CSFV和PRRSV二联RT-PCR检测方法的建立

参照GenBank中猪瘟病毒(CSFV)和猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)基因保守序列,设计2对特异引物,通过对最佳反应条件的优化,建立了CSFV和PRRSV的二联RT-PCR检测方法,该方法可同时扩增得到2条与试验设计相符的443 bp(CSFV)和246 bp(PRRSV)特异性条带。应用该二联RT-PCR方法检测猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)结果均为阴性,证明该方法有良好的特异性。将已知阳性病毒PCR模板最高稀释倍数作为PCR的敏感度,结果表明该二联RT-PCR体系扩增的敏感度为10-3,可对CSFV和PRRSV单个或混合感染的临床样品进行快速鉴别诊断。     

应用RT-PCR技术快速检测鸭Ⅰ型病毒性肝炎

根据Genbank收录的Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)的VP1基因保守序列,设计合成特异性引物,建立了检测DHV-Ⅰ的RT-PCR方法,并确定了该方法的特异性与灵敏性;对DHV-Ⅰ分离毒株进行RT-PCR检测均得到阳性扩增结果,而作为阴性对照的常见4种鸭病病原如鸭瘟病毒、番鸭细小病毒、番鸭呼肠孤病毒、鹅副粘病毒均未成功扩增;对DHV-Ⅰ临床病料进行RT-PCR检测,检测结果与病毒分离结果一致。结果表明,建立的DHV-Ⅰ的RT-PCR技术具有快速、特异、灵敏的特点。     

快速检测牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR技术建立及应用

以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的保守基因序列为参考.设计、优化出一对特异的PCR引物和一奈TaqMan荧光探针,建立一种快速定量检测牛病毒性腹泻病毒的实时荧光定量PCR技术.该方法检测灵敏度比RT-PCR高100倍,并且避免了常规PCR电泳检测所带来的高污染率.因此.该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好和能定量检测等优...     

牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速诊断牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)病的方法,根据GenBank中登录的IBRV保守基因gB序列,利用分子生物学软件Primer5.0设计1对特异引物,优化反应体系后,建立了IBRV PCR检测方法。特异性试验结果显示该方法可从IBRV DQ株中扩增出398 bp的特异性片段,而对牛呼吸道合胞体病毒、牛副流感病毒、MDBK细胞的扩增结果均为阴性。该方法检测IBRV的敏感性可达10-3 TCID50·mL-1。应用建立的PCR方法能够从发病的临床样品中检测出IBRV且比病毒分离方法更为敏感,操作简便。结果表明建立的PCR方法具有特异、敏感、快速的特点,可用于IBRV的临床检测。     

鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒三重RT PCR检测方法的建立

为建立可同时鉴别检测鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒的三重RT-PCR方法,根据基因库中鸭Ⅰ型肝炎病毒、番鸭细小病毒和鸭圆环病毒的基因序列,分别设计3对特异性引物,通过三重RT-PCR扩增条件优化、敏感性和特异性试验,建立了鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒三重RT-PCR方法。使用该方法对同一样品中的鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒模板进行扩增,结果均得到与试验设计相符的202bp(鸭Ⅰ型肝炎病毒),351bp(鸭圆环病毒)和474bp(番鸭细小病毒)的特异性扩增条带,对小鸭温病毒、鸭副粘病毒、鸭瘟病毒和禽流感病毒等病原体的检测全为阴性。敏感性试验结果表明,该方法最低能检测到1pg的鸭Ⅰ型肝炎病毒RNA、鸭圆环病毒和番鸭细小病毒DNA。建立的鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒及番鸭细小病毒的三重RT-PCR方法,具有快速、敏感、特异、定量和重复性好等优点,可用于临床鸭Ⅰ型肝炎病毒、鸭圆环病毒及番鸭细小病毒感染的检测。     

伊犁河谷地区牛病毒性腹泻病毒基因型鉴定与分析

为摸清伊犁河谷地区牛场牛病毒性腹泻病毒(BVDV)感染的病毒基因型,利用BVDV基因组5′端非翻译区(5′-UTR)通用型引物,采用一步法RT-PCR对疑似感染样品进行基因扩增、序列测定与比对分析以及遗传进化树构建.结果显示:12份疑似样品中,有1份样品PCR扩增结果呈阳性,基因型鉴定为BVDV2型.该研究表明伊犁河谷规模化牛场内存在BVDV2型感染,为该地区规模化牛场病毒性腹泻病的防控提供了理论依据.     

牛病毒性腹泻病毒RT—PCR检测方法研究

【目的】建立快速、简便、特异的检测牛病毒性腹泻病毒抗原的RT-PCR方法;【方法】根据已发表的牛病毒性腹泻病毒株(BVDV)5’端非编码区保守序列设计合成了两条引物,应用RT-PCR技术对两株BVDV标准株(OregonC24V and NADL)进行基因扩增,对扩增产物进行酶切鉴定。同时设猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK细胞作对照;【结果】两株BVDV标准株均扩增出了长度为325bp的片段,扩增产物经酶切后形成长度为111bp和214bp两条片段,而对猪瘟兔化弱毒疫苗株、轮状病毒株、MDBK正常细胞扩增均为阴性,与预期结果一致。【结论】PCR检测方法可以快速准确地对牛病毒性腹泻-黏膜病作出诊断。该方法的敏感性可高达10-1TCID50。     

口蹄疫O型、A型和AsiaⅠ型病毒RT-PCR分型方法的建立

该研究旨在建立一种快速、灵敏及准确的口蹄疫病毒(FMDV)鉴定与分型的RT-PCR检测技术平台,为临床中有效准确地检测口蹄疫病毒提供有力的支持。根据NCBI中公布的FMDV序列(GenBank:JF749861.1),设计FMDV通用检测引物FP1/FP2;根据NCBI中公布的FMDV O型、A型和Asia Ⅰ型序列,经过序列分析比对后,分别设计FMDV分型引物FO1/FO2、FA1/FA2和FAS1/FAS2。提取FMDVRNA后,利用随机引物扩增得到FMDV全cDNA,利用设计的引物进行PCR扩增及PCR反应条件的优化。结果表明:该研究建立的RT-PCR检测方法具有很好的特异性、敏感性和可重复性。成功建立了FMDV O型、A型和Asia Ⅰ型检测及分型方法,为口蹄疫疾病的临床检测、流行病学相关调查及针对性的疫苗的制备奠定基础     

Ⅰ型鸭病毒性肝炎RT-PCR检测方法研究

根据Ⅰ型鸭病毒性肝炎ZJ/06强毒株的测序结果,在其基因组3D基因区设计合成一对可扩增238 bp的特异性引物,成功的建立了检测DHV-Ⅰ的RT-PCR方法,并确定了其特异性与敏感性,对DHV-Ⅰ分离毒株和临床病料进行RT-PCR检测均得到阳性扩增结果,而作为阴性对照的常见4种鸭病病原:鸭瘟病毒、鸭产蛋综合症病毒、鸭副粘病毒、鸭里默氏杆菌均未扩增到任何片断。利用BHK-21细胞、SPF鸡胚对DHV-Ⅰ临床病料进行病毒分离鉴定,结果表明建立的DHV-Ⅰ的RT-PCR检测方法具有快速、特异、敏感的特点。     

BRSV和BPIV-3双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种快速诊断牛呼吸道合胞体病毒(BRSV),牛副流感病毒3型(BPIV-3)病毒病的方法,根据Genbank中登录的BRSV核衣壳蛋白N基因序列和BPIV-3的核衣壳蛋白N基因序列,利用分子生物学软件Primer5.0设计2对特异引物,经过条件优化,建立了BRSV和BPIV-3的双重PCR检测方法。采用该方法检测BRSV和BPIV-3参考毒株,特异性良好。对参考毒株进行梯度稀释检测,结果该方法检测BRSV的敏感性可达10 TCID50·100μL-1,BPIV-3可达10 TCID50·100μL-1。应用建立的双重PCR方法能够从临床样品中检测出BRSV和BPIV-3。表明建立的双重PCR方法具有特异、敏感、快速的特点,可用于BRSV和BPIV-3的临床检测。