提高耐热链霉菌转化泰乐菌素能力的分子改造与育种

BIB0830是将泰乐菌素转化为乙酰异戊酰泰乐菌素(AIV)的耐热链霉菌(Streptomyces thermotolerans)工业菌株。以pIJ8600为载体分别构建了acyB1-B2基因整合型表达载体pBIB425和带红霉素突变启动子ermEp*的红霉素抗性ermE基因整合型表达载体pBIB304。通过大肠杆菌(Escherichia coli)-链霉菌属间接合转移分别将pBIB425、pBIB304和pBIB308(耐热链霉菌的nsdA基因中断载体)导入工业菌株BIB0830,抗性筛选分别得到接合子BIB425、BIB304和BIB308。经PCR验证均为阳性克隆。摇瓶发酵结果表明,与出发菌株BIB0830相比,BIB425和BIB308泰乐菌素转化率分别提高了14%和22%,而BIB304则无明显影响。     

orfX基因整合表达在阿维链霉菌工业育种中的应用

阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）基因组中含有orfX基因，通过增加orfX基因剂量可以提高阿维菌素的产量。本研究以pIJ8600为出发质粒，构建了含红霉素启动子（ermEp*）和orfX结构基因DNA片段的整合型表达载体pWJ827。通过接合转移将pWJ827导入阿维菌素的工业菌株BIB9903中，得到稳定高产的重组菌株BIB0827。高效液相（HPLC）分析结果表明，与出发菌株BIB9903相比，BIB0827发酵产物阿维菌素产量提高了1.5倍，达到3350μg/mL。传代稳定性实验证明，BIB0827传代10代后依然稳定，在工业生产上有较大的应用价值。     

肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及nsdA基因中断对其次级代谢的影响

以pSET152和pHL212为出发质粒，通过供体大肠杆菌ET12567（pUZ8002）和S17-1属间接合转移肉桂地链霉菌（Streptomyces cinnamonensis），首次构建并优化了肉桂地链霉菌的接合转移系统。利用PCR介导的基因置换技术快速构建了肉桂地链霉菌nsdA基因 （negative regulator of Streptomyces differentiation）中断载体，通过接合转移导入肉桂地链霉菌工业菌株BIB2005，筛选得到一株遗传稳定表型为AmR、KmS的接合子BIB309。PCR分析结果显示该接合子即为nsdA中断突变株。与出发工业菌株相比，在摇瓶水平上nsdA中断突变株BIB309莫能菌素产能提高了2.7倍。     

透明颤菌血红蛋白基因(vgb)表达对委内瑞拉链霉菌秦岭变种生长代谢及瑞拉菌素效价的影响

委内瑞拉链霉菌秦岭变种(Streptomyces venezuelae var.qinlingensis)是瑞拉菌素(Zuelacmycin)的产生菌,为进一步探讨透明颤菌血红蛋白基因(vgb)表达对秦岭变种以及瑞拉菌素产率的影响,利用红霉素抗性基因启动子在委内瑞拉链霉菌秦岭变种中表达vgb基因,并在5 L发酵罐中研究了工程菌株与原始菌株的生长代谢特性及瑞拉菌素的效价.结果表明:在高溶氧条件下vgb基因表达并未对菌丝体生长和氨基氮的消耗产生明显的影响,但提高了对还原糖的消耗,工程菌株发酵瑞拉菌素的效价比原始菌株降低8%;在低溶氧条件下,vgb基因的表达可促进菌丝体的生长和次级代谢,并提高了还原糖的消耗,工程菌株发酵瑞拉菌素的效价比原始菌株提高45%.本研究首次利用VHb蛋白基因表达提高了委内瑞拉链霉菌秦岭变种对氧的利用率和瑞拉菌素的效价,为进一步推动瑞拉菌素工业化生产提供基础资料.     

利用PCR介导的基因置换技术构建阿维链霉菌bkdF-突变株

PCR介导的基因置换技术是一种利用λ噬菌体Red重组系统在微生物中进行基因中断的新方法。实验利用该方法快速构建基因中断载体，并成功地置换了阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）bkdF基因。先合成1对长度分别为58和59nt的引物，其5’端的39nt序列分别与bkdF基因两侧同源，3’端则分别与安普霉素抗性标记盒（aac（3）Ⅳ＋onT）两侧序列一致。以该引物扩增的PCR产物电转化能表达λRed重组酶且含有目标质粒的大肠杆菌（Eschcrichia．coli）菌株BW25113／pU790／pXW1224，获得了阳性重组质粒pXW1230。将该质粒中的大小为4．0kbBglⅡ目的片段插入基因置换载体pHZl35l，再接合转移至阿维链霉菌BJBM9903，筛选得到表型为Apma^RThio^S的接合子。PCR验证并对发酵产物进行HPLC和MS分析，证实该接合子为敞dkdF^-突变株。     

bkdFGH和aveD基因缺失多拉菌素工程菌株的构建

多拉菌素(doramectin)是一种新型大环内酯类抗寄生虫药物,为阿维菌素的衍生物,可由基因重组阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)发酵产生,在畜牧业生产中应用广泛.为获得可用于生产的能够稳定制造多拉菌素的阿维链霉菌工业菌株,本研究以阿维菌素高产菌株SAV939为基础,通过对阿维菌素生物合成基因簇进行遗传改造,构建获得阿维链霉菌突变株S.avermitilis LZ-01和LZ-02.LZ-01是通过同源双交换法构建的支链α-酮酸脱氢酶基因簇(branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase gene cluster,bkdFGH)缺失突变株,自身无法合成多拉菌素,当在发酵过程中添加环己甲酸时即可产生多拉菌素(CHC-B1).LZ-01缺失avermectin D(aveD)基因即获得突变株LZ-02,对其发酵仍可获得多拉菌素,但不再产生无效的CHC-A组分,为分离纯化提供了便利.突变菌株LZ-01和LZ-02的构建为进一步优化发酵条件,提高多拉菌素产率奠定了基础.     

用接合转移方法构建杀虫防病荧光假单胞菌

以经过改造的含有转座子Ｔｎ５的自杀质粒ｐＳＵＰ２０２１为载体，通过接合转移将苏云金杆菌杀虫蛋白基因ｃｒｙ Ｉ Ａ（ｃ）片段插入生防细菌荧光假单胞菌Ｐ３０３菌株染色体组。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹分析分别证实杀虫基因的导入和杀虫蛋白的表达。室内生物测定结果表明新构建的ＰＴ２１０、ＰＴ２１２等荧光假单胞菌工程菌菌株不仅保持了野生型自然菌株对小麦全蚀病良好的抑菌活性，而且表现出对小菜蛾和玉米暝     

变铅青链霉菌66的多效性突变子

变铅青链霉菌ＤＮＡ存在一种异常的位点特异性修饰，使其在含有Ｆｅ＾２＋的电泳缓冲液中电泳时遭到双链切割。用ＮＴＧ诱变变铅青链霉菌ＪＴ４６，获得了一株修饰缺陷突变株，命名为ＺＸ１。该突变菌株除了丧失修饰其ＤＮＡ的能力以外（亦即其ＤＮＡ在含有Ｆｅ＾２＋的电泳缓冲液中电泳时不被降解），在某些基因［如黑色素基因（ｍｅｌ）和某些抗生素抗性基因］的表达方面也发生了变化，同时还丧失了产孢能力和对唾噬体ΦＨＡＵ３的     

辣椒烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸基因(NADPH)在辣椒中的遗传转化及其抗病性鉴定

为了分析辣椒NADPH基因与辣椒疫病抗性之间的关系,明确其在辣椒抗疫病方面的作用,以辣椒NADPH基因为目的基因,利用载体pBI121构建了植物表达载体pBI121-NADPH,采用农杆菌介导法转化辣椒(Capsicum annuum L.)感病品种B12,获得了5个卡那霉素抗性转化株系。对卡那霉素抗性转化植株进行PCR和RT-PCR分子检测发现,这5个转化株系含有目的基因CanNADPH。应用辣椒疫病抗性离体叶片鉴定技术,鉴定转基因植株对疫霉菌(Phytophthora capsici)的抗病性,结果表明,转基因辣椒的发病率较非转基因植株降低了22.2%,其病情指数降低了46.5%,表明辣椒NADPH基因在辣椒抗疫病方面有重要作用。     

牛粪沼渣中多重耐药细菌的环境风险

为研究牛粪厌氧发酵沼渣中多重耐药细菌的环境污染风险，选用畜禽养殖中常用的5种抗生素(红霉素、氨苄青霉素、金霉素、链霉素、环丙沙星)对牛粪沼渣中可培养抗生素抗性细菌进行筛选。结果表明：多重耐药细菌的比例高达76.5%,其中，抗5种和4种抗生素的细菌分别有11,21株。所有多重耐药细菌均对氨苄青霉素具有抗性，抗红霉素、金霉素和链霉素的细菌分别占总多重耐药细菌数的92.0%,89.3%,61.3%。通过细菌16S rRNA测序鉴定，32株具有4种以上抗性的细菌分别属于福氏志贺氏菌、摩根氏菌和假中间苍白杆菌，均为重要的临床致病菌。使用全基因组测序对7株典型多重耐药细菌携带的抗性基因进行分析，共检测出28种抗生素抗性基因，对应9种抗生素抗性类型。通过分析抗性基因及插入序列所在位点信息发现，多重耐药细菌普遍携带含有抗性基因和插入序列共存的质粒，表明抗性基因具有高度的可移动性和较强的传播风险。综上所述，牛粪沼渣中含有大量的多重耐药细菌，可视作抗生素抗性基因的储存库，应重视沼渣农业资源化利用过程中的环境风险监测与评估。     

Turbidimetric assay of tylosin in animal feeds containing urea

A turbidimetric method is described for determination of tylosin in animal feeds containing urea. This method includes several modified or new steps to existing turbidimetric and AOAC plate assays that improve the extraction of tylosin, remove interferences from feeds, free tylosin activity, concentrate tylosin from low-level feeds, and reduce variability of assay results. A larger analytical sample size has been incorporated into the assay to decrease variability of assay results. A methanol-phosphate buffer extraction solution has replaced the hot buffer and methanol extraction solution. A hydrolysis step, which is not contained in the AOAC plate assay, was developed to free tylosin from the tylosin urea adduct that forms over time in feeds containing urea. A disposable C18 column was used to concentrate tylosin from feeds at levels less than 15 ppm. By increasing the analytical sample size from 25 to 100 g, the coefficient of variation for 12 weighings of cattle feed was reduced from 28.4 to 9.3%. Average recoveries from cattle rations containing tylosin at levels of 8, 10, and 100 ppm were 94, 94, and 91%, respectively.     

麻鸭白细胞介素18成熟蛋白基因的克隆、表达及生物学活性

根据GenBank发表的鸭IL-18 cDNA基因序列，设计、合成一对引物，直接从成年麻鸭脾淋巴细胞提取总RNA，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）扩增麻鸭IL-18成熟蛋白基因，扩增产物进行了T-A克隆、测序，获得了麻鸭IL-18成熟蛋白基因全序列，其大小为513 bp，编码一条由170个氨基酸残基组成的多肽。将该基因片段亚克隆到原核表达载体pQE30，构建重组表达质粒pQE30-mDuIL18，转化大肠杆菌M15，并用IPTG 诱导。重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE可检测到相对分子质量为19.76 Ku的重组蛋白，Western blotting证实该重组蛋白可与兔抗鸡IL-18血清发生特异性反应。表达产物以包涵体形式存在，包涵体经变性、复性处理后进行鸭T淋巴细胞转化试验表明，重组蛋白具有明显促进鸭T细胞转化的生物学活性。用mDuIL-18（150 ng or 200 ng /鸭）和AIV 疫苗免疫鸭2周后，HI抗体平均滴度达到7.5–7.7 log 2 ，而只用AIV 疫苗免疫和用mDuIL-18（100 ng /鸭）和AIV 疫苗免疫的HI抗体平均滴度仅达到6.3–6.6 log 2，表明mDuIL-18提高AIV灭活油乳苗诱导的免疫应答。这为研究鸭IL-18结构和生物学应用，以及研制新型免疫佐剂和免疫调节剂奠定基础。     

Improved turbidimetric assay of tylosin in premix and animal feeds not containing urea

A turbidimetric method is described for the determination of tylosin in premix and animal feeds not containing urea. This method includes several modifications of existing tylosin turbidimetric and AOAC plate assays to remove interferences from the feed, to concentrate low levels of tylosin, and to reduce the variability of the assay results. An acidic alumina column cleanup step has been incorporated into the method to remove interferences from feed ingredients. A disposable C18 column was used to concentrate the tylosin from low-level feeds, and the use of a larger analytical sample size has decreased the variability of the assay results. Average recoveries of tylosin added to chicken and swine rations were 98 and 101%, respectively.     

H5N1型禽流感病毒血凝素HA1蛋白在苏云金芽胞杆菌细胞表面的展示及其免疫原性

利用苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统研究在细胞表面展示H5N1型禽流感病毒HA1蛋白的可行性及其免疫原性，为研制既安全有效又能常温长期保藏和运输的禽流感口服基因工程疫苗奠定基础。用部分ha1基因（ha1p）代替S-层蛋白ctc基因中部且位于表面锚定序列slh下游的片段，构建了融合基因ctc-ha1p和 csa-ctc-ha1p；利用电脉冲转化法将含融合基因的重组质粒转入苏云金芽胞杆菌无质粒突变株BMB171中，获得了重组菌株BCCH（含ctc-ha1p，并导入一个载有协助细胞表面展示的csaAB操纵子的质粒）和CH（含csa-ctc-ha1p）。通过血凝和血凝抑制试验以及小鼠免疫学实验证实，2个重组菌株均成功地在细胞表面展示了重组HA1蛋白并具有一定的特异性和免疫原性，其中，CH的效果强于BCCH，说明csa-ctc-ha1p这种融合基因的构建方式更胜一筹。研究结果表明，苏云金芽胞杆菌S-层蛋白CTC表面展示系统可用来研制禽流感口服疫苗。     

大肠杆菌海藻糖磷酸合酶基因的克隆

根据报道的大肠杆菌（Escherichia coli)海藻糖－6－磷酸合酶基因（otsA)，设计引物，通过PCR技术从大肠杆菌XLI菌株的总DNA中扩增到一个1．4kb片段。经克隆、测序分析，该片段长1425bp并含一完整的开放读框（ORF）。在核苷酸水平上，该ORF与已报道的otsA基因具有99．86％的同源性。在氨基酸水平上，其推断性的编码产物蛋白与OtsA具有100％一致性。     

泰乐菌素高效降解菌的筛选及降解特性研究

发酵法生产泰乐菌素过程中会产生大量药渣,因残留抗生素的存在,极大地限制了其资源化利用。本研究采用微生物法降解药渣中残留泰乐菌素。结果表明：从堆放泰乐菌素药渣附近土壤中分离筛选到1株高效降解药渣泰乐菌素的菌株,经16S rDNA鉴定为无丙二酸柠檬酸杆菌（Citrobacter amalonaticus）。该菌株适宜生长pH值为6.0～7.0、温度为30～35°C。在30°C、pH6.5条件下,将无丙二酸柠檬酸杆菌按质量比为10%的量接种于含50 mg.L-1泰乐菌素培养基中,经48 h发酵处理后,95.2%的泰乐菌素被降解。提示利用微生物法可有效降解药渣中残留泰乐菌素。     

谷秆两用水稻202对氮肥的吸收利用

应用~(15)N-尿素研究了谷秆两用水稻202对肥料氮素的吸收利用。结果表明,在施等量尿素的条件下,对照稻308与两用稻202的稻谷性状相似,但202稻草含N量比308(CK)提高37.57％。不同时期施肥,肥料氮在谷、草中的分配率不同,308遵循常规稻的分配规律,而202水稻则有自己的特性,即早期追肥大部分分布于稻穗中,较迟施肥大部分分布于茎、叶中。应用~(15)N标记稻草研究其利用价值,202草粉饲料被草鱼和白鼠的消化率比308草粉(CK)提高13.6％和16.5％,机体的~(15)N回收率比CK提高9.6％和6.0％;202稻草栽培平菇,~(15)N回收率比CK提高19.1％,202稻草有较好的综合利用价值。