共表达禽流感病毒HA和NA基因的重组禽痘病毒在SPE鸡的免疫效力试验

将禽流感病毒A/GooSe/Guangdong/3/96(H5N1)毒株的HA和NA2个基因同源重组到禽痘病毒基因组中,获得了能同时高效表达这2种蛋白的重组禽痘病毒(rFPV-HA-NA).将rFPV-HA-NA经翅膀刺种途径接种8周龄SPF鸡,免疫后4周分别用1 0 LD.的高致病力禽流感病毒(HPAIV)A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1)和A/FPV/Rostock/34(H7N1)毒株进行攻击.结果重组禽痘病毒免疫鸡群诱导产生了高水平的抗体,能够完全抵抗H5N1和H7N1亚型病毒的致死性攻击;并可有效阻止病毒在泄殖腔的排出.而禽痘病毒免疫组和非免疫对照组在攻毒后全部发病并死亡.     

表达禽流感病毒核蛋白基因重组禽痘病毒的构建及其免疫保护性研究

 从含有禽流感病毒A/Goose/Guangdong/1/96 (H5N1)核蛋白 (NP)基因的质粒pUCNP中切下NP基因片段 ,将其亚克隆到pSY5 38质粒 ,再将带有痘苗病毒启动子P11的LacZ基因也平端克隆到pSY5 38质粒 ,然后切下同时含有NP及LacZ基因的片段 ,再亚克隆到禽痘病毒载体pSY6 81,从而构建出表达核蛋白基因的重组禽痘病毒转移载体pSY(NP +LacZ)。应用脂质体介导的方法将转移载体转染已感染禽痘病毒S FPV 0 17的鸡胚成纤维细胞 ,在X gal存在的条件下 ,利用蓝白斑筛选、数轮蚀斑纯化以及PCR、Western blot鉴定 ,结果证明 ,获得了能高效表达AIVNP蛋白的重组禽痘病毒rFPV NP。SPF鸡体内的免疫保护试验结果表明 ,它能够诱导机体产生较高水平的NP特异性抗体 ,并对H5N1和H7N1这 2种亚型高致病力禽流感病毒的攻击提供一定的保护。     

不同类型H5亚型禽流感疫苗的免疫保护效力比较研究

为比较以我国首个H5亚型禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/1996(H5N1)\[GS/GD/96\]为基础构建的新型重组禽流感病毒灭活疫苗（H5N1亚型,Re\|1株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（H5亚型）、禽流感、新城疫重组二联活疫苗（rLH5\|1株）以及禽流感DNA疫苗（H5亚型,pH5\|GD）的免疫保护效力。分别将四种禽流感疫苗以2.8 μg HA/0.3 mL（肌肉注射）、103PFU/100 μL（刺种）、106EID50/100 μL（滴鼻、点眼）、15 μg/200 μL（肌肉注射）等不同剂量和方式免疫3周龄SPF鸡,首次免疫3周后再加强免疫一次,加强免疫2周后用106EID50的高致病力禽流感病毒（HPAIV） GS/GD/96鼻腔途径进行攻击,观察发病与死亡情况。分别于攻毒后第3 d、第5 d、第7 d采集喉头及泄殖腔拭子进行病毒分离、滴定检测排毒情况,同时检测免疫及攻毒后血清HI抗体的动态变化。所有疫苗均可对免疫鸡形成100%完全保护（不发病、不致死、不排毒）;在病毒攻击前,灭活疫苗（H5N1亚型,Re\|1株）、禽流感重组鸡痘病毒载体活疫苗（H5亚型）、禽流感、新城疫重组二联活疫苗（rLH5\|1株）以及禽流感DNA疫苗（H5亚型,pH5\|GD）所诱导的HI抗体平均水平分别为875log2、6.5log2、5.13log2和7.88log2。新型的基因工程疫苗具有良好的免疫保护性,已经或将在H5亚型HPAIV的防治实践中起到有益的补充作用。     

表达H5亚型禽流感病毒HA基因的DNA疫苗免疫保护效力研究

 表达高致病力禽流感病毒分离株A/Goose/Guangdong/1/96(H5N1) [GD/1/96(H5N1)]HA基因的DNA疫苗质粒pCIHA5具有良好的免疫保护性,为了将其开发并应用于实际,对其免疫保护效力进行了进一步的研究。结果表明,用10、40、70、100和150g pCIHA5和油苗1次免疫后,其免疫保护率分别为12.5%(1/8)、58.3%(7/12)、72.7%(8/11)、50.0%(6/12)、66.7%(8/12)和100%(12/12),其中70和100g剂量组的病毒分离结果     

在DNA芯片平台上探测AIV不同亚型 cDNA

 对以基因芯片技术为基础的检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒的快速诊断技术进行了研究。试验中所使用的病毒为A/Goose/Guangdong/1/96（H5N1）、A/African starling/983/79（H7N1）和 A/Turkey/Wisconsin/1/66（H9N2）。通过RT-PCR获得大约500 bp的禽流感病毒基因cDNAs片段，克隆，从重组质粒扩增DNA片段，并点到玻璃载体上，制成芯片。在病毒RNA反转录过程中，用Cy5标记样品 cDNAs。样品 cDNAs是一个包括禽流感病毒HA和M基因的混合物。依据M基因鉴别型，依据HA基因鉴别亚型。扫描芯片上探针结合位点，杂交信号与预期设想基本一致。结果显示，DNA芯片技术可以提供一种有效的AIV诊断方法。     

H5N1亚型禽流感病毒NS1基因的克隆及在E.coli中的表达

选择一株H5N1亚型高致病性禽流感病毒株A/Goose/Guangdong/1/96(简写为GD/1/96),根据测得的NS基因序列,设计一对特异性引物NS1U/NS1L,RT-PCR方法扩增该毒株的NS1基因。将酶切处理后的基因片段定向克隆到原核表达载体PET-32a( ),并进一步酶切分析和序列测定,鉴定出NS1基因的阳性重组子。阳性质粒转化E.coliBL 21(DE3)感受态细胞,在IPTG诱导下,经SDS-PAGE和Western-blotting分析鉴定,成功的在细菌包涵体中表达出45 kD的NS1融合蛋白。重组蛋白经Ni-NTA His.Bind Resins纯化。     

表达禽流感病毒血凝素基因的重组禽痘病毒的构建

 为构建表达禽流感病毒 ( AIV)血凝素 ( HA)基因的重组禽痘病毒 ,将禽痘病毒启动子LP2 EP2驱动的 H7亚型 AIV HA基因 c DNA和大肠杆菌 Lac Z基因插入禽痘病毒疫苗株 F- 0 1 7的复制非必需区。经蓝斑筛选后 ,对重组病毒又进行了 3次蚀斑克隆。以不同代次重组禽痘病毒核酸为模板 ,利用 H7亚型 AIV HA基因特异的引物进行聚合酶链式反应 ,均扩增出 1条特异的1 .7kb DNA条带。收集不同代次的重组禽痘病毒细胞培养物进行免疫斑点试验 ,均检测到 HA蛋白 ,表明 H7AIV HA在重组禽痘病毒中获得了成功表达。该重组禽痘病毒的构建为 AIV病毒活载体疫苗的研制奠定了基础     

禽流感病毒新疆株A/Duck/XJ/4(H5N1)的PB1、PB2和PA基因测序及进化分析

通过RT-PCR技术对禽流感病毒新疆株A/Duck/XJ/4(H5N1)的PB1、PB2和PA基因分别进行了扩增及克隆,测序结果表明该毒株的PB2、PB1和PA基因全长核苷酸序列分别为2341 bp、2282 bp和2187 bp.同源性分析表明A/Duck/XJ/4(H5N1)株与禽源、野生鸟类和猪源的禽流感毒株均有很高的同源性(86.3%～99.6%).与人源毒株相比,PB2和PA与A/HK/156/97(H5N1)株的同源性较低(86.3%～88.7%);与A/Vietnam/CL01/2004(H5N1)株和A/human/Zhejiang/16/2006(H5N1)株的同源性较高(93.0%～98.8%);PB1与人源毒株A/HK/156/97(H5N1)、A/Vietnam/CL01/2004(H5N1)、A/human/Zhejiang/16/2006(H5N1)同源性为91.1%～93.2%.     

H9亚型禽流感病毒血凝素基因重组禽痘病毒的构建

【目的】获得表达H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组禽痘病毒。【方法】将含禽痘病毒启动子LP2EP2驱动的HA基因,插入到禽痘病毒转移载体pSY681中,获得重组转移载体pSY681/HA。用脂质体将其转染已感染亲本禽痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞,使其在鸡胚成纤维细胞内与禽痘病毒基因组发生同源重组,产生表达HA的重组禽痘病毒rFPV-HA。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选后,对重组病毒进行多次蚀斑克隆,并用间接免疫荧光法对感染重组病毒鸡胚成纤维细胞中HA的表达产物进行鉴定。【结果】以重组禽痘病毒DNA为模板,利用HA基因特异引物进行PCR,扩增出1条约1.7 kb左右的带。以间接免疫荧光法证实重组禽痘病毒能表达HA。【结论】成功构建了表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组禽痘病毒,且构建的重组禽痘病毒能表达具有生物学活性的HA。     

禽流感及其防控措施

流感病毒分为A(甲)、B(乙)、C(丙).目前,从禽分离到的流感病毒均为A型流感病毒,有17种H亚型(H1～H17)和9种N亚型(N1～N9),它们可以组合成153种不同的病毒亚型组合,例如H5N1、H7N2、H7N9、H9N2等.从世界范围内分离的禽流感病毒来看,绝大部分H5亚型禽流感都是对鸡呈高致病性的,H7亚型禽流感病毒对鸡致病性从低到高都有,而H9等其他亚型禽流感病毒基本都是低致病性的.     

Immune Efficacy of a Recombinant Fowlpox Virus Co-Ex-pressing HA and NA Genes of Avian Influenza Virus in SPF Chickens

A recombinant fowlpox virus co-expressing Haemagglutinin(HA)and Neuraminidase(NA)named as rFPV-HA-NA was produced by HA and NA gene of A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)isolate of avian influenza virus recombined into the genome of fowlpox virus. In this study,to evaluate its ability of protecting chickens against challenge with a lethal dose of highly pathogenic isolates of avian influenza virus,eight-week-old specificpathogenic-free(SPF)chickens were vaccinated with recombinant virus or the wildtypefowlpox virus by wing-web puncture. After challenge 4 weeks with 10 LD50 highly pathogenic avian influenza virus H5N1 and H7N1 isolate,all chickens vaccinated with recombinant virus were protected,while the chickens vaccinated with the wildtype fowlpox virus or unvaccinated controls experienced 100% mortality respectively following challenge. This complete protection was accompanied by the high levels of specific antibody response to the respectivecomponents of the recombinant virus.     

H5亚型禽流感重组鸡痘病毒活载体疫苗的免疫效力

利用表达H5亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒疫苗免疫SPF鸡和无母源抗体的商品鸡，通过比较免疫后血凝抑制(HI)抗体应答水平、攻毒后发病率和死亡率等指标评价其免疫保护作用。免疫后21d，重组鸡痘病毒免疫组仅有13％～20％鸡的HI抗体检测呈阳性。在同亚型禽流感病毒攻击后，重组鸡痘病毒疫苗免疫组产生了100％的保护率，而未免疫组全部死亡。结果表明：重组鸡痘病毒疫苗不能激发高滴度HI抗体应答，但可抵御同亚型禽流感病毒致死性攻击，保护效果达到或优于目前应用的灭活苗，显示出良好的应用前景。     

一株鸭源H4N8亚型禽流感病毒的全基因测序及遗传进化分析

【目的】禽流感病毒(avian influenza virus, AIV)根据其表面糖蛋白血凝素(hemagglutinin, HA)和神经氨酸(neuraminidase, NA)的不同,可分为16种HA和9种NA亚型。根据其致病力的差异可分为高致病性禽流感病毒(highly pathogenic avian influenza virus, HPAIV)和低致病性禽流感病毒(low pathogenic avian influenza virus, LPAIV)。虽然H4亚型禽流感病毒为低致病性AIV,感染家禽表现为无症状感染,但其对禽类甚至是哺乳动物是一个潜在的威胁,因此必须要加强对H4亚型禽流感病毒的调查监控。【方法】为了探讨H4亚型禽流感病毒的分子特征及遗传演化规律,对2010年在中国华东地区某活禽市场进行流行病学监测时分离到的一株H4N8亚型禽流感病毒A/duck/Nanjing/1102/2010（简称DK/NJ /1102）进行了全基因组序列测定及遗传进化分析。通过常规的血清学试验确定其HA亚型,提取病毒总RNA,并通过RT-PCR方法分别扩增出其各基因片段,连接 pGEM-Teasy载体上后进行序列测定。利用GenBank中的BLAST工具进行核苷酸序列的同源性分析,并与GeneBank 中的H4亚型流感病毒及其它相关序列进行遗传进化分析。【结果】DK/NJ/1102的HA基因与Mongolia 分离株A/duck/Mongolia/274/2007(H4N3)的核苷酸同源性最高,为98.9%。推导的氨基酸剪切位点序列为“P-E-K-A-S-R-G”,符合典型的低致病性禽流感病毒特征;NA基因与华东地区分离的鸭源毒株A/Duck/Eastern China/n91/2009(H3N8)核苷酸同源性最高,达99.4%;PB1、PA和NP基因均与H1亚型禽流感病毒亲缘关系最近;M基因与A/wild duck/Korea/CSM4-12/2009(H5N1)核苷酸同源性最高,高达99.9%;NS基因与韩国2009年分离的H7N7亚型流感病毒遗传距离最近。NS1蛋白的80-84处氨基酸没有发生氨基酸缺失。【结论】该H4N8亚型禽流感病毒基因组构成比较复杂,可能是一株多基因重组病毒。     

H5N1亚型高致病性禽流感病毒A/goose/Guangdong/1/96株反向基因操作系统的建立

 A/goose/Guangdong/1/96（GSGD/1/96）是中国分离的第1株H5N1亚型禽流感病毒，它不仅是97香港感染并致人死亡的H5N1亚型流感病毒HA基因供体株，而且是中国目前已报到的H5亚型流感病毒分离株的共同祖先。本研究建立了该病毒的8质粒反向基因操作系统，并通过细胞转染成功拯救了该病毒（R-GSGD/1/96）。R-GSGD/1/96在对SPF鸡和 Balb/c小鼠的致病性方面保持了与亲本野毒(W-GSGD/1/96)一致的生物学特性，即对鸡都是高致病性毒株，R-GSGD/1/96与W-GSGD/1/96的静脉致病指数分别为2.01和2.10；救获病毒与野生病毒一样，尽管106EID50经鼻腔感染小鼠后1～2 d内能从肺脏检测到低滴度的病毒，但不能在小鼠体内成功复制。GSGD/1/96反向基因操作系统的成功建立为进一步开展中国高致病性禽流感病毒分离株的生物学特性、遗传衍化及结构与其功能关系研究奠定了基础。     

表达载体pCAGGS显著增强禽流感DNA疫苗的免疫保护效果

【目的】将A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]的HA基因插入鸡β-actin启动子高效真核表达载体pCAGGS，构建了DNA疫苗质粒pCAGGHA5，以提高H5亚型禽流感DNA疫苗的表达水平和免疫保护效果。【方法】将pCAGGHA5和表达GD/1/96(H5N1)HA基因的质粒pCIHA5通过间接免疫荧光法和Western-blot分析检测转染293T细胞后瞬时表达的HA抗原蛋白，随之将pCAGGHA5及pCIHA5分别以100 ?g和10 ?g剂量一次免疫3周龄SPF鸡，4周后用100 LD50的HPAIV GD/1/96(H5N1)鼻腔途径进行攻击。【结果】间接免疫荧光法和Western-blot分析表明2种表达质粒均可正确表达H5亚型HA抗原蛋白，载体pCAGGS表达水平显著高于载体pCI；免疫SPF鸡后，100?g pCAGGHA5可形成5/5的免疫保护，100?g pCIHA5可形成2/4的免疫保护，10?g pCAGGHA5可形成对免疫鸡5/5的免疫保护，而10?g pCIHA5 则基本不能形成免疫保护，pCAGGHA5诱导的HI抗体水平远远高于pCIHA5。【结论】鸡β-actin启动子表达载体pCAGGS可显著提高HA基因体外表达水平和H5亚型禽流感DNA疫苗诱导的保护性抗体免疫反应水平，增强免疫保护效果。     

不同H9N2亚型禽流感病毒分离株致病力研究及HA抗原性变异分析

 【目的】了解近年来中国H9N2亚型禽流感病毒毒力变化和抗原性变异的特点,【方法】对分离于1998—2008年间的25株H9N2亚型禽流感病毒分离株进行了EID50、ELD50、MDT、ICPI、IVPI和8周龄SPF鸡人工感染排毒试验,测定了部分分离株与抗H9N2亚型禽流感病毒Hp参考株HA蛋白单抗2A4和F6的血凝抑制（HI）和中和反应特性,对具有不同反应特性分离株的HA基因进行了序列分析。【结果】不同分离株呈现致病力差异,具多态性特征,3#、12#和14#分离株致病力偏强,能引起部分SPF鸡发病和死亡,人工感染8周龄SPF鸡排毒时间更早,排毒期更长。3#和12#分离株与单抗2A4和F6呈现特殊的反应特性,单抗不能抑制3#和12#的血凝特性,也不能中和病毒感染CEF细胞。HA蛋白氨基酸序列分析表明,3#和12#分离株145位氨基酸发生漂变（S→N）,导致与单抗的血凝抑制反应特性丢失,说明该位点（S145）为H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的一个抗原表位,是血凝抑制抗体结合位点。S145N的漂变导致在145—147位氨基酸多出一个糖基化位点NGT,可能是分离株毒力增强的原因。【结论】本研究结果表明,H9N2亚型禽流感病毒呈现变异趋势,出现了有致病力和抗原性变异流行毒株。S145为H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的一个抗原表位,但有该位点漂变导致的抗原变异毒株出现,并可逃避免疫作用,对该病的防控提出了新的挑战。     

一株鸭源H4N6亚型禽流感病毒A/duck/Shanghai/Y20/2006的全基因组序列测定及遗传演化分析

为了解鸭源H4N6亚型禽流感病毒A/duck/Shanghai/Y20/2006(DK/SH/Y20/06)的来源、特征及其分子演化规律,进一步丰富水禽流感病毒的基因库,对该病毒8个基因片段分别进行了扩增和序列测定,利用分子生物学软件对测序结果进行序列分析,并与GenBank登录的相关病毒进行了遗传演化分析。结果表明,DK/SH/Y20/06的HA基因切割位点附近的氨基酸序列(PEKASR↓GLF)符合低致病力AIV的特征,其分子遗传演化关系属于欧亚分支;NA基因与A/mallard/Yanchen/2005(H4N6)在同一分支内,核苷酸序列同源性为98.3%;而PB2、PB1、NP、PA基因与目前在国内流行的H6亚型禽流感病毒关系密切;M基因与A/environment/Korea/CSM05/2004(H3N1)处于同一分支;而NS基因与A/wild duck/Korea/YS44/2004(H1N2)同源性最高。且DK/SH/Y20/06的8个基因与美洲H4N6亚型AIV分离株均不处在同一遗传进化分支上,相互之间遗传关系较远。可见,DK/SH/Y20/06可能是由H4N6、H6N2、H6N5、H3N1和H1N2等不同亚型来源的基因在鸭体内经过复杂重组演变的一株重组病毒。     

禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达

[目的]研究禽流感病毒H5N1亚型血凝素基因在昆虫细胞中的表达。[方法]将禽流感病毒H5N1亚型HA基因以BamHI和NotI双酶切插入pFastBacI载体构建pFast-H5HA转移载体质粒,然后将pFast-H5HA转入含有穿梭质粒的感受态DH10Bac中发生转座作用,在含有X-gal、IPTG、庆大霉素、卡那霉素和四环素的琼脂平板上筛选白色菌落,通过连续传代4次后获得稳定的重组质粒reBac-mid-H5HA。[结果]将重组质粒reBacmid-H5HA转染Sf9昆虫细胞,获得含有禽流感病毒H5N1亚型HA基因的重组杆状病毒,经间接免疫荧光和Western-blot证实HA基因在昆虫细胞中获得表达。重组杆状病毒表达产物能够凝集鸡红细胞,并能被抗H5N1 HA单抗所抑制。[结论]重组血凝素蛋白在杆状病毒中能获得正确表达,为研制AIVH5亚型检测抗原和亚单位疫苗奠定基础。