福建省猪流行性腹泻病毒(PEDV)ORF3基因遗传变异情况,于2014-2015年从福建省不同地区猪场扩增8株PEDV的ORF3基因,并进行序列比对及遗传进化分析。结果表明:8株分离株均为野毒株;与近年来国内及其周边国家的分离株亲缘关系较近,其核苷酸同源性及推导的氨基酸同源性最高高达100%;与经典株CV777亲缘关系较远,其核苷酸及推导的氨基酸同源性达96.0%~96.9%与92.5%~94.7%;表明近年来福建省PEDV流行株较以往的经典株已经发生了改变。