白菜(Brassica campestris ssp.chinensis)BcMAX2调控腋芽生长的功能分析

MAX2(MORE AXILLARY GROWTH 2)是独脚金内酯信号转导相关基因，其功能与腋芽生长有关。以白菜（Brassica campestris ssp. chinensis）分蘖菜品种‘马耳头’和普通白菜品种‘苏州青’为材料，探究MAX2对腋芽生长的影响。结果表明：从两种材料中克隆得到的BcMAX2其开放阅读框序列没有差异，‘马耳头’的BcMAX2启动子序列有2个碱基的缺失。亚细胞定位分析表明BcMAX2定位在细胞核。在拟南芥中过表达BcMAX2抑制腋芽生长，BRC1表达量升高。在‘马耳头’中沉默BcMAX2能引起BcBRC1表达量降低并促进腋芽伸长。通过对白菜cDNA文库筛选得到197个与BcMAX2互作的候选蛋白，其中多数候选互作蛋白具有结合活性和催化活性，部分候选蛋白还参与植物的信号转导和逆境响应。通过酵母双杂交和双分子荧光互补技术验证最终得到2个与BcMAX2互作的蛋白。试验表明，白菜BcMAX2可能通过促进BcBRC1的表达来负调控腋芽的生长。     

草莓花色苷物质鉴定及关键基因表达分析

建立了应用HPLC–MS/MS快速分离、鉴定草莓花色苷的方法，并对不同果色12个草莓品种的成熟果实进行花色苷定量和定性分析，同时对比分析草莓（Fragaria×ananassa，八倍体）和森林草莓（F.vesca，二倍体）基因组中花色苷合成相关基因的数量和染色体定位，通过RNA-Seq和qRT-PCR分析它们在果实发育过程中的转录水平变化。在草莓中检测到8种花色苷，包括首次检测到的芍药素–3–葡萄糖苷、芍药素–丙二酰葡糖苷和芍药素–3–甲基丙二酰葡糖苷。不同果色草莓果实中总花色苷含量差异较大，均以天竺葵素–3–葡糖苷为主。草莓基因组包含73个花色苷合成相关基因，是森林草莓的3～4倍，均匀分布在4套亚基因组上。RNA-Seq结果显示整体上多拷贝基因在草莓果实中的表达水平没有显著差异，未发生明显的偏向性表达。花色苷合成关键路径基因（PAL1、CHS、CHI、F3H、DFR1、ANS、UFGT），转运基因（GST）和转录因子基因MYB10在草莓果实成熟过程中表达量显著增加，尤其是花色苷积累期，表明这些基因在草莓果实花色苷积累中起关键作用。     

山葡萄转录因子VaMYB4a互作蛋白的筛选与鉴定

以抗寒种质山葡萄(Vitis amurensis Rupr.)‘左山–1’叶片组织为试材，通过Gateway技术构建酵母均一化cDNA文库，库容量为1.36×10⁷ cfu·mL^-1，外源基因插入片段均大于1 kb，重组率为100%，符合后续试验要求。以VaMYB4a^113-252C端调控区段为诱饵，经酵母双杂交筛选获得17个候选互作蛋白，选取2个与非生物胁迫应答密切相关的候选互作蛋白分别在酵母、拟南芥原生质体中进行互作验证，发现锌指类转录因子VaCOL4、VaCOL5均与VaMYB4a全长及VaMYB4a^113-252存在互作关系。经系统进化与蛋白保守结构域分析，推测葡萄COL基因家族中VaCOL2与VaMYB4a具有潜在互作关系，进而通过BiFC验证表明，VaCOL2与VaMYB4发生蛋白互作；顺式作用元件预测表明VvCOL2、VvCOL4与VvCOL5启动子区包含多个激素及逆境应答相关元件，其中VvCOL2包括多个低温响应元件(LTRE)；低温胁迫下，VaMYB4a、VaCOL4与VaCOL5...     

Cry2Aa2 和PamPAP 双价表达载体的构建及其对辣椒的遗传转化

 为了获得既抗虫又抗病毒病，又对人体和环境安全的转基因辣椒（Capsicum annuum L．）材料，将启动子CaMV35S、终止子Nos-ter 及缺失无毒型商陆抗病毒蛋白基因PamPAP 一起插入到植物表达载体pCAMBIA1301-Cry2Aa2-PMI 的多克隆位点上，构建双价表达载体，采用农杆菌介导法将其转入辣椒中，并用PMI/甘露糖筛选体系对转化植株筛选。经PCR 扩增和Southern 杂交检测，结果表明Cry2Aa2和PamPAP 已经整合到辣椒基因组中。进一步经RT-PCR 分析，证实Cry2Aa2 和PamPAP 在T₀ 代转基因辣椒植株中共表达。经抗虫性、抗病毒病表型鉴定：T₀ 代转基因辣椒植株对黄瓜花叶病毒（CMV）和斜纹夜蛾幼虫的抗性均显著高于非转基因植株。     

山葡萄低温诱导酵母双杂三框cDNA文库构建和VaCIPK18互作蛋白筛选鉴定

类钙调磷酸酶B亚基蛋白CBL（calcineurin B-like protein）与其互作蛋白激酶CIPK（CBL-interacting protein kinase）组成的CBL-CIPK系统，在真核生物钙信号转导及各种胁迫应答途径中发挥重要作用。采用SMART与LD-PCR技术构建了山葡萄‘双丰’（Vitis amurensis Rupr. ‘Shuangfeng’）叶片组织低温胁迫下的均一化酵母双杂交三框cDNA文库，库容量分别为1.7 × 106、1.3 × 106与1.9 × 106 cfu • mL-1，外源基因插入片段长度约为500 ~ 2 000 bp，重组率为100%，符合后续双杂交筛选要求。以本课题组前期鉴定受低温诱导表达、具有核质亚细胞定位的山葡萄VaCIPK18全长（VaCIPK18）、激酶结构域缺失（VaCIPK18△S_TKc）以及NAF结构域缺失（VaCIPK18△NAF）为诱饵，进行酵母双杂交筛选，获得了17个候选互作靶蛋白；从中选取并克隆了7个参与非生物胁迫的候选互作蛋白进行酵母回转验证，仅发现1个ABA信号通路上游信号调节因子VaPYL9与VaCIPK18有互作关系。通过酵母双杂交和双分子荧光互补验证，确定了VaPYL9可与VaCIPK18和VaCIPK18△NAF在酵母中物理互作，而在植物拟南芥原生质体中VaPYL9与VaCIPK18△S_TKc和VaCIPK18△NAF互作，但与全长VaCIPK18不互作。     

中国野生毛葡萄芪合酶基因VqSTS11和VqSTS23调控抗白粉病的研究

利用同源克隆法得到抗白粉病的中国野生毛葡萄‘丹凤–2’芪合酶基因VqSTS11和VqSTS23的开放阅读框，并构建过表达载体；通过器官发生途径诱导不抗白粉病的欧洲葡萄‘无核白’分生愈伤组织并采用农杆菌介导法对其进行转化；经过PCR检测和Western blot鉴定，获得了5株VqSTS11超量表达植株和3株VqSTS23超量表达植株；人工接种白粉菌发现，转基因植株中白粉菌菌丝生长速度慢，孢子萌发受到一定的抑制，并且转基因植株中芪合酶基因相对表达量升高，抗病相关基因表达上调，芪类物质含量积累增多。本研究结果进一步证明中国野生毛葡萄‘丹凤–2’芪合酶基因VqSTS11和VqSTS23对白粉菌具有抗性，‘丹凤–2’可以为改良欧洲葡萄品种抗病性提供抗病基因，作为抗病育种的资源。     

柑橘响应溃疡病菌转录因子基因CsAP2-09的克隆与功能分析

对柑橘中AP2转录因子进行注释,并克隆柑橘溃疡病相关的Cs AP2-09,研究外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利、机械损伤以及溃疡病菌对该基因的诱导表达,确定其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库一共注释出12个AP2成员,据系统发育和结构可以将其分为4个亚类;可能与抗、感溃疡病相关的Cs AP2-09基因全长4 159 bp,开放阅读框1 467 bp,编码488个氨基酸,具有典型的AP2结构,同时也具有一些结构特殊性;该基因在细胞核中优势表达,与定位信号预测结果吻合;上游启动子元件含多个与植物逆境或激素应答相关的顺式作用元件,如BOX-W1、CGTCA-motif、TCA-element、WUN-motif等;诱导结果表明Cs AP2-09对外源水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯利及机械损伤均有响应;柑橘溃疡病菌侵染可诱导抗病品种四季橘中此基因明显上调表达,而在感病品种纽荷尔中变化趋势不显著。上述研究表明Cs AP2-09是一个响应溃疡病菌侵染的,可作为研究柑橘抗溃疡病的候选基因。目前已将其在锦橙中超表达,共筛选出8个转基因植株,后期将对其进行抗病性评价以确定其分子育种价值。     

'白核'龙眼种子败育不同时期差异蛋白分析

以'白核'龙眼种子为试验材料,比较两种蛋白质的提取方法,确定了酚抽法提取龙眼种子蛋白.应用蛋白质组学研究技术,分析了龙眼种子败育4个不同时期的蛋白质组变化,共发现21个差异蛋白,其中9个上调表达,12个下调表达.通过MALDI/TOF/TOF-MS/MS质谱分析和蛋白质数据库检索,共鉴定出12个差异蛋白,分别为胞质苹果酸脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、磷酸甘油酸变位酶、RuBisCO大亚基结合蛋白α、β亚基、17 kD HSP、抗坏血酸过氧化物酶、胞质抗坏血酸过氧化物酶、半胱氨酸蛋白酶、Dessication-related protein以及两个未知蛋白.这些鉴定出的差异蛋白质与能量和物质代谢、分子伴侣功能、自由基清除和抗氧化作用、细胞凋亡等生理过程密切相关,可能参与了龙眼种子败育过程.     

甜橙SWEET2a促进柑橘溃疡病菌侵染

柑橘溃疡病菌（Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc）侵染感病种质冰糖橙叶片后，在侵染部位形成典型的火山口凸起症状，但在抗病种质枸橼C-05叶片侵染部位呈现逐渐褐色坏死，未形成溃疡病典型症状。基于前期冰糖橙和枸橼C-05叶片接种Xcc的转录组测序结果，分析鉴定的20个甜橙SWEET受Xcc诱导表达变化，结果显示SWEET2a和SWEET17d在冰糖橙中受Xcc诱导上调表达，SWEET12b在枸橼C-05中受Xcc诱导上调表达；实时荧光定量PCR验证，SWEET2a在冰糖橙叶片中受Xcc诱导高表达而在枸橼C-05叶片中表达变化不显著；SWEET2a在不同柑橘种质同源基因编码的氨基酸序列相似性为94.6%，其启动子顺式作用元件在冰糖橙和枸橼C-05中的种类和数量存在较大差异。冰糖橙和枸橼C-05叶片瞬时过表达结果显示，SWEET2a促进Xcc的繁殖，且拟南芥过表达转基因株系接种毒性菌Pst.DC3000(Pseudomonas syringae tomato DC3000)后，单位叶面积菌含量显著高于野生型。SWEET2a蛋白部分定位于质膜，表明SWEET2a...     

产酶溶杆菌LE16对采后柑橘青霉绿霉病的防治作用

为了防治采后柑橘青霉（Penicillium italicum）和绿霉（P. digitatum）引起的果实腐烂，以自主分离的产酶溶杆菌新株Lysobacter enzymogenes LE16为对象，研究其自溶发酵液和所产生的挥发性物质对青霉和绿霉菌丝生长及孢子萌发的抑制作用；利用液相色谱—质谱联用（LiquidChromatographMass Spectrometer,LC–MS）检测分析LE16发酵液的抗菌成分；通过果实创伤接种和商品化保鲜试验，明确菌株LE16对青霉和绿霉的防治效果。结果显示：在纯培养试验中，LE16显著抑制青霉和绿霉菌丝生长，其发酵液固形物和其产生的挥发性物质最大抑制率为100%和77.52%～91.11%；其发酵液固形物使病菌孢子的萌发率降低96%以上，使病菌菌丝空泡化和扭曲畸形。经80、90和100℃高温加热30min后，对青霉和绿霉菌丝生长的抑制效果与常温处理（28℃）无显著差异。LC–MS分析结果表明，菌株LE16可产生大量次级代谢产物，其中包括肉桂醛、肉桂酸、月桂酸和γ–丁内酯等抗菌化合物。在创伤接种青霉试验中，LE16发酵液处理的柑橘果皮中超氧化...     

柑橘CsNCED3-2的克隆及其响应溃疡病菌侵染的表达分析

柑橘溃疡病是世界柑橘的一种重要病害，对柑橘产业造成严重的经济损失。对柑橘中9–顺式–环氧类胡萝卜素双加氧酶（NCED）基因家族进行注释，并克隆出受柑橘溃疡病菌诱导表达的CsNCED3-2，确定了其表达模式。从柑橘全基因组公共数据库共注释出14个NCED基因家族成员，根据系统发育树和功能结构域将其分为4个亚类；CsNCED3-2其序列全长2 377 bp，开放阅读框1 830 bp，编码609个氨基酸，属于RPE65超家族成员和类胡萝卜素双加氧酶家族成员，是非分泌性蛋白；在‘晚锦橙’和‘金弹’叶片注射溃疡病菌后的各个时间点，‘晚锦橙’叶片中CsNCED3-2的相对表达量总体高于‘金弹’，并且两品种的相对表达变化呈相反趋势；与茎、叶和种子相比，CsNCED3-2在两品种果皮中表达量较高；两品种的CsNCED3-2上游启动子均含有参与植物激素和逆境应答相关的顺式作用元件ABRE（脱落酸响应）、TCA-element（水杨酸响应）、MYC/MYB（干旱响应）等，但数量和类型存在差异。     

GMPase超表达对番茄植株抗坏血酸含量及耐冷性相关生理指标的影响

 采用农杆菌介导法获得了GDP–D–甘露糖焦磷酸化酶基因（GMPase）超表达的转基因番茄植株,并且采用Western blot检测到有两株GMPase蛋白表达显著增加。比较了这两个株系和野生型植株中抗坏血酸含量及耐低温能力。与野生型番茄相比,GMPase超表达在常温及低温胁迫下均使GMPase活性提高,使AsA和DHA含量显著增加,降低了低温胁迫下膜脂过氧化产物MDA的积累。     

R2R3-MYB转录因子CitMYB21对柑橘类黄酮生物合成的影响

以‘巴西酸橙’（Citrus aurantium L.）、‘本地早橘’（C. reticulata Blanco）、‘桂花蒂南丰蜜橘’（C. reticulata Blanco）、‘北碚447锦橙’[C. sinensis(L.)Osbeck]等30份柑橘种质为试材，挖掘与柑橘类黄酮生物合成相关的R2R3-MYB转录因子。通过比较转录组分析发现ERF、MYB以及Dof转录因子家族与果实发育过程中类黄酮的代谢密切相关，其中两个R2R3-MYB转录因子基因CitMYB21(Ciclev10021699m)和CitMYB33(Ciclev10012152m)的表达水平与类黄酮生物合成途径中的关键结构基因CitCHS2的表达量明显负相关。系统发育分析显示，这两个基因分别属于R2R3-MYB中的第2和第1亚族。从‘北碚447锦橙’中克隆得到了CitMYB21编码区的全长序列，共804 bp，编码267个氨基酸。CitMYB21的表达有显著的组织特异性及明显的种质特异性，并与类黄酮的含量呈显著负相关。CitMYB21沉默的柑橘植株叶片中类黄酮含量显著增加，而瞬时过表达的果皮中类黄酮的含量明显降低。...     

应用2D-DIGE技术分析柑橘衰退病毒诱导的甜橙差异表达蛋白

【目的】为了研究柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)诱导甜橙差异表达蛋白的分离和鉴定,【方法】以接种了CTV的甜橙植株为实验组,健康植株为对照组,利用双向荧光差异凝胶电泳(2D-DIGE)技术分析CTV诱导的甜橙差异表达蛋白。【结果】以t检验P<0.05和相对表达量≥1.5的水平作为判别标准,获得了91个CTV诱导的差异表达蛋白点,在实验组中含量高于对照组的蛋白56个,含量低于对照组的蛋白35个。通过MALDI-TOF质谱分析成功鉴定从中选择的37个蛋白点,其中19个蛋白功能明确,16个为预测或假定具有某种蛋白功能,包括与抗氧化相关的硫氧还蛋白、铁氧还蛋白、超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化酶,与代谢相关的磷酸甘油酸酯水解酶、木葡聚糖内糖基转移酶、变味蛋白,分子伴侣热激蛋白,折叠酶肽酰脯氨酰顺反式异构酶,以及与光合代谢相关的蛋白等。【结论】CTV的侵染影响到甜橙各种复杂的生物学过程。     

柑橘中黄龙病菌效应子SDE70的表达特征及寄主互作蛋白解析

柑橘黄龙病菌主要致病种亚洲种（‘Candidatus Liberibacter asiaticus’，Las）具有完整的Sec依赖型分泌系统，可分泌致病因子（效应子）作用于寄主靶标蛋白或基因，调控寄主的抗（感）病反应。为了研究黄龙病菌Sec依赖型效应子在柑橘中的致病机理及其寄主靶标基因，本研究中从感病‘锦橙’中克隆了Las病原菌Sec依赖型效应子基因SDE70（CLIBASIA_02470）。生物信息分析显示，SDE70蛋白全长132个氨基酸，N端20个氨基酸为典型信号肽。大肠杆菌碱性磷酸酶活性分析显示，该信号肽具有胞外分泌功能。亚细胞定位显示，SDE70::GFP融合蛋白在洋葱细胞质和细胞核中积累。定量PCR分析发现，耐黄龙病酸柚显症叶脉中SDE70表达量显著低于未显症叶脉，相反，易感黄龙病‘锦橙’显症叶脉中表达显著高于未显症叶脉；‘锦橙’根中SDE70表达量显著高于叶脉，而幼叶叶脉中显著低于老叶。SDE70在不同品种不同症状发育时期以及不同组织中表达差异显著。利用酵母双杂交试验筛选获得26个与SDE70互作的柑橘蛋白。GO富集分析表明，42.3%的蛋白质与细胞内生物合成过程有关；65.4%的靶标蛋白位于细胞质或质膜上；34.6%的靶标蛋白具有核糖核苷酸结合的分子功能。进一步酵母点对点杂交试验验证3个与SDE70效应子强相互作用的靶标蛋白（CsTRAPP、CsARF、CsRub1），其主要参与植物囊泡转运、类泛素化等过程，暗示SDE70效应子极有可能调控柑橘信号转导和胞质运输途径影响寄主抗（感）病反应。     

苹果锚蛋白基因ANK家族生物信息学鉴定分析

 利用生物信息学方法对苹果ANK基因家族成员及分类鉴定,同时对其染色体定位、系统进化关系及芯片表达特性进行了分析。苹果MdANK家族包含351个基因,根据蛋白结构域差异分为16个类别,ANK-M类型最为庞大,有143个ANK蛋白;苹果的17条染色体均有ANK家族基因分布,其中第2条染色体上分布最多,有36个ANK基因。MdANK编码的蛋白在72 ~ 2 429个氨基酸范围内,等电点在4.30 ~ 11.13之间。芯片分析发现,在苹果果实成熟时期及砧木接穗互作过程中,多数MdANK基因的表达都有不同程度变化。     

柑橘愈伤组织RNAi沉默CCD1基因对其类胡萝卜素积累的影响

类胡萝卜素裂解双加氧酶（CCD）可催化类胡萝卜素在特定位点氧化裂解生成多种生物活性化合物，其活性差异一定程度上决定了植物体内类胡萝卜素含量和组成变化。为了探讨柑橘中CCD1蛋白对类胡萝卜素积累的影响，从红肉脐橙（Citrus sinensis L. Osbeck）果实中克隆了CCD1 基因，将其特异片段通过重组反应连接到pHGRV 载体中，构建CCD1 的RNA 干扰载体pHGRV-CCD1。利用农杆菌介导的方法将其转入‘国庆1 号’蜜柑、‘伏令夏橙’和‘马叙’葡萄柚愈伤组织中，经PCR 鉴定分别获得6、4、4 个转基因干扰系。3 种柑橘材料转基因干扰系中CCD1 基因的表达水平均较野生型显著下调，其中‘马叙’葡萄柚转基因干扰系Rm2 的表达水平仅为野生型的8.4%，干扰效果最佳。CCD1 转基因干扰系愈伤组织外观多数呈现与野生型对照相近的色泽，仅Rm2 系可见较为明显的颜色变化；综合分析3种柑橘材料转基因前后类胡萝卜素含量变化，发现CCD1 基因抑制表达后，紫黄质、9–顺式–紫黄质的含量均较野生型显著增加，表明其可能是CCD1 在柑橘愈伤组织体内优先选择的裂解底物。     

干旱胁迫下柑橘叶片基因表达谱的cDNA-AFLP 分析

 为分离和鉴定柑橘干旱胁迫应答基因,应用cDNA-AFLP分析技术,以盆栽‘天草’橘橙枳砧嫁接苗为试材,对正常灌水和不同干旱胁迫处理下叶片的基因表达谱进行分析。利用81对引物组合进行扩增,共筛选获得113条差异表达转录衍生片段（TDF）,其中上调表达71条（63%）,下调表达29条（26%）,其余13条（11%）为瞬时表达。选取70个差异表达TDF进行克隆测序,共得到62个有效序列,BLAST结果表明：33个TDF与已知功能基因具较高同源性,功能涉及信号转导、能量代谢、离子通道和蛋白合成等,18个TDF与功能未知基因或假定基因同源性较高,其余11个TDF无同源序列,可能为新的未知功能基因。     

CclSAUR49对柑橘生长及类柠檬苦素代谢的影响

SAUR(Small auxin up-regulated RNA)为植物特有的早期生长素响应基因。为了研究柑橘中CclSAUR49参与调节其类柠檬苦素代谢的功能,用湖北早实枳（Poncirus trifoliata Raf.）的上胚轴进行遗传转化,获得6株Ccl SAUR49的过量表达植株（OE1～OE6）和2株Ccl SAUR49的干扰表达植株（Ri1和Ri2）,观察比较转基因和野生型植株的生长表现,利用电镜扫描和半薄切片分别观察叶片的表皮显微结构和组织结构,并检测了叶片中的生长素和类柠檬苦素含量。6个过量表达植株的形态表现存在差异,其中OE2与野生型相比枝梢增长了23.21%,节间数量增多,叶片长度增加了17.97%;2个干扰表达植株（Ri1和Ri2）枝梢生长量减少23.95%和46.82%;2/3过量表达植株的叶片主叶脉直径增大,而Ri2的减小。6株过量表达植株叶片中Ccl SAUR49的表达水平显著上调,是野生型的2.47～73.29倍,2株干扰表达植株叶片中Ccl SAUR49的表达都受到明显抑制,表达水平为野生型的22.66%和47.22%。转基因植株叶片中CclSAUR...     

北海道黄杨叶片应答低温胁迫的蛋白质组分析

 采用双向电泳的蛋白质组学方法分析了北海道黄杨叶片蛋白质对低温胁迫的应答反应。北海道黄杨植株在室外种植，从2008年10月—2009年2月每月提取叶片总蛋白。在考马斯亮蓝染色的2-DE胶上发现36个表达量显著差异蛋白点，其中通过质谱鉴定出19个蛋白质，包括已知的和新鉴定的低温胁迫相关蛋白质。这些鉴定出的蛋白质涉及多个生理过程，如能量与代谢、调控、防御应答等，同时这些蛋白质的表达模式与生理生化变化模式相一致。