pcDNA3．0—SV40T重组表达质粒的构建及鉴定

选用pGEM-SV40 T质粒经XhoI单阵切获得SV40 T基因片段,并将其插入pcDNA3. 0载体,构建重组质粒pcDNA3.0-SV40T,为建立永生化细胞系奠定基础。结果表明:经醉切鉴定证实,SV40T基因片段已经成功播入载体中.构建的SV40病毒T杭原重组质粒为利用SV4oT杭原进行真核细胞研究提供了稳定、可靠的分子工具。     

牛FSHβ基因真核表达质粒的构建及表达分析

为开发可以体外合成牛促卵泡素(FSH)的表达系统,试验通过基因合成的手段获得牛FSHβ基因的目的片段,并通过酶切及T4 DNA连接酶的作用将FSHβ目的片段构建成pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒,并针对构建的pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒,采用菌液PCR、双酶切的方法对该重组质粒进行鉴定,并进一步利用293T细胞检测该重组质粒的表达情况。结果表明:菌液PCR和双酶切的结果证实了牛FSHβ基因片段插入了重组质粒中;pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒可以在293T细胞中表达出绿色荧光蛋白,而且经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测发现pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组质粒可以在293T细胞中转录并翻译出牛FSHβ基因的蛋白表达产物。说明pcDNA3.1-EGFP-FSHβ重组表达质粒构建成功,并且可以在293T细胞中表达。     

TGEV双基因嵌合表达质粒pVAX—S—N的构建及体外表达

采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒(TGEV)SC-H株S基因5′端主要抗原位点片段和N基因,插入pMD19-T载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒19T-N与19T-S.从T载体上将S、N基因切下,以亚克隆方法插入真核表达载体pVAX1,构建嵌合表达S、N基因的重组质粒pVAX-S-N.对重组质粒PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况.结果表明,重组质粒构建正确且在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光.真核表达质粒pVAX-S-N的成功构建为进一步研究TGEV核酸疫苗奠定了物质基础.     

亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒VP1基因真核表达载体的构建及其免疫活性的初步分析

提取亚洲Ⅰ型口蹄疫病毒总RNA，用特异性引物通过RT—PCR反应获得了约750bp的核酸片段，将其与pGEM—T Easy载体连接，并转化大肠埃希氏菌JM109。重组质粒经PCR、酶切鉴定及测序，证明所克隆的片段含有完整的VP1基因；将重组质粒与表达载体pcDNA3．1( )分别用Barn HⅠ和Eco RⅠ双酶切后连接，构建成重组表达质粒，转化宿主菌DH5α，筛选阳性克隆。测序结果证明，目的基因正确插入到表达载体中，命名为pcDNAV；用同样方法将IL-18基因插入pcDNAV中，命名为pcDNAVI。用pcDNAVI免疫豚鼠，2周后加强免疫1次，每周用ELISA检测豚鼠血清中的抗体水平。结果表明，pcDNA VI可引发机体产生体液免疫。     

鸽痘病毒插入载体的构建

经PCR、克隆鉴定、酶切获得PPVZ带有PvuⅡ酶切位点的TK1基因片段。将带有PvuⅡ酶切位点的TK1基因片段与经相同酶切的PUC19载体片段连接,获得重组质粒PUC19-Z。用限制性内切酶NcoⅠ对阳性重组质粒PUC19-Z进行单酶切(TK基因内存在一个NcoⅠ位点),经PCR、克隆鉴定、酶切获得质粒pGJP-5带有NcoⅠ酶切位点的P7.5基因片段,将此片段与经同样酶切的PUC19-Z连接,经酶切和PCR鉴定,筛选出正向插入的重组质粒即为鸽痘病毒插入载体。     

腐蹄病C型节瘤拟杆菌纤毛蛋白基因的克隆与表达载体的构建

用PCR技术从腐蹄病C型节瘤拟杆菌克隆出具有免疫保护性抗原0.85kb纤毛蛋白基因（pili基因），利用该基因构建了纤毛蛋白基因表达载体。提取C型节瘤拟杆菌染色体DNA；用所设计的专一性引物进行PCR，扩增出pili基因；将pili基因克隆于TE载体，TE－pili重组质粒pili基因序列测定结果正确，用EcoRI酶切，低熔点胶回收pili基因片段，经klenow补平后，用T4DNA连接酶将其与中间载体pPLλ连接，将pili基因克隆于pPLλ载体，经BamHI、BamHI HindⅢ、Dral酶切鉴定pili基因正向插入pPLλ载体；扩增pPLλ-pili重组质粒，用BamHI酶切出2.1kb大小片段，回收后，与PME290表达质粒连接，转化宿主细胞PAK／2pfs中，对获得的重组质粒用BamHI酶切，出现2.1kb大小的带,证明含有目的基因。     

禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因真核、表达载体的构建

应用限制性内切酶BαmHⅠ将片段ompH从重组质粒pMDT—ompH切下，非定向插入真核表达质粒pcDNA3中，经酶切分析、PCR鉴定及序列测定，证实成功构建了禽多杀性巴氏杆菌C48-1外膜蛋白H基因的重组真核表达质粒pcDNA3-omp H。将重组表达质粒转染至COS7细胞，经RT—PCR、SDS-PAGE及Western-blotting检测，证明了外膜蛋白H基因获得了瞬时表达。     

PEDV和TGEV双基因共表达载体pVAXD-PS1-TS的构建及体外表达

采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒（TGEV）SC-H株S基因N端主要抗原位点片段（大小约为1 916bp）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）SC-L株S1基因（大小约为2 367bp）,插入pMDl9-T simple载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒pMD19-T-TS与pMD19-T-PS1。从T载体上将PS1、TS基因切下,以亚克隆方法插入双启动子真核表达载体pVAXD,构建能同时表达TGEV S基因和PEDV S1基因的重组质粒pVAXD-PS1-TS。对重组质粒进行PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果表明,重组质粒构建正确且能够在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光。真核表达质粒pVAXD-PS1-TS的成功构建为进一步研究PEDV和TGEV的二联核酸疫苗奠定了基础。     

伪狂犬病病毒Fa株gp63（gⅠ）基因转移载体质粒的构建

用限制性核酸内切酶Sall酶切已缺失gⅠ（gE）和部分gp63(gⅠ)的重组质粒PPB7－1DNA后。回收大小约6.0kb片段，经T4DNA连接酶接后转化入大肠杆菌DH5α株，得到含gp63片段的转移载体质粒PP63，再以SV40早期启动子控制的大肠杆菌β－半乳糖苷酶（LacZ）基因作为报告基因，将其手稿P63中gp63基因起始密码子ATG下游的StuⅠ位点，在选择培养基中筛选出表达β－半乳糖苷酶的转化子，构建了以gp63为同源序列含LacZ报告基因的转移载体质粒，命名为PP63LacZ。在该转移载体质粒中，LacZ基因的两端分别与0.3kb和0.5kb的PRV gp63同源序列相连，经酶切、核酸分子杂交技术鉴定，结果表明该转移载体质粒的构建是成功的。     

伪狂犬病病毒通用转移载体的构建及应用

将来自质粒pFSV40的300bpBamHI/PstI片段[其中含有SV40poly(A)和部分多克隆位点]插入到质粒pUSK相应的酶切位点中，获得重组质粒USKSV40。该重组质粒中gG基因5’端编码区缺失了428bp。将来自质粒pcDNA3.1( )的946bpBglⅡEcoRI片段（其中含CMV启动子及部分多克隆位点）插入到质粒pUSKSV40的BamHIEcoRI位点，构建了通用载体pPRVCMV-uni，其中含有CMV启动子，SV40poly(A)以及NheI,Pme1,BamHI,BstXI,EcoRI,StuI,XbaI等7个单一克隆位点，将eGFP基因插入到该通用载体的BamHI和EcoRI之间，用所获得的转移载体与TK/gG-/LacZ^ PRV基因组共转染PK-15细胞，经检测eGFP基因在重组伪狂犬病病毒中获得表达，从而证实该通用载体的构建是可行的。本研究研制以伪狂犬病病毒为载体的二价或多价基因工程疫苗奠定了物质基础。     

弓形虫GJS株pcDNA3-MIC3核酸疫苗的研究

根据GenBank中MIC3基因序列设计1对引物,采用PCR技术从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增微线体蛋白3(MIC3)基因片段,克隆到pMD18-T载体,经PCR、酶切及测序鉴定后,阳性重组质粒酶切并亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+)后进行PCR、酶切及测序鉴定.重组质粒pcDNA3-MIC3肌肉注射免疫BALB/c小鼠,通过ELISA检测血清特异抗体;经腹腔攻击感染弓形虫GJS株速殖子,观察小鼠的生存时间.结果成功构建了pcD-NA3-MIC3质粒;免疫组小鼠血清检测到特异性抗体;攻击感染后免疫组小鼠平均存活时间较对照组明显延长.表明该核酸疫苗具有较好的免疫原性,能诱导小鼠产生良好的免疫保护作用.     

日本乙型脑炎病毒SA14-14-2株NS1-Flag蛋白在293T细胞中的表达

通过RT-PCR方法扩增出日本乙型脑炎病毒SA14-14-2株的NS1基因,利用Hind Ⅲ和Hpa Ⅰ双酶切克隆到带有Flag标签的pcDNA3.1载体上,重组质粒命名为pcDNA3.1-NS1-Flag。脂质体法转染293T细胞后,经间接免疫荧光(IFA)和化学荧光Western blotting检测,证明带有Flag标签的NS1基因在293T细胞中得到高效表达。     

竞争RT-PCR方法检测奶牛肝载脂蛋白E基因mRNA变化的内参构建

构建定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）的内参标准，用以检测围产期奶牛肝脂代谢过程中ApoE基因mRNA表达的变化情况。应用限制性内切酶ApaI消化重组质粒PMD—ApoE757使其缺失3个小片段。然后再回收较大的片段和酶切后的PMD—ApoE757线性片段，回收的两个片段用T4连接酶连接后，成功构建了PMD—ApoE487重组质粒。     

H7亚型禽流感病毒血凝素基因的真核表达载体的构建及鉴定

参考已发表的H7亚型禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)基因序列设计引物,以pUCH7为模板,经PCR扩增出一条1.7kb的HA全基因片段,将该片段定向克隆到真核表达质粒载体pcDNA3.1(一)中,转化大肠埃希氏菌DH5α,小量制备重组质粒pcDNA-HA,酶切鉴定正确后,转染COS-1细胞,经免疫荧光鉴定其体外表达情况。结果表明H7亚型AIV HA在COS-1细胞中获得了成功表达。用该重组质粒pcDNA-HA免疫BALB／C小鼠,制备免疫血清,经免疫印迹实验证实该H7亚型AIV HA在小鼠体内也得到了良好的表达。     

鹅细小病毒延边株VP1基因真核表达质粒构建及其在Vero细胞中的表达

根据GenBank已发表的鹅细小病毒(GPV)B株基因序列,设计并合成1对含有Xho I和BamH I酶切位点的特异性引物,以提取的GPV基因组DNA为模板,经PCR扩增得到了1 163 bp的目的片段,并将该片段克隆至pMD-18T simple载体中,再将其亚克隆至真核表达载体pVAX1中,构建重组表达质粒pVAX1-VP1。经PCR鉴定、酶切分析和序列测定比较,证实了重组质粒的正确性。通过脂质体法将pVAX1-VP1转染Vero细胞,经间接荧光抗体检测,在Vero细胞表面可见特异性荧光。经RT-PCR扩增得1 163 bp的目的片段。该研究为GPV核酸疫苗的研制奠定了基础。     

湖羊MyoG基因CDS的克隆及其真核表达载体的构建

参阅GenBank发表的波尔山羊肌细胞生成素(MyoG)基因序列,设计3对具有互补末端的特异性引物,分别扩增出湖羊MyoG基因的3个外显子,利用重叠PCR技术,将此3个外显子连接,并构建成重组质粒pcDNA3.0-MyoG,转染NIH-3T3细胞,RT-PCR鉴定。结果表明:成功克隆了湖羊MyoG基因的CDS,在离体细胞中MyoG基因发生了转录,这为进一步研究MyoG基因的体内外表达及生物学的活性奠定了基础。     

鸡α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ基因的克隆和真核表达载体的构建

试验利用Trizol法从鸡肠道组织提取总RNA,采用特异性引物通过RT-PCR扩增出α-2,3-唾液酸转移酶Ⅰ(α-2,3-sialyltransferaseⅠ,ST3GALⅠ)基因的cDNA片段,并将其克隆至pGEM-T easy载体,获得阳性重组质粒,再以阳性重组质粒为模板亚克隆ST3GALⅠ基因的完整ORF区,定向插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上,进行PCR、限制性酶切和DNA序列分析鉴定。结果表明,ST3GALⅠ基因全长1029 bp,测序结果同GenBank数据库收录的序列一致,无任何密码子缺失与突变,插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)上的目的基因大小方向均正确。本研究成功构建了pcDNA3.1(+)-ST3GALⅠ真核表达载体,为下一步的真核表达及对ST3GALⅠ基因的功能研究奠定了基础。     

伪狂犬病病毒Min-A株gD基因的克隆及其真核表达质粒的构建

参考GeneBank收录的伪狂犬病病毒gD基因的序列设计了一对引物,对PRV Min-A株进行了PCR扩增,扩增产物克隆于pGEM-T Easy载体.对重组质粒PGTE-gD进行限制性内切酶分析和基因测序,证实了克隆片段的可靠性.测序结果表明目的片段包含一个1203bp的开放性阅读框(ORF),编码400个氨基酸组成的多肽.将gD基因亚克隆至真核表达载体pcDVA3.1-的CMV启动子下游,构建了真核表达质粒pcDNA-gD,为下一步基因免疫奠定了基础.     

人血小板生成素基因的克隆及CHO稳定细胞系的建立

 以人肝cDNA为模板克隆了人血小板生成素（Human Thrombopoietin,hTPO）基因,利用基因重组技术构建了带有新霉素抗性基因（neo）筛选标记的pcDNA3.1(+)-hTPO真核表达载体,将重组质粒瞬时转染293T细胞,用鼠抗人TPO 单抗Western blot 检测 TPO蛋白的瞬时表达;再将重组质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(Chinese Hamster Ovary,CHO),应用400 μg/mL的G418筛选克隆,经PCR及Western blot验证,获得了3株hTPO蛋白表达水平不同的CHO细胞系,为获得大量蛋白并进行活性功能试验及临床应用奠定基础。