葡萄病毒B CP基因植物表达载体构建及烟草遗传转化

葡萄病毒B Grapevine virus B(GVB)是葡萄皱木复合病中栓皮病的病原,为开展抗GVB转基因研究,本研究利用RT-PCR技术克隆GVB外壳蛋白(coat protein,CP)基因,与植物表达载体pRI 101-AN连接构建植物表达载体pRI-GVB CP。采用电击转化法将植物表达载体pRI-GVB CP导入农杆菌LBA4404,并利用农杆菌介导的叶盘转化法将外源基因导入西方烟‘37B’。共获得16个烟草再生株系,PCR检测其中3个株系为阳性,阳性株系播种获得的64株T_1代植株中有30株扩增到目的条带,阳性率为46.9%,表明目的基因GVB cp成功导入烟草并可成功遗传到子代。28株T_1代转基因植株接种病毒进行抗病性鉴定,其中有6株对接种病毒GVB具有抗性。     

利用RNAi 介导的抗病性获得抗2 种花生病毒的转基因烟草

 分别以花生条纹病毒红安株系(PStV-Hongan)外壳蛋白基因(CP),花生矮化病毒轻型株系(PSV-Mi)和花生黄瓜花叶病毒(CMV-CA)复制酶基因2a为模板,通过PCR 方法分别得到PStV-CP 5′ 端,PSV-Mi 和CMV-CA 2a3′ 端150 bp 的片段,3 种片段混合物为模板经PCR 拼接得到450 bp 的片段,此拼接片段通过Gateway 系统重组至植物表达载体pK7GW1WG2,得到含反向重复拼接片段的植物表达载体pK450。冻融法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101 后,叶盘法转化本生烟(Nicotiana benthamiana),经PCR 检测,获得转基因植株。对T1 代转基因植株分别人工接种3 种病毒,66. 7% 的植株表现对PStV 免疫,9% 的植株表现对CMV-CA 的恢复抗性,全部植株对PSV 感病。siRNA 的Northern blot 结果表明,所有转基因烟草植株都含有病毒特异siRNA,siRNA 含量随接种后时间延长而衰减。     

转葡聚糖酶和防御素基因的番茄植株及其对番茄灰霉病的抗性

用根癌农杆菌Agrobacterium tumesfaciens介导法，将烟草β-1，3-葡聚糖酶Glucanase基因、苜蓿防御素alfAFP基因及二者双价基因导入番茄Micro—Tom中，以期获得抗灰霉病的转基因株系，并比较验证双价基因是否具有协同作用。绿色荧光蛋白基因（GFP）活性检测、PCR和Southem杂交检测表明，外源基因分别以1—4个拷贝整合到番茄基因组中。对T1代植株进行接种鉴定表明，转基因植株对灰霉病侵染的抵抗能力较对照明显增强，各株系的抗病能力与外源基因的表达相关，且葡聚糖酶基因和防御素基因对抗灰霉菌表现一定的协同作用。T1株系田间抗病鉴定结果表明，转基因株发病程度不同，病情指数在19—28之间，抗病性均高于对照。所得到的稳定表达的株系可作为抗病育种材料进一步研究。     

超量表达益母草种子抗菌蛋白提高番茄的抗病性

为了验证来自益母草Leonums japonicusHoutt种子的抗菌蛋白基因LjAMP1和LjAMP2对植物病害的广谱抗性,用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导法,将其分别转入台湾圣女番茄品种。结果显示,利用黄萎病菌毒素浸泡番茄离体枝条,处理24h,空载转基因对照和非转基因再生植株枝条全部萎蔫,而LjAMP1和LjAMP2转基因番茄T0代枝条未出现萎蔫的株系比率分别为11.11%和6.25%;用离体叶片接种菌块,分别对T0代抗或耐黄萎病菌毒素的T1代株系接种早疫病菌,接种10天,空载转基因对照和非转基因再生植株的病情指数达到100,而LjAMP1和LjAMP2转基因番茄病情指数最低的株系分别为17.5和10.0,表明转基因番茄能同时提高对黄萎病菌毒素和早疫病的抗性;进而用叶盘法检测转基因植株对番茄青枯病菌的抑制作用,结果显示对真菌病害抗性强的转基因植株叶片对青枯病菌的抑菌圈更大。转基因番茄抗病鉴定结果表明,来自益母草种子的LjAMP1和LjAMP2基因对植物病害具有广谱抗性。     

马铃薯转GhABF2转录因子苗耐盐性研究

以转GhABF2转录因子马铃薯试管苗为材料,进行苗期耐盐性研究,以期了解该作物对逆境的适应性。实验结果表明:在不同浓度NaCl胁迫条件下,转GhABF2基因株系材料(T1、T2)与对照未转基因材料(WT)植株的干鲜重、生理生化指标的变化趋势基本一致,就各性状值的变化来看,转基因植株表现出了明显的抗逆性。随着NaCl胁迫浓度的增加,与对照非转基因植物WT相比,转GhABF2基因材料T1、T2的生物量显著增加;WT、T1、T2的叶绿素含量均随着盐浓度的增加而降低;可溶性糖、丙二醛、脯氨酸,SOD酶活性、POD酶活性均随着盐胁迫浓度的增加而升高;可溶性蛋白含量随着胁迫程度的加重略有下降,但变化趋势不显著。从植株的生长状态、生理生化等性状指标方面来看,转基因植株比对照非转基因植株表现出了更强的抗逆性。     

利用CRISPR/Cas13a编辑技术获得马铃薯抗PVX植株

为探究利用CRISPR/Cas13a系统获得抗马铃薯X病毒（potato virus X,PVX）马铃薯的可行性,通过设计靶向PVX中TGBp1基因的小向导RNA（small guide RNA,sgRNA）,构建CRISPR/Cas13a基因编辑载体,以马铃薯栽培种Désirée为受体材料进行稳定遗传转化,并通过机械摩擦接种法鉴定转基因植株对PVX的抗性。结果显示,成功构建了靶向PVX的PVX-Cas13a载体,并获得了表达Cas13a的转基因马铃薯植株,对其中3个高表达Cas13a的株系进行PVX抗性鉴定,发现在接种PVX 10~20 d后,转基因植株系统叶上无明显发病症状,且PVX积累量均显著低于未接种PVX对照。表明靶向PVX的CRISPR/Cas13a系统能够有效抑制该病毒的积累,这为马铃薯抗PVX育种提供了一条有效策略。     

应用基因工程创造抗黄矮病毒转基因小麦新种质

应用花粉管通道法和基因枪法将大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系外壳蛋白基因导入小麦栽培品种，获得了抗大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系的转基因小麦株系（文献检索证明世界上无任何其它抗病毒转基因小麦报道）。转基因植株经ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测，证明ＣＰ基因可稳定遗传到Ｔ３代；经Ｗｅｓｔｅｒｎ测定，证明ＣＰ基因在转基因小麦中已经得到表达；经带毒蚜温室和田间人工接种试验，获得了一些抗病性明显的后代，并得到了ＥＬＩＳＡ验证     

应用基因工程创造抗黄矮病毒转基因小麦新种质

应用花粉管通道法和基因枪法将大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系外壳蛋白基因导入小麦栽培品种，获得了抗大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系的转基因小麦株系（文献检索证明世界上无任何其它抗病毒转基因小麦报道）。转基因植株经ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测，证明ＣＰ基因可稳定遗传到Ｔ３代；经Ｗｅｓｔｅｒｎ测定，证明ＣＰ基因在转基因小麦中已经得到表达；经带毒蚜温室和田间人工接种试验，获得了一些抗病性明显的后代，并得到了ＥＬＩＳＡ验证     

转ATCIPK23基因烟草植株钾素营养效率研究

通过考察转ATCIPK23基因烟草植株在不同钾浓度下钾及干物质积累的能力，研究了外源基因的导入对转基因烟草植株钾吸收能力的影响。结果表明，在低钾环境下，转基因株系具有明显的生长优势，烟株发育较快、根系发达、生物量较大、植株的含钾率也有明显提高，随着供钾量的减少，这种差异幅度逐渐增大。当供钾浓度为0.1 mmol·L^-1时，对照品种K326植株的平均钾含量为17.7 g·kg^-1，而转基因品系KA12为23.3 g·kg^-1，KA16为24.6 g·kg^-1，KA21为22.1 g·kg^-1，分别较对照品种增加了31.6%、39.0%和27.7%。钾吸收动力学研究表明，转基因植株与对照品种植株的最大吸收效率（V_max）差别不大，而最低浓度（C_min）与米氏常数（K_M）的差别较为明显。     

大豆凝集素基因lec-s转化烟草>增强对烟草花叶病毒的抗性

 将编码大豆凝集素的lec-s基因插入植物表达载体pBI121中,构建植物重组表达质粒pBI121:: lec-s。由根癌土壤杆菌EHA105介导的叶盘法转化烟草,获得了转基因烟草株系。PCR和RT-PCR检测证明lec-s基因已转入烟草植株中。接种烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）进行抗病性试验结果表明,转基因烟草叶片上的病斑数显著减少,说明转基因烟草表现出对TMV的抗性。定量RT-PCR检测发现,接种TMV后,抗病防卫基因（PR-1a、GST1、Pal和hsr515）在转基因烟草叶片中显著上调表达。这些结果表明,大豆凝集素基因lec-s转化烟草可对TMV产生抗性,其作用机制可能在于lec-s基因参与了植物的防卫信号通路,诱导了抗病防卫基因在转基因植株体内的表达,增强了植株对TMV的系统抗性。     

病毒载体介导的基因沉默体系对朱顶红褪绿环斑病毒NSm基因的沉默效应

为探讨烟草脆裂病毒（tobacco rattle virus,TRV）载体介导的基因沉默技术对朱顶红褪绿环斑病毒（Hippeastrum chlorotic ringspot virus,HCRV）运动蛋白基因NSm的沉默效应,以本氏烟Nicotiana tabacum为材料,构建靶向HCRV NSm序列的基因沉默表达载体pTRV2-NSm,经农杆菌Agrobacterium介导侵染烟苗,检测其侵染效率,人工接种HCRV到沉默表达载体处理过的烟苗,通过观察发病症状、统计病情并应用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)技术检测TRV介导的基因沉默体系对HCRV侵染的沉默效应。结果表明,pTRV2-NSm沉默表达载体对本氏烟植株的侵染率达到95.00%,并且对本氏烟的生长无明显影响;与对照相比,经沉默载体处理的烟草植株接种HCRV后发病率显著降低,在接种后14 d发病率下降了90个百分点,病毒积累量明显下降,随着时间延长pTRV2-NSm对病毒的抑制效果持续升高,在接种后14 d对病毒病的防治效果最高,达93.13%;qRT-PCR检测发...     

烟粉虱传播的番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒对不同番茄品种的复合侵染

为明确烟粉虱传播的番茄褪绿病毒(Tomato chlorosis virus,ToCV)与番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)对不同番茄品种的复合侵染情况,于2015年11月在山东省寿光市温室内采集13个番茄品种共390份疑似发病植株叶片,对不同番茄品种的TYLCV抗性和2种病毒的复合侵染以及温室内发病番茄植株上烟粉虱成虫的带毒率进行检测。结果表明,采集的13个番茄品种经分子标记检测鉴定均为TYLCV杂合抗性;不同番茄品种ToCV与TYLCV的复合侵染率存在明显差异,大果番茄粉宴和贝瑞上复合侵染率最高可达73.3%,而樱桃番茄八喜上未检测到这2种病毒的复合侵染。此外,在发病番茄植株上采集的烟粉虱成虫体内可检测到2种病毒,其中烟粉虱ToCV带毒率为90.7%,TYLCV带毒率为80.0%,同时检测到ToCV与TYLCV的概率为71.3%。表明ToCV和TYLCV的复合侵染在山东省番茄生产中普遍发生,烟粉虱可同时携带这2种病毒并广泛传播。     

Constitutive expression of a phenylalanine ammonia-lyase gene from Stylosanthes humilis in transgenic tobacco leads to enhanced disease resistance but impaired plant growth

Transgenic tobacco plants expressing a phenylalanine ammonia-lyase cDNA (ShPAL), isolated from Stylosanthes humilis, under the control of the 35S promoter of the cauliflower mosaic virus were produced to test the effect of high level PAL expression on disease resistance. The transgenic plants showed up to eight-fold PAL activity and were slowed in growth and flowering relative to non-transgenic controls which have segregated out the transgene. The expression of the ShPAL transgene and elevated PAL levels were correlated and stably inherited. In T₁ and T₂ tobacco plants with increased PAL activity, lesion expansion was significantly reduced by up to 55% on stems inoculated with the Oomycete pathogen Phytophthora parasitica pv. nicotianae. Lesion area was significantly reduced by up to 50% on leaves inoculated with the fungal pathogen Cercospora nicotianae. This study provides further evidence that PAL has a role in plant defence.     

南方根结线虫MiV901基因在拟南芥中的异源表达及其表型分析

为明确南方根结线虫Meloidogyne incognita效应蛋白MiV901在其寄生过程中的生物学功能,通过构建MiV901基因的植物表达载体,利用根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的花序浸染法将其转化拟南芥Arabidopsis thaliana,并采用室内人工接种法测定转基因植株对灰葡萄孢 Botrytis cinerea侵染及南方根结线虫寄生的影响。结果显示：经Southern blot检测,MiV901基因以不同的拷贝数插入到转基因拟南芥株系901-6、901-8和901-12的基因组中,且qPCR检测结果证实 MiV901基因能够正常表达。3个转基因拟南芥株系901-6、901-8和901-12叶部接种灰葡萄孢3 d后,叶片上形成的病斑平均直径分别为1.00、1.06、1.05 cm,比野生型对照扩大了9.9%~16.5%。相比野生型对照,转基因拟南芥株系901-12、901-6和901-8接种南方根结线虫2龄幼虫后根系上产生了更多的雌虫和卵块,雌虫数分别显著增加了45.4%、34.4%和23.7%,卵块数分别显著增加了51.2%、 46.3%和31.7%。表明异源表达MiV901基因能够抑制植物免疫,增加拟南芥对灰葡萄孢和南方根结线虫侵染的敏感性。     

Enhancing resistance of transgenic carrot to fungal pathogens by the expression of Pseudomonas fluorescence microbial factor 3 (MF3) gene

Microbial factor 3 (MF3) gene from a plant-growth promoting rhizobacteria Pseudomonas fluorescence was introduced into carrot genome using Agrobacterium-mediated transformation. The obtained transgenic plants expressing MF3 protein were grown in a glasshouse and evaluated for their resistance to phytopathogens. The assays were performed by the assessment of disease symptoms developing on the detached leaflets and petioles inoculated by three fungal pathogens. The results showed that transgenic plants had significantly enhanced resistance to Alternaria dauci, Alternaria radicina and Botrytis cinerea, on average, by 20–40% in comparison to the non-transformed control plants. This is the first report of enhancing plant resistance by expressing the bacterial protein homologous to the family of FK506-binding proteins.     

The influence of carotenoid biosynthesis modification on the Fusarium culmorum and Fusarium oxysporum resistance in flax

Flax engineering to yield increased resistance to pathogens is the goal of this study. Since carotenoids act as antioxidants it is thus postulated that the accumulation of a higher quantity of these compounds in the transgenic plants might improve their resistance to pathogen infection.Our approach was based on the generation of transgenic flax overproducing carotene and analysis of its susceptibility to Fusarium infection. For transformation bacterial gene – crtB was used. As expected, transgenic plants showed increased resistance against pathogen infection.The impact of carotenoids on plant resistance to infection was verified by generation and analysis of transgenic flax with decreased content of carotene. The transgenic plants were obtained by suppression of endogenous flax gene coding for lycopene β-cyclase. Plant analysis revealed decrease in carotene content, however, an unexpected increase in resistance against Fusarium infection was detected. Further analysis of metabolites in the plants revealed that an increase in accumulation of other terpenoids and tocopherols, squalene and menthol were among them. Thus, it is suggested that repression of carotene synthesis results in the redirecting of substrates to other branches of isoprenoids synthesis.We conclude that a general level of antioxidants rather than the presence of any particular compound is the most important factor in resistance of the flax plant to pathogen infection.     

马铃薯Y病毒复制酶基因不同位置cDNA区段介导对PVY的不同抗性

为探究靶序列位置对RNA介导的病毒抗性产生的影响,利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)复制酶基因(nuclear inclusion b,NIb)不同位置的cDNA区段,反向插入双元载体pROKII中,构建了发夹RNA(hairpin RNA,hpR-NA)结构的植物表达载体。将构建的植物表达载体采用冻融法转入农杆菌LBA4404,叶盘法转化烟草NC89,获得转基因植株。攻毒试验表明:PVYNIb基因不同位置cDNA区段介导的对PVY的抗性存在显著差异;3′端1/2处和中间位置的序列可介导高水平的病毒抗性,抗性植株的比例在50%以上,而5′端、5′端1/2处和3′端的序列介导的抗性效率较低,抗性植株的比例仅为10%~30%。Northern杂交显示:抗病植株中RNA的积累量明显低于同类型的感病植株,抗性与RNA积累量呈负相关;抗病转基因植株中有siRNA存在,表明病毒抗性是由RNA介导的。     

黄瓜花叶病毒和马铃薯Y病毒混合侵染烟株对烟蚜取食行为的影响

为探究黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)混合侵染烟株对烟蚜取食行为的影响,利用刺探电位图谱(electrical penetration graph,EPG)技术记录了烟蚜在健康烟株与CMV、PVY混合侵染后不同发病级别烟株上的取食波形。结果显示:烟蚜在健康烟株上的刺探次数最少,在感病烟株上的C波总持续时间均显著长于健康烟株;第1次到达韧皮部前的刺探次数,健康植株上仅为4.00次,3级感病烟株上的为健康烟株上的2倍;在健康烟株上E2波总持续时间为120.65 min,极显著大于2级和3级感病烟株;刺探过程中,感病烟株上的pd波出现次数均高于健康烟株,且pd波II-1和II-3亚波的持续时间也显著高于健康烟株。研究表明,CMV、PVY混合侵染烟株可降低寄主对烟蚜的适合度,且能促进烟蚜对病毒的传播。