茄无网蚜Acyrthosiphon solani气味结合蛋白OBP7的序列特点及表达谱分析

茄无网蚜以刺吸的方式为害大豆,近年田间调查结果表明其抗药性逐年增强,危害呈上升趋势。为了解茄无网蚜气味结合蛋白的作用机制,寻找新的防治靶标,本研究利用荧光定量PCR和RACE技术克隆了茄无网蚜气味结合蛋白基因Asolobp7(以下均用Asolobp7表示茄无网蚜OBP7基因)(GenBank登录号为KF813022)。并通过荧光定量PCR方法分析茄无网蚜不同发育阶段1、2、3、4龄若虫、无翅成蚜、有翅成蚜和不同组织头部(不含触角)、胸部、腹部、触角、足中Asolobp7在mRNA水平上的相对表达量,同时用DPS进行单因素方差分析。结果表明,Asolobp7基因cDNA序列全长735 bp,编码155个aa,预测分子量为17.52 kD,等电点为8.78,N-末端疏水区包含由31个氨基酸组成的信号肽。荧光定量PCR结果表明,Asolobp7在茄无网蚜的不同组织中均有表达,其中触角组织表达量最高,极显著高于其它组织,头部(不含触角)、足、胸部、腹部、翅表达量相对偏低,其中头部(不含触角)、足差异不显著,胸部、腹部、翅差异不显著;Asolobp7在茄无网蚜的不同发育阶段也均有表达,1、2、3龄和有翅蚜时期表达量偏低且差异不显著,4龄时期有显著增高,无翅成蚜时表达量最高,与其它发育阶段差异极显著。以上结论说明Asolobp7主要表达于茄无网蚜的触角组织中,且在无翅成蚜时期最为活跃。说明Asolobp7与触角所承担的嗅觉行为有着密切联系且在无翅成蚜时期的嗅觉活动中发挥着重要的作用,为寻找新的防治策略奠定了基础。     

灭字脊虎天牛CSP基因的鉴定、表达谱及XquaCSP7基因的功能研究

基于已发表的灭字脊虎天牛Xylotrechus quadripes的触角转录组数据,采用BLAST同源搜索的方法从转录组中一共鉴定到14个CSP基因,所有CSP均具有全长序列、信号肽序列和4个保守的半胱氨酸。序列比对结果表明,灭字脊虎天牛CSP间氨基酸一致性差异较大(12%~73%),平均值为34%;具有C1-X6-C2-X18-C3-X2-C4的半胱氨酸保守模式。进化分析表明,除XquaCSP8和XquaCSP12外,其余XquaCSPs聚类到不同分支。表达谱分析表明,XquaCSP7基因在触角特异表达;XquaCSP4、CSP5、CSP12和CSP14基因在触角高表达;XquaCSP13基因在足特异表达;其余XquaCSPs基因在多个组织中有表达。结合测定结果发现,XquaCSP7与测试的21种寄主气味结合能力均较弱,荧光取代率在4.5%~13.5%之间,其中与苯乙酮的结合能力最强,荧光取代率为13.5%。研究结果可为后续灭字脊虎天牛CSP基因的功能研究奠定基础。     

棉铃虫5-HT1和5-HT2基因的克隆及表达模式分析

5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)是昆虫体内一种重要的生物胺,其通过结合特异性的G蛋白偶联受体在昆虫体内发挥不同的神经调控作用。本研究基于转录组测序数据结合RT-PCR技术鉴定克隆了棉铃虫5-HT受体基因5-HT1和5-HT2,采用生物信息学方法分析其序列特征,利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测了其在幼虫和成虫不同组织内的表达特征。结果显示,棉铃虫体内分别表达5-HT的2类受体基因：5-HT1A、5-HT1B、5-HT2A和5-HT2B。系统进化树分析表明,棉铃虫5-HT受体基因分为3个不同分支,而5-HT1和5-HT2可明显分别分成2个不同分支,各分支均与家蚕和烟草天蛾5-HT相应受体基因具有较高的同源性。RT-qPCR结果显示,在幼虫期,4种5-HT受体基因都在头部显著高表达,成虫期除在脑部高表达外,在触角或腹部也有高表达。其中5-HT1A和5-HT1B在雌成虫触角表达量显著高于雄成虫触角,5-HT1A和5-HT2B在雌成虫腹部表达量显著高于雄成虫腹部,而5-HT1B在雄成虫腹部表达量显著高于雌成虫腹部。以上结果表明5-HT1和5-HT2...     

中红侧沟茧蜂嗅觉受体MmedOr2基因的克隆及组织表达谱

嗅觉在天敌昆虫寻找寄主、躲避敌害、交配、转移等行为中发挥关键作用。嗅觉受体是昆虫嗅觉系统中一类重要的功能蛋白。本文选取从中红侧沟茧蜂触角cDNA文库鉴定一个嗅觉受体基因MmedOr2序列片段,采用RACE技术克隆获得中红侧沟茧蜂嗅觉受体基因MmedOr2的全长序列。通过实时荧光定量PCR解析了该基因在中红侧沟茧蜂不同发育阶段、不同组织部位以及交配前后的转录表达谱。结果表明, MmedOr2在触角中特异性表达,且在雌蜂触角中表达量显著高于雄蜂触角。雌、雄蜂羽化后分别在第3 d和第4 d MmedOr2表达量达到最高,该基因转录表达量达到最高后逐渐下降。另外,交配后雌蜂MmedOr2表达量显著下降。根据以上研究结果,我们推测 MmedOr2可能是性信息素受体,在中红侧沟茧蜂寻找配偶等行为中发挥功能。     

小菜蛾三类主要化感受体基因的虫态、组织和性别表达特异性分析

为明确小菜蛾Plutella xylostella体内主要化感受体的表达分布特性，通过对特定组织转录组数据分析并结合半定量RT-PCR测定，研究小菜蛾气味受体（odorant receptor，OR）、离子型受体（ionotropic receptor，IR）和味觉受体（gustatory receptor，GR）3类化感受体基因在不同虫态、组织及性别中的表达特异性。转录组数据分析结果显示，共有48个OR、8个IR和15个GR基因在被测组织中表达，不同基因呈现不同的组织表达特异性。通过整合基因组和转录组数据分析共获得62个GR基因，其中48个为全长序列；系统进化树分析结果表明，48个全长GR中3个属于CO₂受体，10个属于糖受体，35个属于苦味受体；成虫头（去除触角后）、触角、足、翅、雌成虫产卵器及4龄幼虫头部分别表达19、22、27、21、24和21个GR基因；成虫性别间比较发现，PxylGR2、PxylGR20、PxylGR61基因在雌成虫头部中表达量较高，PxylGR5、PxylGR23、PxylGR34、PxylGR37基因在雌成虫触角中表达量较高，PxylGR37、PxylGR53、PxylGR54基因在雌成虫足中表达量较高，而PxylGR17、PxylGR21和PxylGR22基因在雄性翅中表达量较高。     

基于稻纵卷叶螟触角转录组的羧酸酯酶类气味降解基因CXE66鉴定及其表达谱

为了解稻纵卷叶螟Cnaphalocrocis medinalis气味降解机制,利用稻纵卷叶螟基因组和触角转录组鉴定羧酸酯酶（carboxylesterase,CXE）基因,同时采用同源比对和系统发育进化树对其进行分类,进一步克隆获得稻纵卷叶螟CXE66的全长序列,并采用实时荧光定量PCR分析该基因在各组织中的表达情况。结果显示,共鉴定出触角特异性表达的45个CXE基因,其中新发现29个CXE,分属于CXE八个亚族。触角组织中高表达的CXE66基因开放阅读框长1 605 bp,编码534个氨基酸,且具有典型CXE结构特征,其在稻纵卷叶螟触角、头、胸、腹、足和翅中均有表达,且在触角中表达量最高。表明45个CXE基因可能参与稻纵卷叶螟的气味降解和性信息素降解、有毒物质代谢、蜕皮发育和神经发育等生理生化过程,其中CXE66可能参与酯类植物挥发物的降解。     

双委夜蛾非典型嗅觉受体Orco的克隆、分子特征及表达

为了解新发现的农业害虫双委夜蛾Athetis dissimilis(Hampson)非典型嗅觉受体Orco的分子特征与表达,通过分析转录组数据并利用RT-PCR技术克隆了双委夜蛾Orco基因,并采用实时定量PCR技术研究了该基因的组织表达谱。结果显示,双委夜蛾非典型嗅觉受体Orco基因开放阅读框全长1 422 bp,编码473个氨基酸,经氨基酸结构预测具有7个跨膜区,N端在膜内,C端在膜外;该基因编码的氨基酸序列与其它昆虫Orco序列相似性极高,因此将该基因命名为Adis Orco(Gen Bank登录号:KR632987),此氨基酸序列C末端第6跨膜区和第7跨膜区之间以及第7跨膜区的序列保守性最高;PCR结果显示,Adis Orco主要在成虫触角中表达,且在雄蛾触角中的表达量是雌蛾触角中的4.2倍,在足、翅、下唇须和喙等组织中也有少量表达。     

悬铃木方翅网蝽非典型气味受体基因CcilOrco的克隆与序列分析

为进一步研究悬铃木方翅网蝽Corythucha ciliate嗅觉通讯分子机制和寻求新的悬铃木方翅网蝽防治技术,本研究克隆了悬铃木方翅网蝽的非典型气味受体基因CcilOrco,并对其序列进行生物信息学分析。根据GenBank中已发表的半翅目昆虫非典型气味受体家族基因的氨基酸保守序列设计简并引物,采用RT-PCR方法扩增目的基因,将其克隆至pEASY-Blunt载体并测序。将克隆获得悬铃木方翅网蝽非典型气味受体Orco的cDNA序列命名为CcilOrco(GenBank登录号:MF564288),序列分析结果显示,CcilOrco开放阅读框长1 419bp,编码472个氨基酸。预测其分子量为53.25kD,等电点为6.22,序列中有7个跨膜区,N-端在细胞膜内,C-端在细胞膜外。通过在GenBank中进行序列的同源性比较,该基因与已公布的半翅目昆虫的非典型气味受体基因序列有较高的同源性。克隆所获得的基因属于非典型气味受体家族基因。qPCR结果显示CcilOrco主要在雌雄成虫触角中高表达。     

桃蚜组织蛋白酶基因CTSB-16D和CTSB-348的克隆、表达谱及对不同环境胁迫的响应

为了探索组织蛋白酶基因CTSB-16D和CTSB-348在桃蚜Myzus persicae(Sulzer)响应高低温和UV-B胁迫中的作用, 通过RT-PCR技术克隆了桃蚜CTSB-16D和CTSB-348基因, 利用生物信息学方法分析了它们的序列特征;采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, RT-qPCR)技术检测了2个基因在桃蚜不同发育阶段的相对表达量及经高温、低温和UV-B胁迫不同时长的无翅成虫中的相对表达量。克隆获得了桃蚜CTSB-16D(GenBank登录号:MZ962352)和CTSB-348(GenBank登录号:MZ962353)基因, 序列长度分别为1 096 bp和1 101 bp, 开放阅读框(ORF)分别为1 017 bp和1 023 bp, 分别编码338个和340个氨基酸, 蛋白相对分子量为38.14 kD和37.52 kD, 等电点(pI)为5.46和5.99。系统发育分析表明, 桃蚜CTSB-16D和CTSB-348均与豌豆蚜Acyrthosiphon pisum (XP_003246386.1、NP_001119608.1) CTSB亲缘关系最近。RT-qPCR分析表明, CTSB-16D和CTSB-348在桃蚜不同发育阶段均有表达, 分别在1龄若虫和无翅成虫中的表达量最高。高、低温和UV-B胁迫对CTSB-16D和CTSB-348基因的表达具有明显的诱导作用, 且表达量均随时间的延长呈先上升后下降的趋势;4℃胁迫下, CTSB-16D和CTSB-348表达量均在90 min时达到峰值;36℃胁迫下, CTSB-16D和CTSB-348表达量均在30 min时达到峰值;UV-B胁迫下, CTSB-16D和CTSB-348表达量分别在60 min和120 min时达峰值。桃蚜CTSB-16D和CTSB-348基因在不同发育阶段差异表达, 且响应温度和UV-B的胁迫, 推测两个基因参与桃蚜的生长发育并在桃蚜响应环境胁迫中发挥了重要作用。     

黄野螟化学感受基因的鉴定与分析

昆虫的化学感受系统在昆虫的取食、交配等多种行为中发挥着重要作用。黄野螟Heortia vitessoides是一种寡食性害虫, 幼虫具有聚集性、暴食性等特点, 对土沉香Aquilaria sinensis危害严重。本研究使用高通量测序技术对黄野螟成虫触角和口器的转录组进行了测序, 共鉴定到124个化学感受基因, 包括50个气味受体(odorant receptor, OR)基因, 19个离子型受体(ionotropic receptor, IR)基因, 17个味觉受体(gustatory receptor, GR)基因, 19个气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)基因, 17个化学感受蛋白(chemosensory protein, CSP)基因和2个感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane protein, SNMP)基因。通过系统进化和差异表达分析, 对黄野螟化学感受基因的分化, 以及不同性别、不同组织间的表达差异进行系统性的研究。以气味受体为例, HvitOR42、HvitOR43和HvitOR48聚在传统的性信息素受体(pheromone receptor, PR)分支, 其中HvitOR42和HvitOR43在雄性成虫触角中特异性高表达, 这3个气味受体可能参与识别黄野螟雌性成虫释放的性信息素。此外, HvitOR20在雌性成虫触角中特异性高表达, 可能与雌性成虫交配和产卵等行为相关。本研究为进一步探究黄野螟的化学感受机制提供了分子基础, 为开发以化学生态学为基础的黄野螟绿色害虫防控技术提供了理论依据。     

草地螟触角普通气味结合蛋白基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR结合RACE技术克隆了编码草地螟(Loxostege sticticalis)触角中一种普通气味结合蛋白的基因。序列分析表明,成熟蛋白的序列中含有阅读框序列,推导的氨基酸序列与已报道的11种鳞翅目昆虫普通气味结合蛋白Ⅰ比较,平均相似度在62.3%左右,并拥有气味结合蛋白的典型结构特征。该基因归属于普通气味结合蛋白Ⅰ基因亚族。因此将它命名为LstiGOBP1。     

铜绿丽金龟雌虫触角全长cDNA文库的构建及质量分析

为了研究铜绿丽金龟(Anomala corpulentaMotschulsky)成虫嗅觉相关蛋白的功能,本文以铜绿丽金龟雌成虫触角为原始材料提取总RNA,利用SMART技术构建了铜绿丽金龟雌虫触角全长cDNA文库。经测定,原始文库滴度为6.74×106pfu/mL,扩增后的文库滴度为1.08×1010pfu/mL,文库重组率为98.98%。随机挑取24个单克隆,通过菌液PCR检测得知文库插入片段的大小在0.5~2.0kb之间,片段平均长度为1.0kb左右。经过菌液PCR并测序筛选cDNA文库,本试验获得了两条编码气味结合蛋白的全长基因序列AcorOBP1和AcorOBP2。以上数据表明,已获得高质量的铜绿丽金龟触角全长cDNA文库,并筛选、克隆获得了气味结合蛋白基因序列。这为进一步研究触角内气味结合蛋白的功能奠定了基础。     

斜纹夜蛾化学感受蛋白SlitCSP2的表达模式定位及配体结合特性分析

研究斜纹夜蛾Spodoptera litura化学感受蛋白SlitCSP2的表达模式、组织定位及与配体结合特性,为揭示SlitCSP2在化学通讯中的功能提供理论依据。利用RT-qPCR检测了SlitCSP2在蛹及雌、雄成虫各组织的基因表达水平;Western blot方法检测了SlitCSP2在幼虫期和雄成虫头部、触角和足部的蛋白表达水平;利用免疫组织化学技术对SlitCSP2在幼虫各龄期的分布情况进行定位分析;利用荧光竞争结合试验检测SlitCSP2与13种非挥发性化合物的结合特性。RT-qPCR结果表明,SlitCSP2在3龄幼虫表达量最高,3～6龄表达量逐渐降低;成虫阶段雄成虫足部及胸部和雌成虫头部及翅的表达量最高,且雄成虫头部、足部和胸部的表达量显著高于雌成虫。Western blot结果显示,SlitCSP2在3龄幼虫头部（去触角）的蛋白表达水平较高。免疫组化结果表明,SlitCSP2在幼虫阶段主要分布于头部、口器和胸足;在雄成虫中,SlitCSP2主要分布于足部前跗节和足部外骨骼内侧。荧光竞争结合试验表明,SlitCSP2与单宁（K_i＝1.77）、花青素（K_i＝2.34）和叶酸（K_i＝4.56）有很强的结合能力。本研究明确了SlitCSP2在幼虫各龄期和成虫各组织的表达特征。根据免疫定位及荧光竞争结合试验结果,我们推测SlitCSP2可能在斜纹夜蛾寄主选择和解毒过程中发挥重要作用。     

花椒窄吉丁气味结合蛋白AzanOBP5的克隆与表达

为进一步明确花椒窄吉丁Agrilus zanthoxylumi气味结合蛋白AzanOBP5在昆虫嗅觉识别过程中的功能,基于花椒窄吉丁转录组数据(SUB6796283)利用cDNA末端快速扩增技术对花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP5进行全长克隆并进行生物信息学分析;通过实时荧光定量检测技术测定基因AzanOBP5在成虫不同组织中的表达情况。结果显示,克隆获得基因AzanOBP5全长740bp(GenBank登录号为MT318834),5''端非编码区为172bp,3''端非编码区114bp,开放阅读框453bp,编码150个氨基酸。序列分析表明,AzanOBP5氨基酸序列与苹果小吉丁Agrilus mali AmalOBP5的氨基酸序列一致性最高。成功构建pET-21a-AzanOBP5重组质粒并在大肠杆菌Escherichia coli中表达,经过诱导和纯化条件的优化及Western blot鉴定,得到的融合蛋白His-AzanOBP5大小符合预期。基因AzanOBP5在雌雄成虫的不同组织中均有表达,其中在成虫腹部的表达量最高。表明花椒窄吉丁气味结合蛋白基因AzanOBP5除参与嗅觉识别过程外,还可能具有其他生理功能。