肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及nsdA基因中断对其次级代谢的影响

以pSET152和pHL212为出发质粒，通过供体大肠杆菌ET12567（pUZ8002）和S17-1属间接合转移肉桂地链霉菌（Streptomyces cinnamonensis），首次构建并优化了肉桂地链霉菌的接合转移系统。利用PCR介导的基因置换技术快速构建了肉桂地链霉菌nsdA基因 （negative regulator of Streptomyces differentiation）中断载体，通过接合转移导入肉桂地链霉菌工业菌株BIB2005，筛选得到一株遗传稳定表型为AmR、KmS的接合子BIB309。PCR分析结果显示该接合子即为nsdA中断突变株。与出发工业菌株相比，在摇瓶水平上nsdA中断突变株BIB309莫能菌素产能提高了2.7倍。     

耐热链霉菌的分子育种改造

BIB0830是一株可将泰乐菌素转化为乙酰异戊酰泰乐菌素（AIV）的耐热链霉菌工业菌株。以pIJ8600为载体分别构建了acyB1-B2基因整合型表达载体pBIB425和带红霉素突变启动子ermEp*的红霉素抗性ermE基因整合型表达载体pBIB304。通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转移分别将pBIB425、pBIB304和pBIB308（耐热链霉菌的nsdA基因中断载体,本实验室保存）导入工业菌株BIB0830,抗性筛选分别得到接合子BIB425、BIB304和BIB308。PCR验证均为阳性克隆。摇瓶发酵结果表明：与出发菌株BIB0830相比,BIB425和BIB308泰乐菌素转化率分别提高了14%和22%,BIB304无明显影响。     

番茄果实中NEVER—RIPE基因的克隆及其反义表达载体的构建

从粉红期番茄果实中提取总RNA，根据Genebank中NEVER－RIPE（即NR基因）cDNA序列，设计合成特异性引物，用反转录－聚合酶链式反应（RT－PCR）进行cDNA扩增，获得一个715bp左右的扩增产物，克隆于pGEM-T easy载体，测序确定其正确性。将该扩增产物反向克隆到植物表达载体pBI121中，通过PCR及限制性内切酶酶切鉴定重组质粒。将重组表达质粒导入根癌农杆菌LBA4404中，PCR及限制性内切酶酶切确定质粒已被导入。     

提高耐热链霉菌转化泰乐菌素能力的分子改造与育种

BIB0830是将泰乐菌素转化为乙酰异戊酰泰乐菌素(AIV)的耐热链霉菌(Streptomyces thermotolerans)工业菌株。以pIJ8600为载体分别构建了acyB1-B2基因整合型表达载体pBIB425和带红霉素突变启动子ermEp*的红霉素抗性ermE基因整合型表达载体pBIB304。通过大肠杆菌(Escherichia coli)-链霉菌属间接合转移分别将pBIB425、pBIB304和pBIB308(耐热链霉菌的nsdA基因中断载体)导入工业菌株BIB0830,抗性筛选分别得到接合子BIB425、BIB304和BIB308。经PCR验证均为阳性克隆。摇瓶发酵结果表明,与出发菌株BIB0830相比,BIB425和BIB308泰乐菌素转化率分别提高了14%和22%,而BIB304则无明显影响。     

orfX基因整合表达在阿维链霉菌工业育种中的应用

阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）基因组中含有orfX基因，通过增加orfX基因剂量可以提高阿维菌素的产量。本研究以pIJ8600为出发质粒，构建了含红霉素启动子（ermEp*）和orfX结构基因DNA片段的整合型表达载体pWJ827。通过接合转移将pWJ827导入阿维菌素的工业菌株BIB9903中，得到稳定高产的重组菌株BIB0827。高效液相（HPLC）分析结果表明，与出发菌株BIB9903相比，BIB0827发酵产物阿维菌素产量提高了1.5倍，达到3350μg/mL。传代稳定性实验证明，BIB0827传代10代后依然稳定，在工业生产上有较大的应用价值。     

酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因mleA的克隆

苹果酸-乳酸酶是进行MLF的关键酶.该研究以酒类酒球菌31DH(Oenococcus oeni 31DH)的基因组DNA为模板进行其苹果酸-乳酸酶基因mleA的PCR扩增.PCR引物为5'-CGGAATTCATGACAGATC-CAGTAAGTAT-3'和5'-TAGGTACCACACTCTCAACACTCGTAAT-3',引物的5端分别引入EcoRI和KpnI酶切位点.得到的PCR产物约1.6kb.PCR产物回收后用EcoRI-KpnI双酶切,与经同样双酶切的质粒YEp352(大肠杆菌-酵母穿梭载体)进行连接并转化大肠杆菌感受态细胞,筛选重组质粒并用酶切及PCR验证.获得的酒类酒球菌苹果酸-乳酸酶基因的重组质粒命名为pLmleA.     

产L-乳酸的大肠杆菌基因工程菌的构建

含有质粒pKD46的菌株BW25113．在L-阿拉伯糖诱导后，表达λ噬菌体的3个重组蛋白Exo、Bet和Gain，宿主菌就具有了同源重组的能力。利用λ噬菌体的Red重组系统构建了D-（＋）-乳酸脱氢酶基因（1dhA）、乙醇脱氢酶基因（adhE）双突变的大肠杆菌BW25113C工程菌株和乙酸激酶基因（ackA）单突变的大肠杆菌BW25113工程菌株。将表达牛链球菌L-乳酸脱氢酶基因（1dhL）的pSE380质粒转化到BW25113C菌株中发酵培养35h，用HLPC检测产物，尚未发现L-乳酸。     

农杆菌介导的木薯转基因研究初报

将米曲霉植酸酶基因phyA克隆于植物表达载体pB1121的CaMV35S启动子（P35s）下游,构建了含有P35s—phyA-TNOS表达盒的重组质粒pBI-phyA,并用电脉冲法将其导人大肠杆菌中。通过三亲接合将pBI—phyA质粒由大肠杆菌导入根癌农杆菌LBA4404菌株,获得带有phvA基因的根癌农杆菌工程菌株LBA4404／pBI-phyA。用LBA4404／pBI—phyA转化木薯外植体652个,在含100mg／L卡那霉素和250mg／L氨苄青霉素的MS分化培养基上诱导分化芽,获得24株抗卡那霉素转化苗。以转化苗和未转化植株的总DNA为模板,用phyA基因的同源序列为引物,进行聚合酶链式反应（PCR）,结果表明9株转化苗的PCR结果为阳性,初步证明目的基因phvA已经转入木薯中。     

植物青枯菌aac基因突变株的构建及其致病性的测定

根据青枯菌(Ralstonia solanacearum)与群体猝灭相关aac基因序列设计PCR引物,扩增获得了aac基因,并将基因克隆到pGEM-T- easy载体中。将庆大霉素基因插入aac基因内部,使其突变,将含有庆大霉素基因的aac突变基因亚克隆进入自杀质粒pDS132中,构建成aac基因重组自杀质粒pDS-aac’-Gm。将自杀质粒电转化至青枯菌GMI 1000菌株中,通过体内同源重组,置换其野生型的aac基因。通过三步筛选法和PCR扩增鉴定,筛选获得了具有庆大霉素抗性的青枯菌aac基因突变株(GMI 1000-m)。接种番茄结果显示,青枯菌aac突变株的致病性较野生型GMI 1000明显下降。证明aac基因在青枯菌致病过程中具有重要作用。     

表达鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒的构建

以插入鸡Ⅱ型干扰素（IFN－Ⅱ）cDNA序列的重组质粒AIFN为模板，根据鸡痘病毒早晚期启动子PE／L的序列设计上上游引物，鸡IFN－Ⅱ基因的cDNA3'端序列设计了下游引物，采用PCR法扩增包括启动子PE／L和鸡IFN－Ⅱ全长cDNA序列的基因片段。将该扩增片段定向插入鸡痘病毒转移载体1175中，获重组转移载体1175IFN，用以转染已感染鸡痘病毒282E4疫菌株（wt-FPV)的鸡（Gallus gallus)胚成纤维细胞（CEF）。1175IFN与wt-FPV基因组DNA之间的同源重组产生了表达IFN－Ⅱ的重组鸡痘病毒rFPV-IFN-Ⅱ。通过在含X－gal的营养琼脂上连续挑选篮色病毒斑获得并纯化rFPV-IFN-Ⅱ。以细胞病变抑制实验证实，rFPV-IFN-Ⅱ感染的CEF表达了具有抗水泡性口炎病毒（VSV）活性的鸡IFN－Ⅱ。rFPV-IFN-Ⅱ(M.O.I=0.01)感染CEF72h后，培养上清中IFN－Ⅱ的表达量为1280U／mL。动物实验表明，rFPV-IFN-Ⅱ接种雏鸡7d或14d后，其在体内表达的IFN－Ⅱ可显著减轻载体鸡痘病毒对1日龄SPF雏鸡体重增长的抑制作用。