铁盐处理下马铃薯NAC转录因子相对表达量时空差异分析

【目的】为明确马铃薯NAC转录因子在响应铁盐(Fe~(2+))胁迫时的表达特性,本试验对铁盐处理下马铃薯NAC转录因子相对表达量的时空差异进行分析。【方法】基于实验室前期对苗龄20 d的马铃薯品种东农312组培苗施加缺铁(1μmol/L)胁迫处理0、48 h,对其进行转录组测序,发现7个差异表达的NAC转录因子。本试验对MS培养基设置3个Fe~(2+)梯度(缺铁1μmol/L、对照100μmol/L和过量铁500μmol/L),分别用于处理组培条件下继代生长20 d的东农312脱毒试管苗,处理时间分别为0、48和96 h,应用qRT-PCR技术分析上述7个NAC转录因子在根、茎、叶中的相对表达量;并对NAC1～NAC7编码蛋白进行生物信息学分析。【结果】NAC1～NAC7在根、茎中均受缺铁、过量铁处理诱导表达,转录表达水平在处理48、96 h时较0 h时变化显著。在叶中,NAC1～NAC7在这两个时间点的表达量较0 h无显著上调。NAC1～NAC7编码蛋白含有192～413个氨基酸,均含有NAM结构域,预测分子量为22.81～46.98(kDa),PI值为4.65～9.23。【结论】马铃薯NAC转录因子参与响应铁盐胁迫。在缺铁和过量铁胁迫下,7个NAC基因在根和茎中均呈现显著差异表达,在叶中无显著上调表达。     

黄瓜耐镉相关基因CsNAC019的克隆及表达分析

【目的】研究黄瓜耐镉(Cd)分子机制,结合生物信息学分析获得一个NAC转录因子家族基因CsNAC019,对其进行克隆和表达分析,为进一步将该基因用于黄瓜耐Cd品种的改良与选育提供试验基础。【方法】通过PCR技术扩增CsNAC019全长;利用NCBI和DNAMAN进行序列比对和保守结构域分析;利用Expasy、TMHMM等在线软件进行氨基酸组成、稳定系数、亲水系数分析;通过Plant CARE在线工具进行启动子序列分析;采用MEGA 6.0软件根据NJ方法,构建系统进化树;采用q RT-PCR技术检测Cd胁迫后黄瓜CsNAC019在叶中的表达情况,并用DPS 7.05数据处理系统软件进行方差及显著性分析。【结果】CsNAC019含有典型的NAC保守结构域。通过BLAST分析比对,该基因在氨基酸序列上与拟南芥NAC019存在60%的同源性,两者在从N端到C端有A、B、C、D、E 5个氨基酸相对保守区的序列高度一致。该基因CDS序列全长为960 bp,编码319个氨基酸,编码蛋白质分子量为35.66 k D,理论等电点为8.72,不稳定系数为68.18,平均亲水系数为-0.483。启动子分析表明,除含有真核生物启动子固有的TATA和CAAT元件外,CsNAC019的启动子序列还存在G-box、ABRE、W-box、P-box、TCA-element、TC-richrepeats、HSE等多种响应逆境胁迫的顺式元件。系统进化分析表明,CsNAC019与甜瓜、桃、苹果、柑桔、葡萄、大豆等15种植物NAC转录因子有64%—96%的同源性,其中与甜瓜的NAC蛋白同源性最高,为96%。通过q RT-PCR分析发现,与对照相比,CsNAC019在Cd胁迫条件下表达量明显上调(8.2倍)。【结论】CsNAC019为黄瓜Cd胁迫诱导表达基因,推测其可能通过调节下游基因的表达调控黄瓜对Cd胁迫的应答。     

辣椒CaNAC61基因的克隆与表达分析

【目的】为研究辣椒耐盐品种,提高耐盐性和抗旱性,对干制辣椒(Capsicum annuum L.)CaNAC61基因进行克隆、生物信息学和表达水平分析。【方法】采用RT-PCR的方法,从辣椒中克隆得到CaNAC61基因,并分析该基因编码蛋白的理化性质、蛋白质二级和三级结构、系统进化树。采用qRT-PCR分析CaNAC61基因在胁迫处理下的表达情况。【结果】获得干制辣椒NAC转录因子CaNAC61(Genebank登录号:XM_016719693.1)基因,该基因的开放阅读框长度为885 bp,编码294个氨基酸,蛋白质相对分子质量为33.67 kD,理论等电点为6.26。CaNAC61与不同植物中NAC家族成员同源性比对和进化树分析表明,CaNAC61属于NAC转录因子家族ATAF亚家族成员。荧光定量分析表明,CaNAC61在6种非生物胁迫处理下均有响应。其中,NaCl处理下表达上调较为显著,其次是干旱处理。【结论】本文成功克隆出CaNAC61基因,为研究辣椒NAC转录因子的功能提供参考依据。     

秦巴山区六种野生百合感染3种病毒病鉴定及其田间抗病性初步评价

【目的】对来自秦巴山区6种野生百合（岷江百合（Lilium regale）、卷丹（Lilium tigrinum）、野百合（Lilium brownii）、大花卷丹（Lilium leichtlinii var. maximowiczii）、山丹（Lilium pumilum）、宜昌百合（Lilium leucanthum））的病毒病危害程度进行调查,并对黄瓜花叶病毒（cucumber mosic virus,CMV）、百合斑驳病毒（lily mottle virus,LMoV）和百合无症病毒（lily syptomless virus,LSV）3种病毒进行检测,旨在确定野生百合是否感染病毒及感染种类,并初步判断不同种对病毒的抗性。【方法】采用发病率和病情指数统计方法调查野生百合病毒病发病情况,采用RT-PCR检测和克隆测序等分子生物学方法对不同发育时期野生百合黄瓜花叶病毒（CMV）、百合斑驳病毒（LMoV）和百合无症病毒（LSV）进行鉴定。【结果】异地栽培条件下,6种野生百合中除岷江百合外,其它5种野生百合都不同程度表现出花叶、斑驳等病毒病症状。经RT-PCR检测结果显示,岷江百合无病毒侵染,卷丹感染百合斑驳病毒（LMoV）,野百合、大花卷丹、山丹和宜昌百合均被黄瓜花叶病毒（CMV）和百合斑驳病毒复合侵染。【结论】岷江百合、山丹、野百合、大花卷丹和宜昌百合在原生地不带病毒。在异地保存且有毒源存在的条件下,野生百合易感染病毒。不同种野生百合的抗病毒特性不同,岷江百合对病毒病的综合抗性最强,抗病程度为免疫;大花卷丹和宜昌百合,属中感类型;山丹、卷丹和野百合对病毒病抗性为高感类型。     

烟草中NAC类转录因子基因的克隆及分析

 【目的】克隆烟草NAC类转录因子基因,分析其序列特征和表达特性,为深入研究NAC类转录因子对烟草打顶后根系的生长发育与烟碱生物合成之间的关系奠定基础。【方法】采用电子克隆结合RT-PCR获得烟草NtNAC-R1全长cDNA序列,并进行生物信息学分析,用pRESTB原核表达系统进行该基因的原核表达。分别采用RT-PCR和Northern杂交对烟草打顶前、后根尖组织中NtNAC-R1的表达模式进行分析。【结果】烟草NtNAC-R1开放性阅读框架长度为936 bp,编码311个氨基酸,具有NAC转录因子家族典型的保守结构域。系统进化分析表明,该基因与矮牵牛NAC亲缘关系较近,属茄科植物特异NAC家族,在原核细胞中具有表达活性。该基因在烟草根中的表达水平最高,在烟草打顶后2—4 h表达水平下降,随后上升。【结论】从烟草根尖组织中克隆了一个NAC转录因子基因NtNAC-R1,该基因在根系中具有高水平表达,在烟草打顶后2—4 h表达水平显著降低,具有响应烟草打顶所导致的信号传递作用。     

百合LoXTH23基因克隆、生物信息学分析及在鳞茎休眠解除过程中的表达动态

【目的】研究西伯利亚百合(Lilium oriental ‘Siberia’)休眠解除过程中LoXTH23基因的作用。【方法】以西伯利亚百合鳞茎为试验材料,从前期转录组测序结果中筛选出1个休眠解除期差异显著的XTH家族基因,利用RT-PCR技术扩增该基因cDNA全长序列,命名为LoXTH23。采用生物信息学软件对LoXTH23基因结构、理化性质等进行分析;采用荧光定量PCR技术测定LoXTH23基因在鳞茎休眠解除过程中的相对表达量。【结果】LoXTH23基因开放阅读框全长858 bp,编码285个氨基酸,包含GH16结构域,属于XTH家族基因;编码的蛋白相对分子量约为3.19 ku,理论等电点为6.19,是存在跨膜结构域和信号肽的不稳定亲水蛋白;二级结构中以随机卷曲为主,存在30个磷酸化位点;荧光定量PCR结果显示：LoXTH23基因的表达量在鳞茎休眠完全解除10 d时最高。【结论】LoXTH23可能在百合鳞茎休眠解除调控进程中起重要作用。     

南方根结线虫诱导辣椒基因CaRKNIF2的克隆与分析

 【目的】明确辣椒(Capsicum annuum L. HDA149)中与南方根结线虫(Meloidogyne incognita)不亲和互作过程中抗性相关WRKY转录因子的基因结构及其表达模式。【方法】采用RACE结合RT-PCR方法克隆cDNA序列,并根据cDNA序列设计特异引物扩增DNA序列,Southern杂交确定基因拷贝数,实时荧光定量PCR方法分析该基因在线虫侵染后辣椒的不同组织和不同时间点的表达。【结果】从辣椒中克隆到一个WRKY转录因子基因CaRKNIF2(GenBank登录号：GQ253367),该基因编码区全长1 662 bp,编码553个推定的氨基酸,为单拷贝基因。CaRKNIF2基因编码区全长DNA序列2 530 bp,包含5个内含子和6个外显子。在线虫接种诱导处理时,该基因表达具有组织特异性,根尖组织中的表达量最高;接种3 h后在根尖组织中的表达量开始升高,12 h最高,此时相对表达量约为3.1倍。【结论】CaRKNIF2在线虫接种处理后的表达上调,表明该基因参与了抗性基因Me3介导的辣椒与根结线虫的不亲和互作,可能在此过程中具有重要功能。     

‘西伯利亚’百合丙二烯氧化物环化酶基因LsAOC的克隆及其表达分析

【目的】研究茉莉酸(JA)信号途径在花香的形成及释放中的作用。【方法】以‘西伯利亚’百合(Lilium ‘Siberia’)为试验材料,通过RACE技术克隆得到了丙二烯环化酶基因(allene oxide cyclase,AOC),并将其命名为LsAOC。【结果】该基因全长741bp,编码246个氨基酸,与麝香百合和岷江百合的序列极为相似。在不同花期与器官中基因相对表达量存在差异。在花朵不同开放阶段,盛开期表达量最低,在其他3个时期表达量无显著差异。LsAOC在内花被片、叶片、子房和外瓣中的表达水平较高。【结论】AOC基因可能通过JA信号途径在花朵发育中发挥调控作用。     

病原诱导的小麦转录因子TaERF1b基因的分离和表达

 【目的】研究一个病原诱导的小麦ERF转录因子基因在对纹枯病菌、赤霉病菌防御反应中的作用。【方法】应用生物信息学、RT-PCR、RACE方法,从赤霉病菌诱导的小麦中,分离ERF转录因子基因的全长cDNA序列;利用半定量RT-PCR方法,分析该基因对小麦纹枯病菌、赤霉病菌及MeJA、ET和SA处理的应答表达情况。【结果】从赤霉病菌诱导的抗赤霉病小麦品种苏麦3号cDNA中,分离出1个编码ERF转录因子基因的全长cDNA序列。该基因暂被命名为TaERF1b,编码由280个氨基酸组成的蛋白质TaERF1b。TaERF1b具有保守的ERF/AP2结构域,但TaERF1b蛋白全长氨基酸序列与已克隆的ERF蛋白同源性较低（＜36.5%）。TaERF1b基因表达分析的结果表明,纹枯病菌、赤霉病菌侵染可快速诱导抗病小麦中TaERF1b基因的上调表达,该基因转录表达水平在防卫相关激素乙烯、茉莉酸处理早期显著增强,而且TaERF1b对外源乙烯、茉莉酸处理的响应时期早于对纹枯病菌、赤霉病菌的响应时期。【结论】分离出一个受病原诱导的小麦ERF新基因TaERF1b,其编码蛋白TaERF1b为植物ERF转录因子家族的一个新成员,可能通过茉莉酸、乙烯信号途径介导小麦对纹枯病菌、赤霉病菌的防御反应。     

甘蓝NAC转录因子BoNAC2的克隆及表达分析

为探索甘蓝(Brassica oleracea L.)在各种非生物逆境条件下NAC转录因子的表达,以"中甘11号"为材料,克隆获得甘蓝NAC转录因子BoNAC2基因的cDNA全长序列。序列分析表明,该cDNA片段全长为1 002bp,编码333个氨基酸,具有典型的NAC类蛋白的结构特征。进化树分析表明,该蛋白属于SENU5亚族,并与甘蓝型油菜(Brassica napus L.)BnNAC亲缘关系最近。亚细胞定位显示,BoNAC2蛋白分布于细胞核中。qRT-PCR分析表明,BoNAC2基因受PEG和NaCl诱导表达。     

瓜实蝇生物学特性研究

通过对瓜实蝇B actrocera(Z eug od acus)cucurbitae在10、14、18、22、26、30、34和38℃下卵、幼虫和蛹的发育历期及成虫羽化、取食、交尾和产卵等生物学特性的研究表明,瓜实蝇的卵、幼虫和蛹的发育历期随温度的升高而缩短,其最适发育温度在26~30℃范围内。14℃下卵期3.5~4.0 d,平均(3.68±0.14)d,30℃下仅需1 d;幼虫于14℃下历期最长为(9.0~16.0)d,平均(11.73±1.21)d,30℃下最短为4.0~6.0 d,平均(4.83±0.24)d;蛹14℃下最长为24.0~33.0 d,平均(26.95±0.41)d,最短30℃下为6.0~7.0 d,平均(6.39±0.02)d。成虫白天活动,黄昏时交尾,羽化多集中于凌晨。卵产于瓜皮内,以幼虫蛀食瓜肉为害,老熟幼虫脱离瓜果进入土中化蛹。     

二色胡枝子黄酮体外抗氧化活性

通过二色胡枝子黄酮(Lespedeza bicolor flavonoids ,LBF)清除羟自由基、超氧阴离子的效果及抑制猪油、菜油和亚油酸的自氧化来研究其体外抗氧化作用.结果表明:二色胡枝子黄酮对清除自由基有显著作用,且清除率随黄酮浓度的增加而增大;能够明显地抑制猪油、菜油、亚油酸的自氧化,抑制作用随浓度的增大而增强.作为天然的抗氧化剂,二色胡枝子黄酮具有一定开发利用价值.     

关于不定方程5x(x+1)(x+2)(x+3)=18y(y+1)(y+2)(y+3)

运用Pell方程、递推序列、同余式及平方剩余等初等数论知识,证明了不定方程5x(x+1)(x+2)(x+3)=18y(y+1)(y+2)(y+3)仅有4组非平凡整数解(x,y)=(6, 4),(-9, 4),(6,-7),(-9,-7),同时给出该不定方程的全部整数解,分别为(x,y)=(0, 0),(0,-1),(0,-2),(0,-3),(-1, 0),(-1,-1),(-1,-2),(-1,-3),(-2, 0),(-2,-1),(-2,-2),(-2,-3),(-3, 0),(-3,-1),(-3,-2),(-3,-3),(6, 4),(-9, 4),(6,-7),(-9,-7).     

桂花OfPSY、OfPDS和OfHYB基因启动子克隆及表达特性分析

  目的  探究高温和外源脱落酸对桂花Osmanthus fragrans类胡萝卜素生物合成的3个相关基因,包括八氢番茄红素合成酶基因(PSY)、八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)、β-胡萝卜素羟化酶基因(HYB)的调控作用,为阐释桂花类胡萝卜素代谢调控的机制提供研究基础。  方法  根据桂花基因组数据库的序列,从桂花品种‘堰虹桂’‘Yanhong Gui’中克隆OfPSY、OfPDS、OfHYB基因的启动子序列,并进行生物信息学分析,再构建PCAMBIA3301-LUC载体在烟草Nicotiana benthamiana中瞬时表达,结合高温(37 ℃)和200 mg·L?1脱落酸处理,分析启动子活性。  结果  获得OfPSY、OfPDS、OfHYB基因的部分启动子,其长度分别为1 908、1 521及1 830 bp。作用元件分析表明:3个启动子中均存在TATA-box和CAAT-box等启动子基本元件、光响应元件、脱落酸响应元件以及MYB和MYC结合位点。此外,在OfPSY启动子中,存在赤霉素响应元件;在OfPDS启动子中,存在茉莉酸甲酯响应元件、赤霉素响应元件、厌氧诱导型元件参与防御和胁迫的元件;在OfHYB启动子中,存在生长素、乙烯、茉莉酸甲酯等激素响应元件、低温响应元件和厌氧诱导型元件。烟草瞬时转化试验表明:相对高温能激活OfPSY、OfPDS和OfHYB的启动子活性,脱落酸能激活OfPDS和OfHYB的启动子活性。  结论  高温和脱落酸可能通过调控桂花类胡萝卜素合成基因启动子活性,影响桂花类胡萝卜素的积累。图4表5参28     

锈色粒肩天牛幼虫的COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因片段序列分析

  目的  基于分子生物学手段，探讨可快速准确鉴别锈色粒肩天牛Apriona swainsoni幼虫与其他天牛幼虫的目标基因，为该保健昆虫的食药用安全提供保障。  方法  利用线粒体COⅠ、COⅡ、Cytb基因和28S细胞核基因的通用引物分别克隆获得4种基因片段，并进行同源序列检索、多重比对、序列信息分析及进化树构建。  结果  基因克隆最终获得锈色粒肩天牛4种基因序列的片段大小分别为817、545、434和1 088 bp。特殊位点分布结果显示:28S的保守位点占比最高，其后依次为Cytb、COⅠ和COⅡ，变异率则正好相反。COⅠ、COⅡ和Cytb基因片段的碱基组成和替换信息特点均表现为A+T含量>G+C含量，颠换高于转换，28S基因片段则表现为A+T含量  结论  COⅠ、COⅡ、Cytb和28S基因均可作为鉴定该虫的分子生物学参考依据。     

转酿酒酵母HOG1基因拟南芥植株的获得与检测

HOG1(high osmolarity glycerol,HOG1)是酵母中参与耐高渗透压调控的重要基因。根据已发表的酿酒酵母序列,设计特异引物,扩增到完整的HOG1基因;构建植物表达载体pBI121-HOG1,通过农杆菌介导转化拟南芥,获得转化植株种子。对收获的T0代种子进行卡那霉素抗性筛选,并通过PCR和RT-PCR对抗性苗进行检测。结果表明,构建的载体成功转化拟南芥,并获得了13份转HOG1基因苗。     

欧洲千里光CYCLOIDEA(CYC)类SvRAY1基因的克隆及功能分析

  目的  揭示菊科Asteraceae欧洲千里光Senecio vulgaris CYC2类RAY1基因过表达使舌状花发生不同程度变宽现象的机制,进一步探究其产生原因。  方法  克隆欧洲千里光SvRAY1基因,利用生物信息学、实时荧光定量PCR反应(qRT-PCR)、超表达载体构建、扫描电镜观察、转基因植株形态学观察与统计等方法与技术,进一步进行SvRAY1基因功能分析。  结果  qRT-PCR反应显示:SvRAY1基因主要在欧洲千里光舌状花及筒状花中表达,且生殖发育第S3和S4阶段舌状花中表达量最高;形态学观察表明转基因欧洲千里光SvRAY1超表达植株的舌状花比野生型长度较短、显著变宽。扫描电镜观察舌状花腹侧表皮细胞大小与形状,宽度显著变宽的株系中显示远轴端细胞排列紧密且细胞分裂旺盛,中轴端细胞形状由边缘弯曲变为平滑,细胞长度变短且分裂旺盛。  结论  欧洲千里光舌状花发育过程中,SvRAY1基因可能促进细胞横向分裂,进而舌状花细胞形态和排列发生不同程度的变化引起舌状花变宽。图6表2参28     

花生油酸脱氢酶基因AhFAD2A和AhFAD2B的时空表达特征

花生Arachis hypogaea油酸脱氢酶AhFAD2是调控花生种子中油酸与亚油酸比值（oleic acid/linoleic acid,O/L）的关键酶,已确定存在2个编码AhFAD2的基因:AhFAD2A和AhFAD2B,但两者在花生中的时空表达特征尚不清楚。选取2个有代表性O/L的花生品种‘山花15’‘Shanhua 15’（O/L为1）和高油酸花生突变体（O/L大于20）为材料,根据AhFAD2A和AhFAD2B基因3'-UTR核苷酸序列的差异,设计了新型、简便的区分两者的特异性引物,并利用实时荧光定量聚合酶链式反应（qRT-PCR）技术,对2个花生品种的7个不同组织（根,茎,叶,花,开花后20,40,60 d种子）中AhFAD2A和AhFAD2B的表达特征进行了分析。结果表明:AhFAD2A和AhFAD2B在‘山花15’和高油酸花生突变体7个组织中都有表达;其中,在2个花生品种3个不同发育时期的种子中,AhFAD2A和AhFAD2B在开花后40 d的种子中表达量最高,推测在开花至花后40 d这一阶段种子中FAD2的表达量可能对花生最终O/L起主要的调控作用。另外,‘山花15’种子中AhFAD2B的表达量显著高于AhFAD2A,而在高油酸花生突变体种子中则相反,推测花生中AhFAD2B在催化油酸去饱和生成亚油酸的过程中比AhFAD2A可能起更重要的调控作用。     

草酸青霉和棘孢木霉对青枯劳尔氏菌的生防效果

  目的  探究自主筛选获得的2株生防菌棘孢木霉Trichoderma asperellum QZ2与草酸青霉Penicillium oxalicum QZ8对青枯劳尔氏菌Ralstonia solanacearum(简称青枯菌)的生防效果。  方法  以青枯菌作为靶标菌,通过平板培养法、生长曲线法测定2株生防菌及其发酵液对青枯菌生长的抑制作用;通过土培试验、基于稀释涂布法测定生防菌在土壤中对青枯菌的抑制效果。  结果  平板对峙培养试验发现:棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8对青枯菌有显著的抑制作用(P＜0.05),抑制率分别达80.9%和45.9%;棘孢木霉QZ2与草酸青霉QZ8生防菌高温灭菌发酵液对平板培养青枯菌,同样呈显著的抑制作用(P＜0.05),抑制率分别达33.3%和34.8%。无菌滤膜处理的未高温灭菌2株生防菌发酵液的青枯菌液培养结果表明:其D(600)显著小于未添加生防菌发酵液的对照D(600)(P＜0.05),且棘孢青霉QZ8抑制效果好于草酸木霉QZ2。土壤培养结果显示:2株生防菌处理的土壤中青枯菌的活菌数量显著低于未添加生防菌的对照(P＜0.05)。  结论  棘孢木霉QZ2和草酸青霉QZ8对青枯菌均有显著的抑制效果,可作为番茄Lycopersicon esculentum青枯病的潜在生防菌。图5表2参32     

MutL调控水稻黄单胞菌的致病力

为了了解水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo)中 的MutL/MutS系统是否参与DNA修复以及是否调控病原菌的致病力,构建了mutL突变体,比较了野生型与mutL突变体的突变率差异,野生型、mutL突变体及其互补菌株侵染水稻的能力。结果显示,mutL突变导致Xoo在H₂O₂胁迫下的突变率显著升高,mutL突变导致Xoo致病力下降,表明DNA错配修复蛋白MutL参与Xoo的DNA修复并正调控Xoo致病力。