中国水仙几丁质酶基因的克隆与表达分析

【目的】克隆中国水仙几丁质酶基因,分析其在水仙不同组织中的表达,为提高中国水仙的抗病性提供参考。【方法】利用RT-PCR技术克隆得到中国水仙几丁质酶基因,对其序列及编码氨基酸序列进行生物信息学分析,通过qRT-PCR分析该基因在感染基腐病、病毒病及褐斑病中国水仙根、叶中的表达。【结果】中国水仙几丁质酶基因的cDNA序列长768bp,编码230个氨基酸,其编码蛋白的分子质量为25.4ku,理论等电点为9.04,为不稳定蛋白,亲水性强,二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主。该基因编码的蛋白与荷兰芹几丁质酶蛋白的亲缘关系最近,隶属于糖苷水解酶19家族,与溶菌酶相似超家族基因的保守结构域类似,推测其可能是兼具几丁质酶和溶菌酶的双功能酶。qRT-PCR分析表明,在水仙基腐病、病毒病及褐斑病发病过程中,水仙几丁质酶基因的表达量均显著提高。【结论】成功克隆得到中国水仙几丁质酶基因,推测该基因可能参与了水仙的抗病过程。     

植物几丁质酶及其在油菜抗真菌病害中的作用

几丁质酶存在于各种生物中,是以几丁质(聚乙酰氨基葡萄糖)为底物的糖苷水解酶,为单基因所编码。根据其氨基酸序列的同源性可把几丁质酶分为18家族和19家族两大类。18家族存在于各种生物中,如病毒、细菌、真菌、昆虫、节肢动物、植物和哺乳动物等,而19家族大多存在于植物中,     

产酶溶杆菌OH11菌株几丁质酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从产酶溶杆菌OH11菌株中克隆到编码几丁质酶的chiA基因.同源性比较发现,其推测产物与产酶溶杆菌C3菌株和N4-7菌株的ChiA有97%以上的序列一致性.基因经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切后连接到含T7启动子的高表达载体pET21a( )上构建重组质粒pChiA,并转化宿主菌BL21(AI)产生BLChiA表达菌株.经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导后发现,BLChiA菌株产生相对分子质量约为75×103的蛋白质.生物活性试验表明,该蛋白能水解几丁质,在几丁质培养基上产生一透明的水解圈,并对立枯丝核菌菌丝的生长有抑制作用.因此该蛋白具有一定的生物防治作用.     

棉花黄萎病不同抗性品种内生菌数量调查与拮抗菌筛选

在不同生长期对棉花黄萎病不同抗性品种的植株根部内生菌数量进行了调查。结果表明,抗病品种内生菌数目少于感病品种,但其拮抗内生细菌比例高于感病品种;进一步对具有拮抗活性的内生菌的产纤维素酶、蛋白酶、几丁质酶等水解酶活性和嗜铁素活性进行了测定,并根据对黄萎病菌抑菌带宽度、产水解酶和嗜铁素活性给予了赋值,筛选出赋值得分最高的7个拮抗内生菌菌株。     

杨树PsChiⅠ基因全长的克隆与表达分析

【目的】克隆川杨几丁质酶基因cDNA全长序列,分析其在病原菌侵染过程中不同时段的表达特征。【方法】以受落叶松-杨栅锈菌(Melampsora larici-populina)单孢子堆菌系Sb052侵染后的川杨叶片为试材,采用RACE法克隆川杨几丁质酶基因cDNA序列,对其进行生物信息学和实时荧光定量表达分析。【结果】克隆到1条川杨几丁质酶基因序列,将其命名为PsChiⅠ(GenBank登录号:KC416180)。该序列全长1 145bp,包含1段960bp的开放阅读框(ORF),38bp的5′非编码区和147bp的3′非编码区。其编码蛋白含有319个氨基酸,具有2条糖苷水解酶19家族特征序列,理论等电点为5.03,为ClassⅠb型酸性几丁质酶,属于几丁质酶第19家族。序列比对和系统进化树结果表明,PsChiⅠ与毛果杨(Populus trichocarpa)几丁质酶基因相似性最高,且亲缘关系最近。实时荧光定量PCR结果表明,菌系Sb052侵染杨树叶片后PsChiⅠ基因在各个时段都有表达,但以侵染后12和48h时的表达量相对较高。【结论】获得了几丁质酶基因全长序列,推测其参与了寄主川杨抵抗真菌的防御机制。     

菊花几丁质酶基因ChCHI的克隆及表达分析

根据GenBank发布的几丁质酶基因的保守序列设计简并引物,采用RT-PCR和RACE技术,克隆到菊花1个几丁质酶基因ChCHI(GenBank登录号为KX881373)。ChCHI基因cDNA全长为1 385 bp,包含960 bp开放阅读框,编码319个氨基酸。ChCHI属于亲水性蛋白,相对分子质量约为35.5 k D,等电点为6.38,为稳定蛋白,二级结构预测表明该蛋白以α螺旋和无规则卷曲为主。蛋白序列比对和进化树分析表明,ChCHI基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族几丁质酶,与薇甘菊(ACO25187.1)几丁质酶蛋白的亲缘关系最近,序列一致性为87%。qRT-PCR分析结果显示,SA处理可以明显提高贡菊叶片中ChCHI的表达量。菊花ChCHI在对抗环境胁迫的分子调控中起重要作用。     

抗真菌海洋细菌L_1-9菌株的几种胞外酶活性测定

采用平板透明圈法和比色法研究了分离自连云港海域对多种植物病原真菌具有抗菌作用的海洋细菌L1-9菌株的蛋白酶、葡聚糖酶、纤维素酶和几丁质酶活性。结果表明,海洋细菌L1-9菌株在蛋白质酶、葡聚糖酶鉴别培养基上能形成明显、清晰的透明圈,在纤维素、几丁质鉴别培养基上形成的透明圈较弱。用不同的产酶培养基对L1-9菌株进行发酵培养,比色法分别测定4种酶的活性,结果表明,海洋细菌L1-9菌株的蛋白酶活性较高,培养44h活性最高,可达551.65U/mL;葡聚糖酶活性培养40 h最高,为243.54U/mL;纤维素酶活性16 h达到最高,为80.53U/mL;几丁质酶活性培养28 h时达到最高,为50.38U/mL。     

贵州木霉NJAU4742几丁质酶基因chi8的克隆、表达和酶学特性研究

[目的]本研究旨在从贵州木霉(Trichoderma guizhouense NJAU4742)菌株中克隆、表达几丁质酶基因chi8并深入研究其酶学特性,分析Chi8水解胶体几丁质的产物,为其在农业生产中的实际应用提供理论依据。[方法]基于序列比对获取chi8与其他几丁质酶基因的同源关系,并设计引物扩增得到完整的chi8序列,利用pET-29a质粒和大肠杆菌BL21进行异源表达;经镍柱纯化后并研究Chi8酶学特性;利用MALDI-TOF/MS检测Chi8水解胶体几丁质的最终产物;基于同源建模法构建Chi8的三维模型并与几丁六糖进行对接获取其催化相关位点信息。[结果]本试验克隆、表达得到的Chi8与哈茨木霉几丁质酶(ACM47359)的序列相似度为93.38%;Chi8在30～40℃酶活性较高且能保持较好的热稳定性,在pH6.0时酶活性为0.50 U·μmol~(-1)·h~(-1);Ca~(2+)可以显著提高Chi8的酶活性,可达到原酶活性的110.62%,而Co~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)均有抑制作用,与酶作用后Chi8酶活性下降至原酶活性的89.70%、60.17%和5.93%;在酸性条件下,Chi8水解胶体几丁质的最终产物主要为几丁二糖[(GlcNAc)_2]。Chi8同源建模结果表明,其含有18个螺旋和15个β-折叠,末端的IMD残基可形成1个咪唑环;底物对接结果表明,Chi8中Asn197、Trp110、Tyr218、Arg274、Arg31可以与几丁六糖形成氢键,可能为该蛋白的活性中心。[结论]本试验克隆、表达得到的几丁质酶Chi8具有良好的生化特性,能够高效水解胶体几丁质并生成壳寡糖,产物主要为几丁二糖。     

嗜酸糖苷水解酶研究进展

随着极端微生物及极端酶的广泛研究，嗜酸酶因其在极端酸性环境中具有高的酶活性和稳定性而倍受关注，并取得了较大的研究进展。嗜酸糖苷水解酶是嗜酸酶中最重要的一类，在生物能源、饲料、食品等工业中具有重要的应用前景。综述了重要嗜酸糖苷水解酶，包括嗜酸淀粉酶、嗜酸纤维素酶、嗜酸木聚糖酶和甘露聚糖酶在基因的挖掘、表达、分子改良嗜酸机制研究以及应用等方面国内外的研究进展，展望了嗜酸糖苷水解酶未来可能的研究方向和发展前景。     

番茄菌根根际土壤产几丁质酶细菌的分离及其几丁质酶活性研究

对盆栽试验根际土壤微生物数量计数结果表明,接种丛枝菌根(AM)真菌苏格兰球囊霉菌(Glomus caledonium)的番茄菌根根际土壤的细菌、真菌、放线菌和产几丁质酶细菌总数显著高于非菌根根际土壤.从番茄菌根根际土壤中分离得到1株产几丁质酶细菌,该菌能够抑制黄瓜尖镰孢的生长.经16S rDNA和生理生化鉴定,该菌为芽孢杆菌属(Bacillus sp.)菌株.该菌在pH 6～8范围几丁质酶活性没有显著差异,产酶的最适温度为35 ℃,最适装液量为1/5(250 mL三角瓶).在几丁质液体培养基中摇床培养125 h后酶活性与蛋白质含量达到平衡.表明:该菌株具有稳定的产几丁质酶能力,因此具有潜在的生物防治功能.     

厚垣普奇尼亚菌Pochonia chlamydosporia产生的几丁质酶对南方根结线虫卵孵化的影响

 【目的】卵寄生真菌厚垣普奇尼亚菌Pochonia chlamydosporia产生的几丁质酶对定居性根结类和胞囊类线虫的卵壳消解起重要促进作用。线虫卵寄生真菌产生几丁质酶的特性是评价食线虫真菌生物防治潜力的重要生化指标之一。【方法】利用NAG法和pNP法分别测定7株不同来源厚垣普奇尼亚菌Pochonia chlamydosporia几丁质酶的降解酶系和外切酶活性。【结果】7个菌株都能够产生外切酶,其中QNAV97-2、NRRL13094、CFCC84963和 CFCC80919菌株能够产生几丁质降解酶系,几丁质酶活性染色检测分别有2条和4条具有几丁质酶活性的蛋白谱带,其中CFCC80919和QNAV97-2分别产生的38.9 kD和39.8 kD几丁质酶可能是已知的CHI43几丁质酶。具有几丁质降解酶活性的4个厚垣普奇尼亚菌对根结线虫的卵孵化抑制率为40.32%～55.15%,未测定出几丁质降解酶活性的3个菌株对根结线虫的卵孵化抑制率不足20%。显微观察处理的南方根结线虫卵壳变形和破坏。【结论】厚垣普奇尼亚菌系产生的几丁质酶能够消解南方根结线虫卵壳,特别是胚前发育期未成熟卵,抑制卵孵化或杀死卵,且在消解卵的过程中起重要作用。厚垣普奇尼亚菌的几丁质酶活性水平可能是造成该类菌杀线活性差异的原因之一。     

黑茶曲霉属和散囊菌属真菌产胞外水解酶能力的比较分析

【目的】曲霉属和散囊菌属真菌是黑茶渥堆中的优势微生物,对形成黑茶风味、品质和生理功能 起关键作用。但在茶叶发酵过程中这些真菌水解酶的差异尚不清楚。【方法】采用鉴别培养基平板检测和酶活 性检测相结合,分析曲霉属和散囊菌属不同菌株在合成培养基上和茶叶发酵条件下胞外水解酶活性的差异。【结 果】鉴别培养基平板检测结果显示：供试的 9 个菌株均不同程度呈现纤维素酶、木聚糖酶和单宁酶活性,7 个 菌株显示淀粉酶活性,2 个菌株显示果胶酶活性,1 个菌株显示蛋白酶活性。同一菌株可以同时分泌多种胞外 水解酶,多个菌株也可以表现同一水解酶的活性,不同菌株产生胞外水解酶能力存在显著差异。在茶叶发酵过 程中,黑曲霉菌株 PE-3 水解大分子碳水化合物酶活性显著高于冠突散囊菌菌株 PE-1。其中,淀粉酶活力达到 33.81 U/mL。而菌株 PE-1 的单宁酶和蛋白酶活性则显著高于菌株 PE-3。其中,单宁酶活力达到 132.09 U/mL。【结 论】在茶叶发酵过程中,曲霉属和散囊菌属的菌株可能具有对不同茶叶成分的选择性,水解酶的协同作用影响 菌株对茶叶成分的利用效率。     

吉富罗非鱼胃肠道几丁质酶的克隆、组织分布和纯化

【目的】几丁质酶是重要的水解酶,能通过水解β-1,4-糖苷键来降解鱼类食物中虾蟹壳所含的几丁质,帮助鱼类消化。了解几丁质酶在罗非鱼不同组织中的表达状况,以及从罗非鱼胃中所提取几丁质酶的特性。【方法】从吉富罗非鱼胃和肠组织中克隆获得3种几丁质酶tChit1a、tChi3和tChit的开放阅读框序列进行序列分析,并通过Real-time PCR检测其组织分布状况;通过几丁质亲和层析法纯化罗非鱼胃组织中的几丁质酶,并通过4-MU法检测酶活性。【结果】tChit1a、tChi3和tChit几丁质酶基因分别编码453、453和473个氨基酸,同源比对结果显示tChit1a与t Chi3的相似度为83.66%,而tChit与tChit1a、tChi3的相似度则较低,分别为49.89%和50.11%。进化树分析结果显示,这3种几丁质酶是鱼类三型几丁质酶,为非酸性几丁质酶。组织分布结果显示,tChit1a、tChi3和tChit分别在罗非鱼中肠、前肠和中肠后表达量最高。纯化罗非鱼胃几丁质酶的结果显示,SDS-PAGE胶在40 ku附近有两条明显条带,但用斜带石斑鱼1型几丁质酶多克隆抗体检测,没有检测到同源性高的条带。检测纯化产物几丁质酶的活性,结果显示,在最适pH值为5时,纯化产物降解4MU-(GlcNAc)_2和4MU-(GlcNAc)_3分别为1.73、4.89 U/g。【结论】罗非鱼胃组织中所提取的几丁质酶表达量和活性均较低,这可能与罗非鱼为杂食且偏素食的食性有关。     

稻瘟病菌一假定几丁质酶在毕赤酵母中的表达

本研究从稻瘟病菌菌株Guy11中提取总RNA,利用RT-PCR方法扩增到一假定几丁质酶基因MGG_08054.6的cDNA序列,将其亚克隆至带有His-tag标签的酵母表达载体pPIC3.5K中,构成重组质粒pPIC3.5K-ws,电击转化至毕赤酵母菌菌株GS115,通过MD-MM平板筛选及PCR验证获得重组酵母转化子GS115-PICH-ws;阳性转化子在甲醇诱导下,成功分泌出重组蛋白.SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子质量为48 ku,与其理论计算值基本相符;Ni-NTA法分离纯化后的重组蛋白经DNS法测定具有几丁质酶活性.     

黏质沙雷氏菌C8-8几丁质酶基因的克隆与表达

利用PCR方法从黏质沙雷氏菌(Serratia marcescens)C8-8中克隆到编码几丁质酶的chiA基因,大小为1 692 bp,推测其编码一条长563个氨基酸的多肽链,分子量约为60 900。同源分析研究结果表明从C8-8中克隆的chiA基因序列与黏质沙雷氏菌株141(DQ 990373.1)和14041菌株(DQ 493896.1)的chiA基因序列相似性最高,达到99%。结构域分析结果表明从C8-8中克隆的chiA基因N末端(23 AA)存在典型的信号肽序列,C端存在另外两个结构域,即PKD区(73 AA)和几丁质酶催化区(387 AA)。采用大肠杆菌表达系统重组表达chiA基因,结果表明重组菌株在几丁质诱导培养基上能产生透明的水解圈。采用SDS-PAGE电泳分析,结果表明chiA重组表达产物的相对分子质量约为60 000,与预测分子量大小基本一致。初步提纯后,生物活性试验结果表明该重组表达产物能水解几丁质,在几丁质培养基上产生透明的水解圈。     

海洋低温几丁质酶菌株筛选、鉴定及酶谱分析

以胶体几丁质为唯一碳源,从大连渤海湾的底泥样品中分离到1株高产低温几丁质酶的海洋细菌,命名为DL-06。由菌株的形态特征结合16SrDNA系统发育分析,初步确定该菌株属于交替假单胞菌(Pseudoalteromonas sp.DL-06)。该菌株经30h摇瓶发酵后测定粗酶液几丁质酶酶活为9.184U/mL,最适反应温度为15℃,60℃孵育1h仍保持50%以上的酶活性,表明该低温酶具有一定热稳定性。经SDSPAGE及酶谱分析,该菌株能够产生至少3种以上不同分子质量的几丁质酶组分。Pseudoalteromonas sp.DL-06产几丁质酶在低温下高活性与热稳定特点,使其具有潜在的工业应用价值。     

秦岭辛家山不同林分土壤酶活性的剖面分布特征

土壤酶是土壤生态系统的重要组成成分，在土壤物质循环和能量交换过程中发挥着重要作用。调查了秦岭辛家山林区红桦（纯林）、云杉（纯林）和灌木3种天然次生林，分析了不同土层（0~10、10~20、20~40 cm和40~60 cm）β-1,4-木糖苷酶、β-1,4-葡萄糖苷酶、纤维二糖水解酶和β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶活性的分布状况，并采用相关分析法分析了4种酶活性与土壤养分的相关关系。结果表明:1）红桦林土壤β-1,4-葡糖苷酶和β-1,4-木糖苷酶活性均高于云杉林和灌木林，云杉林土壤纤维素二糖水解酶活性高于红桦林和灌木林，而灌木林土壤β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶活性高于云杉林和红桦林；2）除云杉林的纤维二糖水解酶外，3种林分土壤β-1,4-葡糖苷酶、β-1,4-木糖苷酶、纤维素二糖水解酶和β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶活性均在0~10 cm达到最大值，且随着土层的加深而减少；3）相关分析表明，3种林分类型β-1,4-葡糖苷酶、β-1,4-木糖苷酶、纤维素二糖水解酶和β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷酶活性均与土壤SOC、EOC、DOC和MBC显著正相关。表明酶活性在土壤的剖面变化不仅受到林分类型的影响，土壤养分含量同样是影响其分布的重要因素。     

草莓细菌叶斑病病原鉴定

采用形态观察、生理生化特性测试等传统的细菌鉴定方法和16srDNA碱基序列测定等现代的细菌鉴定方法鉴定草莓细菌叶斑病菌株。结果表明：该菌株可利用的碳源有葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、D-海藻糖、淀粉、甘露醇、肌醇、L-缬氨酸、L-精氨酸。硝酸盐还原试验为阳性,淀粉水解阴性,明胶水解阴性,油脂水解阴性,精氨酸双水解酶阳性,接触酶阳性;鉴定该菌株为草莓黄单孢菌（Xanthomonas fragariae）。     

蝉拟青霉几丁质酶基因片段的克隆及其序列分析

通过对蝉拟青霉进行诱导产几丁质酶,采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定其酶活性,发现：有2株不同采集地点的菌株酶活力较强。根据Genebank中多种真菌几丁质酶氨基酸序列的保守区设计引物,以蝉拟青霉基因组DNA为模版,通过PCR扩增获得2个菌株的特异性DNA片段：其中,GZAAS10．0604为563bp,含有3个内含子;GZAAS10．0601为398bp,无内含子。其对应的氨基酸序列均具有几丁质酶18家族的2个高度保守的活性区域：几丁质结合区域SXGG和酶作用活性位点DXXDXDXE。     

定点突变鉴定Myxococcus sp.V11麦芽糖基海藻糖水解酶MTHase的催化中心

[目的]麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)是一种水解与α-1,1糖苷键相邻的α-1,4糖苷键,生成麦芽寡糖和海藻糖,是以淀粉为底物生产海藻糖工艺中的关键酶.实验室从菌株Myxococcus sp.V11基因组中克隆到麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因并异源表达,通过氨基酸序列分析和三维建模,推测其可能的催化中心氨基酸残基构...