orfX基因整合表达在阿维链霉菌工业育种中的应用

阿维链霉菌（Streptomyces avermitilis）基因组中含有orfX基因，通过增加orfX基因剂量可以提高阿维菌素的产量。本研究以pIJ8600为出发质粒，构建了含红霉素启动子（ermEp*）和orfX结构基因DNA片段的整合型表达载体pWJ827。通过接合转移将pWJ827导入阿维菌素的工业菌株BIB9903中，得到稳定高产的重组菌株BIB0827。高效液相（HPLC）分析结果表明，与出发菌株BIB9903相比，BIB0827发酵产物阿维菌素产量提高了1.5倍，达到3350μg/mL。传代稳定性实验证明，BIB0827传代10代后依然稳定，在工业生产上有较大的应用价值。     

蒙古口蘑液体发酵条件的优化

通过单因子试验和正交试验对蒙古口蘑(Tricholoma mongolicum)菌株Q97的发酵培养基组成及发酵条件进行了研究.结果表明:摇瓶发酵最佳培养基组成为豆饼粉 30 g/L,蔗糖 50 g/L,K2HPO4 1 g/L,CaCO3 1 g/L,pH自然,最佳发酵周期为13 d.在上述条件下发酵,最大生物量达到30 g/L,胞外多糖量达到100 mg/L以上.     

蒙古口蘑高密度发酵及其多糖性质的研究

通过对蒙古口蘑菌株Q97在5 L发酵罐发酵工艺的优化,以及250 L发酵罐发酵放大试验,确定发酵罐最佳发酵培养基配方为豆饼粉30 g/L,蔗糖80 g/L,K2HPO41 g/L,CaCO31 g/L。接种量5%,发酵周期为6d~8d,生物量可以达到45 g/L,胞外多糖可以到300 mg/L。利用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）对蒙古口蘑水溶性多糖的分子量进行测定,证明蒙古口蘑水溶性多糖至少含有5种多糖组分,其主要组分重均分子量Mw=3919。     

提高耐热链霉菌转化泰乐菌素能力的分子改造与育种

BIB0830是将泰乐菌素转化为乙酰异戊酰泰乐菌素(AIV)的耐热链霉菌(Streptomyces thermotolerans)工业菌株。以pIJ8600为载体分别构建了acyB1-B2基因整合型表达载体pBIB425和带红霉素突变启动子ermEp*的红霉素抗性ermE基因整合型表达载体pBIB304。通过大肠杆菌(Escherichia coli)-链霉菌属间接合转移分别将pBIB425、pBIB304和pBIB308(耐热链霉菌的nsdA基因中断载体)导入工业菌株BIB0830,抗性筛选分别得到接合子BIB425、BIB304和BIB308。经PCR验证均为阳性克隆。摇瓶发酵结果表明,与出发菌株BIB0830相比,BIB425和BIB308泰乐菌素转化率分别提高了14%和22%,而BIB304则无明显影响。     

肉桂地链霉菌接合转移体系的构建及nsdA基因中断对其次级代谢的影响

以pSET152和pHL212为出发质粒，通过供体大肠杆菌ET12567（pUZ8002）和S17-1属间接合转移肉桂地链霉菌（Streptomyces cinnamonensis），首次构建并优化了肉桂地链霉菌的接合转移系统。利用PCR介导的基因置换技术快速构建了肉桂地链霉菌nsdA基因 （negative regulator of Streptomyces differentiation）中断载体，通过接合转移导入肉桂地链霉菌工业菌株BIB2005，筛选得到一株遗传稳定表型为AmR、KmS的接合子BIB309。PCR分析结果显示该接合子即为nsdA中断突变株。与出发工业菌株相比，在摇瓶水平上nsdA中断突变株BIB309莫能菌素产能提高了2.7倍。     

耐热链霉菌的分子育种改造

BIB0830是一株可将泰乐菌素转化为乙酰异戊酰泰乐菌素（AIV）的耐热链霉菌工业菌株。以pIJ8600为载体分别构建了acyB1-B2基因整合型表达载体pBIB425和带红霉素突变启动子ermEp*的红霉素抗性ermE基因整合型表达载体pBIB304。通过大肠杆菌-链霉菌属间接合转移分别将pBIB425、pBIB304和pBIB308（耐热链霉菌的nsdA基因中断载体，本实验室保存）导入工业菌株BIB0830，抗性筛选分别得到接合子BIB425、BIB304和BIB308。PCR验证均为阳性克隆。摇瓶发酵结果表明：与出发菌株BIB0830相比，BIB425和BIB308泰乐菌素转化率分别提高了14%和22%，BIB304无明显影响。